紅霉素對大型溞生殖、生長和基因表達的生態毒理效應

劉建超,馬雨辰,張凌玉,任靜華,李一平,陸光華,*

1 河海大學環境學院,淺水湖泊綜合治理與資源開發教育部重點實驗室,南京 210098 2 江蘇省地質調查研究院,自然資源部(國土)耕地生態監測與修復工程技術創新中心,南京 210018

抗生素在中國廣泛使用并不斷檢出,主要包括磺胺類、四環素類、大環內酯類、喹諾酮類和β內酰胺類。紅霉素(ERM)作為一種大環內酯類抗生素,在中國江河湖泊及海域中檢出頻率和檢出濃度相對偏高[1]。中國海河中ERM最高達到4200 ng/L[2],遼河最高達到2834 ng/L[3],香港污水處理廠尾水中達到3150 ng/L[4]。基于ERM的急性基準值(0.47 μg/L)和慢性基準值(0.10 μg/L),通過生態風險評估發現中國遼河、海河和珠江流域水體中ERM暴露風險需要關注,風險熵值在0.17—10.1之間[5]。在中國53種用量較大抗生素風險評估中,ERM是排在前10的優先關注高風險抗生素[6]。研究發現ERM對浮游動物會產生影響,比如ERM會抑制多刺裸腹溞(Moinamacrocopa)的生長發育,造成氧化損傷,影響種群穩定[7]。對于藻類,ERM的暴露也會導致一系列的毒性效應。比如當ERM暴露濃度 ≥0.1 μg/L時,水華微囊藻(Microcystisflos-aquae)體內丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)含量會顯著升高[8]。ERM暴露濃度為10 μg/L時,微囊藻細胞內的超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性均顯著增強[9],影響細胞膜的通透性,造成氧化性損傷,并產生脂質過氧化物信號分子,導致細胞功能障礙和死亡[8]。由此可見,ERM長期暴露的潛在生態風險不容忽視。

為了揭示ERM長期暴露對水生生物的生態毒理效應,本實驗選取標準模式生物大型溞作為受試生物,以ERM急性毒性實驗結果中96 h-LC50的0.01‰和1‰為暴露濃度,分析ERM對大型溞生長發育、生殖和游泳等生態行為學指標的影響,測試大型溞抗氧化系統和神經系統酶活性變化及生長繁殖代謝相關基因表達,分析ERM對大型溞脂質代謝系統的影響,以期為ERM的毒理效應和污染防控提供借鑒。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

紅霉素(ERM, CAS: 114-07- 8)購買于百靈威科技有限公司；色譜級甲醇、乙醇、乙腈購買于Merk化工技術有限公司；受試生物大型溞(Daphniamagna)由中國科學院水生生物研究所提供。大型溞在實驗之前馴化兩周,馴化條件為：水溫(21±1)℃,光暗周期16 h∶8 h,光照強度1000 lx,每天定時喂食純種斜生柵藻。

1.2 急性毒性實驗

在預實驗的基礎上設置10、50、100、150、200 mg/L和300 mg/L這6個濃度,同時設置清水空白對照組和溶劑對照組(0.01%乙醇)。在實驗中,往100 mL 燒杯中加入50 mL目標濃度的暴露溶液,每個燒杯加1只健康幼溞(6—24 h),每個濃度設置20個平行。實驗周期為96 h,在試驗期間不進行喂食操作,也不更換暴露溶液。在實驗開始后24、48和96 h,分別觀察和記錄每個燒杯中幼溞死亡的個數。

