miR-30靶向調控Zeb2相關通路抑制膽囊癌細胞EMT進程

唐津天唐潤娟

(1.新疆維吾爾自治區腫瘤醫院肝膽胰外科,烏魯木齊 830000;2.新疆醫科大學第二附屬醫院康復科,烏魯木齊 830000)

膽囊癌(gallbladder carcinoma,GBC)是膽管疾病中最常見和最具侵襲性的惡性腫瘤,該病的全球發病率每年增加[1],患者的5年生存率＜5%[2]。盡管診斷和治療的技術有所進步,但GBC的臨床結果并沒有顯著改善,因為早期轉移和延誤的診斷[3]。手術切除是目前唯一有效的治療方法,因為缺乏能夠減輕或預防GBC轉移的治療方案[4]。因此,闡明介導GBC發生和進展的分子機制具有重要的意義。

微小RNA(microRNA,miRNA)是一類長度約為18～25個核苷酸的小型非編碼RNA分子[5]。作為基因表達的內源性抑制因子,miRNA可以直接與特定目標信使RNA(mRNA)的3’非翻譯區(3’untranslated regions,3’-UTR)結合,以誘導mRNA降解或抑制蛋白質翻譯[6]。因此,這些小分子可以作為腫瘤啟動子或抑制子[7]。在這些miRNA中,位于染色體區域6q13的miR-30已被報道在幾種人類癌癥中失調[8-11]。然而,miR-30在GBC中的具體角色和潛在作用機制仍然未知。

因此,在本研究中,我們探索了miR-30在GBC細胞系中的腫瘤抑制作用和其對上皮間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)進展的影響。我們發現miR-30可能是通過調控E盒結合鋅指蛋白2(zinc finger E-box binding protein 2,Zeb2)介導EMT進程的的關鍵因子。

1 材料和方法

1.1 細胞

人GBC細胞系GBC-SD和NOZ購自中國科學院上海生命科學研究院;正常人膽囊上皮細胞系HGBEC購自美國ATCC細胞庫。GBC-SD和NOZ細胞系在高糖DMEM培養基中培養,HGBEC細胞系在RPMI 1640中培養。培養基均補充10%胎牛血清,細胞系均在37℃和5% CO2的濕潤環境下培養。

1.2 主要試劑與儀器

高糖DMEM培養基(美國Gibco公司);RPMI 1640培養基(美國HyClone公司);胎牛血清(美國Gibco公司);TRIzol試劑(美國Invitrogen公司);miR-X miRNA First-Strand Synthesis逆轉錄試劑盒、miR-X miRNA qRT-PCR SYBR試 劑 盒(美 國Clontech Laboratories公司);pCMV表達載體(上海龍錢生物科技有限公司);Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司);MTT試劑盒(日本Dojindo公司)8 μm小室、Matrigel膠(美國BD Biosciences公司);結晶紫(美國Sigma公司);RIPA蛋白提取試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司);一抗[兔抗E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、β-肌動蛋白(β-actin)和HRP偶聯的二抗(美國Cell Signaling Technology公司)。酶標儀(美國Bio-Rad公司);化學發光系統(美國Millipore公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 RNA寡核苷酸、質粒構建及細胞轉染和分組

合成miRNA模擬物(miR-mimic)以及陰性對照物(miR-NC)購自上海百奧生物技術有限公司。將全長Zeb2 cDNA(GenBank ID號:NM_9839)克隆到pCMV表達載體(Zeb2)中,空載質粒(Vector)用作陰性對照。GBC-SD細胞接種在6孔板中并使用Lipofectamine 2000進行轉染。根據轉染物不同,將細胞分為空白組、miR-30陰性對照組和miR-30轉染組,空白組細胞不給予任何處理,正常培養;miR-30陰性對照組和miR-30轉染組分別轉染miR-30 NC和miR-30 mimic。另將細胞分為miR-30陰性對照組、miR-30轉染組、miR-30轉染+Zeb2陰性對照組和miR-30轉染+Zeb2轉染組,分別轉染miR-30 NC、miR-30 mimic、miR-30 mimic+共表達質粒Zeb2 Vector和miR-30 mimic+共表達質粒Zeb2至GBCSD細胞。miRNA的序列用Primer Premier4.0軟件設計,如下所示:miRNA-NC F: 5’-TCTGAGGCTAA CCACGGTCTGTA-3’和R: 5’-CTGATTAAGTGTCAT ACTCATAC;miR-30 mimic F: 5’-TGTAAACATCC TACACTCTCAGC-3’和R: 5’-CTCGCTTCGGCAGC ACACCGACT-3’。質粒轉染:在每個6孔板中加入2 μg質粒,持續48 h,然后用G418(200 μg/mL)處理細胞。