1.3 慢性毒性實驗

根據急性毒性實驗結果設置了兩個暴露濃度2 μg/L[實測濃度(1.92±0.026)μg/L]、200 μg/L[實測濃度(194.1±5.8)μg/L] 為慢性實驗暴露組,同時設置清水空白對照組和溶劑對照組(0.01%乙醇)。在盛有50 mL暴露溶液的燒杯中隨機放入1只6—24 h的健康幼溞,并設置20個平行。由于抗氧化損傷實驗和熒光定量PCR實驗測定時用溞量偏大,每個暴露組在1000 mL燒杯中加入800 mL暴露溶液,隨機放置150只健康幼溞(6—24 h),設置3個平行,用于相關參數測定。暴露周期為21 d,暴露期間實驗條件維持在(21±1)℃,16:8 h(光:暗),每天喂食斜生柵藻,喂藻密度為5×104個/mL。每兩天換水一次,換水時清洗燒杯。暴露期間記錄各項指標：①母溞的產卵時間；②產卵數量；③21 d時母溞的體長；④21 d時母溞1 min內胸肢、心臟跳動頻率；⑤21 d時連續測定30 s游泳速度。大型溞種群增長、生長、生殖、游泳等行為指標參照張凌玉等[10]的測定方法開展。

暴露21 d結束后,從清水對照、溶劑對照、2 μg/L和200 μg/L的暴露組的每個平行樣品中取出50只大型溞放置在液氮中保存,用于測定超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽硫轉移酶(GST)、乙酰膽堿酯酶(AChE)和丙二醛(MDA)等生物標志物。生物標志物測定前,大型溞先用生理鹽水沖洗,濾紙吸干表面水分,然后加入到已經稱重的離心管中,用電子天平準確稱取大型溞的重量,按重量(g)∶體積(mL)= 1∶9的比例,加入9倍體積的生理鹽水,在冰水浴條件下機械勻漿,勻漿液以2500 r/min轉速離心10 min,取上清液進行測定。抗氧化系統和神經系統酶活性的具體測定步驟參照Wang等[11]和Aksakal[12]的方法進行。

另外,每個實驗組取出50只大型溞,放入液氮中速凍3—5 min,然后放入-80℃冰箱中保存。使用Trizol試劑進行總RNA提取,后用TaKaRa反轉錄試劑盒對總RNA進行逆轉錄合成cDNA,然后進行特異性PCR擴增。目的基因測定引物序列見表1,所有結果用兩個內參基因(actin和gapdh)的mRNA水平和Cq值進行歸一化。

表1 目的基因及引物序列

1.4 統計分析

所有數據結果均采用SPSS Statistics 22.0統計軟件進行單因素方差分析(ANOVA),以均值±標準偏差的形式表示。數據可視化由Origin 2019實現。

2 結果與討論

2.1 半致死濃度

在10—300 mg/L 暴露溶液中,大型溞隨著暴露濃度的增加,死亡率不斷提高。空白對照組和溶劑對照組死亡率<5%,而低濃度組死亡率和對照組相比未見顯著升高。通過使用logistic函數進行非線性回歸計算,ERM對大型溞的48 h-LC50為315.41 mg/L,95%置信區間為247.39—398.11 mg/L,96 h-LC50為163.08 mg/L,95%置信區間為134.89—196.79 mg/L。以前研究發現ERM對大型溞的48 h半致死濃度(48 h-LC50)為211 mg/L[7],對青鳉(Oryziaslatipes)的96 h半致死濃度(96 h-LC50)大于100 mg/L[7],毒性低于大環內酯類抗生素羅紅霉素,羅紅霉素對大型溞的48 h-LC50和96 h-LC50分別為60.26 mg/L和39.81 mg/L[10]。根據化學品分類和標簽規范第28部分：對水生環境的危害(GB 30000.28—2013)的毒性等級劃分[13],ERM對大型溞的急性毒性為低毒。