1.3.2 qRT-PCR

用TRIzol試劑從培養的正常人膽囊上皮細胞系HGBEC及GBC-SD和NOZ細胞系以及空白組、miR-30陰性對照組和miR-30轉染組細胞中提取總RNA,并使用miR-X miRNA First-Strand Synthesis Kit逆轉錄為cDNA。隨后使用miR-X miRNA qRT-PCR SYBR試劑盒通過聚合酶鏈式反應擴增并測量目的RNA表達。核內小RNAU6作為內參。相對RNA表達水平用2-△△CT方法定量。本文所用引物用Primer Premier 4.0軟件設計,序列如下所示:miR-30 F: 5’-CAGCTGCAAACATCCGACTG-3’和R: 5’-GCGACTGTAAACATCCTCGAC-3’;U6 F: 5’-CCCTT CGGGGACATCCGATA-3’和R: 5’-TTTGTGCGTGT CATCCTTGC-3’。

1.3.3 MTT

根據制造商的說明,通過MTT試劑盒評估miR-30陰性對照組和miR-30轉染組細胞增殖,并通過酶標儀在450 nm波長下檢測吸光度。

1.3.4 平板克隆試驗

miR-30陰性對照組和miR-30轉染組細胞接種在6孔板中,培養14 d。用4%多聚甲醛固定細胞并用0.1%結晶紫染色,計算每個細胞系的克隆總數。

1.3.5 細胞遷移

將miR-30陰性對照組和miR-30轉染組細胞接種在無血清培養基中的6孔板中并生長至90%密度,用無菌200 μL移液器尖端在培養皿正中線處垂直劃痕。在劃痕傷口放置后0 h和48 h測量劃痕面積,計算遷移率。

身處于福建教案漩渦中心的艾儒略，是繼利瑪竇之后，最為著名的耶穌會傳教士，他在福建傳教事業的成功不僅應當歸功于耶穌會的“合儒”政策和其過人的學識及宗教獻身精神，更應當功于福建官員和大量底層知識分子和教徒的支持[注]艾儒略在閩交往的人物達到200多人。林金水：《艾儒略與福建士大夫交游表》，《中外關系史論叢》1996年第5輯，第182—203頁。。

1.3.6 細胞侵襲

使用24孔板中的8 μm小室過濾器進行細胞遷移和侵襲測定。miR-30陰性對照組和miR-30轉染組(每毫升3×104個)細胞接種在上室,用Matrigel膠包被。細胞在200 μL無血清培養基中培養。將500 μL補充有10% FBS的培養基加入下室。細胞培養24 h,然后將遷移到下部隔室并粘附膜上的細胞用甲醇固定并用結晶紫染色。對細胞進行拍照,對每個孔中隨機選擇的3個視野中的細胞進行計數。

1.3.7 Western blot

RIPA蛋白提取試劑盒用于提取miR-30陰性對照組、miR-30轉染組、miR-30轉染+Zeb2陰性對照組和miR-30轉染+Zeb2轉染組細胞內總蛋白。等量的細胞蛋白用SDS-PAGE電泳分離,轉移到PVDF膜 上,用 適 當 的 一 抗(兔 抗E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug、Zeb2和β-actin)和HRP偶聯的二抗孵育。化學發光系統用于印跡顯影。

1.4 統計學方法

所有數據均以平均數±標準差(±s)表示,用SPSS 19.0軟件進行分析。兩組之間平均表達水平的差異通過獨立樣本t檢驗進行評估。P＜0.05認為具有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-30在正常和膽囊癌細胞中的表達水平差異

注:1:人膽囊上皮細胞HGBEC;2:人膽囊癌細胞GBC-SD;3:人膽囊癌細胞NOZ。a:空白組;b:miR-30陰性對照組;c:miR-30轉染組。與人膽囊上皮細胞HGBEC相比, *P＜0.05;與miR-30陰性對照組相比, #P＜0.05。圖1 miR-30在正常和膽囊癌細胞中的表達水平差異Note.1, Gallbladder epithelial cells HGBEC.2, Human gallbladder cancer cells GBC-SD.3, Human gallbladder cancer cells NOZ.a, Control group.b, miR-30 negative control group.c, miR-30 transfection group.Compared with the human gallbladder epithelial cell HGBEC, *P＜0.05.Compared with the miR-30 negative control group, #P＜0.05.Figure 1 Difference in the expression level of miR-30 between normal and gallbladder cancer cells

2.2 過表達miR-30可以明顯抑制GBC-SD細胞增殖

通過MTT試驗檢測細胞增殖能力的改變。如圖2所示,同miR-30陰性對照組細胞相比,miR-30轉染組細胞增殖能力明顯抑制(P＜0.05)。

2.3 過表達miR-30可以明顯抑制GBC-SD細胞克隆形成

通過平板克隆試驗檢測細胞增殖數目的改變。如圖3所示,同miR-30陰性對照組的細胞數目相比,miR-30轉染組細胞增殖數目明顯減少(P＜0.05)。

注:與miR-30陰性對照組相比, *P＜0.05。圖2 miR-30和miR-NC對GBC-SD細胞增殖的影響Note.Compared with miR-30 negative control group, *P＜0.05.Figure 2 Effects of miR-30 and miR-NC on the proliferation of GBC-SD cells

注:與miR-30陰性對照組相比, *P＜0.05。圖4 miR-30和miR-NC對GBC-SD細胞遷移能力的影響Note.Compared with miR-30 negative control group, *P＜0.05.Figure 4 Effects of miR-30 and miR-NC on the migratory ability of GBC-SD cells

2.4 過表達miR-30可以明顯抑制GBC-SD細胞遷移能力

通過劃痕試驗檢測細胞遷移能力改變。如圖4所示,同miR-30陰性對照組細胞相比,miR-30轉染組細胞遷移率明顯降低(P＜0.05)。

2.5 過表達miR-30可以明顯抑制GBC-SD細胞侵襲能力

通過TransWell小室試驗檢測細胞遷移能力改變。如圖5所示,同miR-30陰性對照組細胞相比,miR-30轉染組細胞侵襲明顯減少(P＜0.05)。

2.6 過表達miR-30可以明顯抑制GBC-SD細胞EMT進程

為了研究miR-30是否參與了GBC-SD細胞的EMT進程,我們評估了細胞被miR-30或miR-NC處理后的EMT標志物蛋白(E-cadherin、N-cadherin和Vimentin)的表達水平,圖6結果顯示,同miR-30陰性對照組細胞相比,E-cadherin表達水平在轉染miR-30 mimic細胞中顯著升高,而N-cadherin和Vimentin表達水平顯著下降(P＜0.05),EMT相關轉錄因子(Snail、Slug和Zeb2)蛋白水平下調(P＜0.05)。

注:與miR-30陰性對照組相比, *P＜0.05。圖3 miR-30和miR-NC對GBC-SD細胞克隆數目的影響Note.Compared with miR-30 negative control group, *P＜0.05.Figure 3 Effects of miR-30 and miR-NC on the colony number of GBC-SD cell

注:與miR-30陰性對照組相比, *P＜0.05。圖5 miR-30和miR-NC對GBC-SD細胞侵襲能力的影響Note.Compared with miR-30 negative control group, *P＜0.05.Figure 5 Effects of miR-30 and miR-NC on the invasive ability of GBC-SD cells

2.7 過表達Zeb2可以逆轉miR-30導致的EMT抑制作用

為驗證E-cadherin能被EMT相關的轉錄因子Zeb2靶向結合,進行了拯救試驗。共表達質粒Zeb2+miR-30或其陰性對照物Vector+miR-30分別轉染GBC-SD細胞,結果顯示Zeb2可以明顯逆轉miR-30所引起的EMT相關蛋白(E-cadherin、N-cadherin和Vimentin)的表達水平(P＜0.05)(圖7)。