2.2 對大型溞生殖的影響

ERM對大型溞生殖指標的影響如表2所示,清水對照和溶劑對照組大型溞毒理數據無明顯差異,以下數據分析以溶劑對照組數據作為參照。高低兩個ERM濃度組對大型溞首胎產卵時間、首胎產卵個數均無顯著影響,輕微提升了大型溞的產卵胎數。隨著ERM暴露濃度的增加,大型溞平均每胎產卵數和21 d產卵總數不斷增加,高濃度組增加最為顯著,提升率分別為50.6%和55.6%。從整個暴露過程來看,高低兩個濃度ERM均對大型溞生殖能力產生誘導作用；在ERM污染脅迫下,隨著暴露時間延長,大型溞產生生態補償效應,產卵量有所提升[14],暴露中期產卵量明顯高于前期。

表2 紅霉素(ERM)對大型溞生殖指標的影響

從ERM對大型溞種群增長指標的影響來看(表2),周限增長率在所有暴露組均無顯著變化。高低兩個ERM濃度暴露均顯著提升大型溞的凈生殖率,提升率分別達到69%和97%。高濃度組ERM顯著升高了內稟增長率,這與羅紅霉素慢性暴露的實驗結果類似[10]。ERM、羅紅霉素等抗生素暴露下,會引起大型溞的種群繁殖能力提升,導致生存所需的最低食物水平要求升高,這在食物水平不足時可導致大型溞因饑餓而死亡,并影響壽命[15]。根據衰老的進化理論,過度生殖會消耗身體代謝的資源,最終縮短大型溞壽命和影響種群穩定[16]。 而本實驗僅對大型溞進行21 d慢性暴露實驗,ERM長期暴露對大型溞全生命周期及世代的生殖和種群增長能力的影響仍需深入研究。

2.3 對大型溞生長發育和游泳行為的影響

大型溞心率、胸肢跳動頻率和體長與大型溞攝食、呼吸、代謝和內分泌系統等健康狀況密切相關。從圖1可以看出,高濃度組ERM輕微抑制了大型溞的體長,顯著提高了大型溞胸肢和心臟跳動頻次。高低兩個暴露組ERM均對大型溞游速產生顯著抑制作用,抑制率均超過30%。

圖1 21 d暴露后紅霉素對大型溞的體長、胸肢跳動頻率、心率和游速的影響Fig.1 Effect of ERM on body length, thoracic limb activity, heart rate and swimming speed of Daphnia magna after 21 d exposure*表示處理組與對照組的顯著性差異,P<0.05

圖2 21 d暴露后大型溞的游泳軌跡 Fig.2 Swimming trajectory of Daphnia magna after 21 d exposure

大型溞體長變化是環境脅迫下生物體的一種防御機制,體長的改變雖然小,在實際生態環境中會顯著影響大型溞的種群穩定[17]。前期研究報道400 μg/L硫氰酸紅霉素會抑制大型溞的體長增長[18]。心率是反映污染物對大型溞血液循環系統影響的敏感生理指標[19],心率紊亂說明大型溞器官可能受到損傷,呼吸能力下降[20]。胸肢作為大型溞的攝食器官,受到心臟的能量供給和神經系統調控的雙重作用完成攝食動作。心率過快一定程度上導致供給胸肢的能量過度輸出,損耗身體機能,這與大型溞生長抑制和體長減短的結果相一致。游速常用于表征化學物質的有害影響的敏感可靠性生物指標[21]。大型溞游泳能力不僅在游速方面受到顯著抑制,高低兩個濃度組都顯著降低了大型溞的泳道密度,大型溞的移動范圍變小(圖2),前期研究表明游泳活性的抑制會降低大型溞的生長發育和生殖功能[22]。ERM對大型溞游泳活性產生的抑制作用可能與ERM產生神經毒性相關[21]。

2.4 對大型溞抗氧化和神經系統的影響

為了研究ERM對大型溞抗氧化系統的影響,檢測了大型溞MDA的含量和SOD、GST的酶活性,同時檢測大型溞的AChE活性探究ERM潛在的神經毒性。根據圖3,高濃度ERM暴露顯著增加了大型溞體內MDA含量,誘導量超過2倍。脂質過氧化產物MDA的過量產生將進一步影響SOD和GST酶活性,造成細胞膜損傷[23]。ERM暴露下,高低兩個暴露濃度組大型溞SOD和GST酶活性都明顯降低,高濃度暴露組ERM對SOD和GST的抑制率超過了46%和42%。同時,高低兩個暴露組ERM都抑制了大型溞AChE酶活性,最高濃度抑制率達到39%。

圖3 21 d暴露后紅霉素(ERM)對大型溞酶活性和丙二醛含量的影響Fig.3 Effect of ERM on enzyme activities and malondialdehyde content of Daphnia magna after 21 d exposure

為了抵御ROS的氧化傷害,大型溞體內SOD、CAT、GST和谷胱甘肽(GSH)等活性酶相互協同,形成抗氧化防御體系發揮抗氧化作用。SOD和CAT構成抗氧化系統的第一道防線,SOD能夠歧化超氧化物自由基形成H2O2和O2[24],CAT將H2O2歧化成H2O和O2。CAT含量不足時,GSH可與SOD協同作用,用于清除H2O2,而GSH的降低會進一步影響GST的抗氧化功能[24]。在污染物脅迫作用下,生物體內清除ROS的速率小于ROS累積的速率,過量累積的ROS會對不飽和脂肪酸氧化或者過氧化,生成脂質過氧化產物MDA,生物膜中不飽和脂肪酸減少,膜的流動性降低,通透性變差,導致營養物吸收效率降低,維生素和無機鹽等營養失衡,最終造成生長發育受到抑制,生殖能力和免疫力降低[25—26]。本研究發現,ERM能夠使大型溞MDA含量增加,SOD和GST活性減弱,尤其是高濃度ERM暴露后,大型溞體內產生的過量ROS損害機體健康,抑制抗氧化酶的生成[27],引起細胞膜損傷[11]。

AChE是無脊椎動物體內廣泛存在的一種酶,能夠保證生物神經信號正常傳遞,主要位于膽堿能神經末梢突觸間隙,可通過降解神經遞質乙酰膽堿[28],降低它對乙酰膽堿受體的興奮作用,保證神經傳導。暴露ERM后,大型溞AChE活性受到抑制,酶水解神經遞質乙酰膽堿的能力減弱,導致乙酰膽堿受體過量而無法正常傳遞神經信號[29],最終游速變慢。研究發現AChE活性的抑制和大型溞游泳能力的削弱呈正相關[30]。

2.5 對大型溞基因轉錄的影響

2.5.1對卵黃蛋白相關基因轉錄的影響

圖4 21 d暴露后ERM對大型溞基因相對轉錄量的影響 Fig.4 Effect of ERM on relative gene transcription of Daphnia magna after 21 d exposure

卵黃蛋白(vitellogenin)是胚胎發育的能量儲備和內源性營養的主要來源[31],受雌激素調控[32]。卵黃蛋白vg1有助于卵黃的形成[33],vtg2是卵生動物卵黃蛋白的前體,它們通常被用作雌激素化合物的生物標志物[34]。暴露21 d時,相對于對照組,高濃度組ERM顯著上調了vg1和vtg2表達(圖4),高濃度組vg1表達上調超過了500%,暴露21 d時暴露組大型溞vg1和vtg2相對表達量均為正值(上調)。在秀麗隱桿線蟲成年早期,過量的卵黃蛋白基因轉錄可以確保充分的卵黃蛋白合成能力,以達到最大的生殖率[16]。在大型溞成年早期vg1和vtg2的轉錄水平相對偏高,以滿足生殖需求[16]。有研究結果表明藥物撲熱息痛短期暴露下,大型溞vtg表達隨著暴露時間的延長會顯著提高,在長期暴露撲熱息痛對大型溞雌激素的干擾比短期更強[35]。