注:a:miR-30陰性對照組;b:miR-30轉染組。與miR-30陰性對照組相比, *P＜0.05。圖6 miR-30和miR-NC對GBC-SD細胞EMT的影響Note.a, miR-30 negative control group.b, miR-30 transfection group.Compared with miR-30 negative control group, *P＜0.05.Figure 6 Effects of miR-30 and miR-NC on the EMT of GBC-SD cells

注:a:miR-30陰性對照組;b:miR-30轉染組;c:miR-30轉染+Zeb2陰性對照組;d:miR-30轉染+Zeb2轉染組。與miR-30陰性對照組相比, *P＜0.05;與miR-30轉染+Zeb2陰性對照組比較, #P＜0.05。圖7 過表達Zeb2對miR-30引起GBC-SD細胞EMT的逆轉作用Note.a, miR-30 negative control group.b, miR-30 transfection group.c, miR-30 transfection+Zeb2 negative control group.d, miR-30 transfection+Zeb2 transfection group.Compared with miR-30 negative control group, *P＜0.05.Compared with miR-30 transfection+Zeb2 negative control group, #P＜0.05.Figure 7 The reversal effect of overexpression of Zeb2 on the EMT of GBC-SD cells caused by miR-30

3 討論

證據表明miRNAs在多種癌癥中失調[12],并作為腫瘤抑制因子或啟動子發揮作用[13]。研究揭示了GBC[14]中的許多miRNA特征,但miRNA在GBC中的發病機制中的確切作用仍不清楚。我們選擇miR-30作為本研究的目標分子,表明了miR-30在GBC的發生和發展中起著重要作用。我們發現與正常膽囊上皮細胞相比,GBC細胞中miR-30的表達顯著下調。miR-30家族的成員包括miR-30b、miR-30c、miR-30d和miR-30e。作為一組腫瘤抑制因子,miR-30家族在許多人類癌癥中被下調,包括結直腸癌[15]、肺癌[16]、甲狀腺癌[17]和胃癌[18]。我們證明miR-30顯著抑制GBC細胞增殖、遷移和侵襲。

EMT是一種生物學過程,通過該過程,上皮細胞失去極性和粘附能力,并獲得間充質細胞的遷移和侵襲特性[19]。EMT在調節許多人類癌癥的腫瘤侵襲和轉移中起關鍵作用[20-21]。miRNA是EMT的關鍵的調節因子[22],通過參與EMT相關信號通路并與EMT相關轉錄因子相互作用。例如,miR-30通過直接靶向因子(Snail、Slug和Zeb2)3’UTR抑制EMT的進展[23]。Snail是EMT的中心調節劑,已觀察到它在所有EMT過程中發揮作用,并與侵入行為相關[24]。Snail通過直接調節上皮和間充質基因轉錄激活EMT。Snail通過其羧基末端鋅指結構域與E-cadherin啟動子區域上的E-box DNA序列結合抑制E-cadherin表達[25]。Slug是Snail超家族的另一個成員,在EMT進展中的作用與Snail類似,通過抑制E-cadherin表達和增強Vimentin和纖連蛋白表達行使功能[24]。Slug受MMP-19正向調控可與Slug啟動子區域結合,隨后激活的Slug可增加受體酪氨酸激酶Axl的表達,以通過正反饋環路維持Slug表達并穩定GBC細胞中的EMT[26]。Zeb2是一種可驅動EMT的轉錄因子,其表達通常在Snail表達激活之后[27]。Zeb2在GBC侵襲位點高表達并通過抑制E-cadherin和T-cadherin表達并在轉錄水平增加N-cadherin和Vimentin表達提高侵襲潛力[28]。在本研究中,我們發現用miR-30 mimic處理改變了EMT相關蛋白的表達,包括E-cadherin、N-cadherin和Vimentin。并阻止了EMT轉錄因子的Snail、Slug和Zeb2的上調。另外,過表達miR-30可以明顯逆轉GBC-SD細胞EMT進程。

我們在體外實驗中證明了miR-30在GBC細胞增殖和遷移和侵襲中的關鍵作用,可能是通過靶向EMT相關轉錄因子Zeb2。我們的研究結果提供了對GBC EMT進展機制的新見解,表明miR-30可能作為抑制GBC的新靶點。