2.5.2對保幼激素和蛻皮激素相關基因轉錄的影響

甲殼類動物的生長發育主要受蛻皮激素、保幼激素及ecr受體和usp的轉錄調控[36]。保幼激素調控大型溞卵黃蛋白的形成,對生物的生殖發育發揮作用[36]。jhe是保幼激素的編碼基因。Ecr是負責蛻皮激素合成的基因,ecrb主要參與調節大型溞的蛻皮過程,而蛻皮和大型溞的生長有關[37]。cyp314基因參與主要蛻皮激素的生物合成[38],可以介導蛻皮激素由無活性向活性形態20-HE轉化[39]。從圖4可以看出,高濃度組ERM上調了jhe、ecrb和cyp314基因表達,低濃度組ERM顯著促進了jhe和cyp314基因表達,說明ERM暴露后大型溞的保幼激素和蛻皮激素合成受到促進,導致大型溞的繁殖顯著提升[40]。由于大型溞的蛻皮周期和生殖周期同步,蛻皮激素合成發生變化在一定程度上反映了污染物對大型溞生殖能力的干擾[41]。大型溞蛻皮激素的合成不僅涉及cyp314、ecrb基因的表達,同時還與多種信號通路(如視網膜X受體)有關[42],ERM全生命周期或世代暴露下,大型溞cyp314、Ecr等基因表達與繁殖能力的關系需要進一步研究。

2.5.3對脂質代謝和解毒相關基因轉錄的影響

在無脊椎動物中,hr96是核受體NR1J組中重要的毒物受體[43]。在哺乳動物中,hr96與NR1I(PXR/CAR/VDR)等核受體基因同源,可以調控I和II相解毒基因的表達[35]。hr96還可以調控多個參與脂質吸收的基因,并通過內穩態和運輸三酰基甘油、膽固醇介導能量代謝[36, 44],調節涉及膽固醇和脂肪酸穩態的npc基因組[36]。在大型溞的整個生命周期,脂質代謝進程保障其生存和繁殖,脂質代謝過程如果被破壞,脂肪酸攝取和分解脂質相關的酶受到抑制,會導致生物以脂肪的形式儲存能量,影響健康[45]。P-gp(P-glycoprotein)是一種通過ATP能量協助外源性化合物跨膜轉運的基因,在外源性物質解毒方面起重要作用,生物體的P-gp活性與環境脅迫的抵抗和適應有關,相當于環境和生物組織之間的屏障[42]。P-gp編碼基因是hr96的下游靶基因,它們的表達有一定相似性[35]。從圖4可以看出,高低兩個ERM暴露組都使P-gp的相對表達量降低,高濃度ERM導致hr96表達顯著下調。相似的結果在藥物氟西汀和撲熱息痛暴露中也被發現,50 μg/L濃度暴露下兩種藥物均顯著抑制了hr96基因表達[35,46],解毒系統功能受到抑制會造成氧化損傷[35]。污染脅迫下,hr96和P-gp基因能夠協同CYP450s去除體內的外源性污染物,但長期暴露污染物會引起大型溞解毒系統紊亂。

3 結論

ERM對大型溞的急性毒性為低毒,48 h-LC50和96 h-LC50分為315.41 mg/L和163.08 mg/L。在暴露初期高濃度ERM導致大型溞內稟增長率和生殖能力顯著升高,AChE活性被抑制,大型溞體長變短,心跳和胸肢跳動加快,游速減慢,生長發育受到影響,同時干擾大型溞的脂質代謝,體內MDA含量增加,過多自由基產生導致SOD和GST活性抑制,細胞膜損傷。ERM顯著影響大型溞生殖的相關基因vg1和vtg2表達,上調保幼激素和蛻皮激素相關的基因jhe、ecrb和cyp314表達,下調解毒相關基因hr96和P-gp的表達,最終引起免疫力低下和生長抑制,表明ERM長期暴露影響浮游生物種群穩定和生態系統安全。