新疆部分地區(qū)綿羊常見(jiàn)蜱傳病原分子調(diào)查鑒定

梅杰，巴依娜，鹿夢(mèng)瑤，阿合提·布爾列斯，李永帥，巴音查汗·蓋力克，李永暢

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

蜱能夠攜帶和傳播多種病原體（細(xì)菌、病毒和原生動(dòng)物），蜱傳疾病因而受到廣泛關(guān)注。目前，我國(guó)已發(fā)現(xiàn)7屬117種蜱蟲(chóng)和30多種新型蜱傳病原體[1]，多種蜱傳疾病也已有相關(guān)報(bào)道，如巴貝斯蟲(chóng)病、泰勒蟲(chóng)病、綿羊無(wú)漿體病和Q熱等[2]。新疆位于我國(guó)西北地區(qū)，草場(chǎng)豐富氣候復(fù)雜，利于蜱蟲(chóng)滋生，已有6屬14種蜱于新疆被鑒定發(fā)現(xiàn)[2]。新疆肉羊存欄量為4 153.8萬(wàn)只，約占全國(guó)羊養(yǎng)殖業(yè)13.8%。近年來(lái)，盡管有少量報(bào)道闡述了新疆地區(qū)綿羊蜱傳血液原蟲(chóng)病[3-4]，但關(guān)于蜱傳播病原體的信息仍然不足。本研究對(duì)新疆部分地區(qū)綿羊常見(jiàn)蜱傳病原體流行特性展開(kāi)調(diào)查，以期補(bǔ)充新疆地區(qū)綿羊血液原蟲(chóng)病數(shù)據(jù)庫(kù)并為蜱傳染病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集

2021年從新疆克拉瑪依烏爾禾區(qū)及巴州和靜縣部分地區(qū)，隨機(jī)抽樣選取并采集散養(yǎng)、外觀健康、無(wú)明顯發(fā)病癥狀的綿羊作為調(diào)查對(duì)象，抽取143只羊逐只無(wú)菌頸靜脈采血，保存于2 mL EDTA抗凝管。裝入放置有冰袋的采樣箱中，詳細(xì)記錄每只羊的性別、年齡等情況，帶回實(shí)驗(yàn)室。置于-4℃冰箱中，提取DNA，-20℃冰箱保存待核酸檢測(cè)。

1.1.2 試劑與儀器

瓊脂糖、溴化乙錠（Sigma公司）；TianGen血液基因組DNA提取試劑盒（晶美技術(shù)有限公司）、膠回收試劑盒（OMEGA公司）；DL2000Marker、2×Es Taq MasterMix（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）；pEASY-T1載體（北京全式金生物技術(shù)有限公司）。

RADIAL20臺(tái)式高速離心機(jī)（ORTO ALRESA公司）、DK-600A型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、DYY-Ⅲ-5型電泳儀（北京六一公司）、PCR儀（Bio-Rad公司）、Motic BA400型光學(xué)顯微鏡（Motic公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取

按照天根血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取羊血DNA，于-20℃保存，并對(duì)所提取的基因組DNA進(jìn)行電泳檢測(cè)。1.2.2血涂片檢查

采集的新鮮血液滴于載玻片上，推片、甲醇固定、吉姆薩染片，10×100倍油鏡下觀察血涂片中紅細(xì)胞內(nèi)有無(wú)蟲(chóng)體及血液中各種細(xì)胞的形態(tài)[5]。

1.2.3 常見(jiàn)綿羊血液原蟲(chóng)病分子生物學(xué)鑒定

以提取的血液基因組DNA為模板，滅菌雙蒸水代替模板的陰性對(duì)照，進(jìn)行目的片段擴(kuò)增。PCR引物反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參考文獻(xiàn)[3]，取5 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)觀察有無(wú)目的條帶；切PCR陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物目的條帶，參照膠回收純化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行膠回收，送往上海生工公司測(cè)序。1.2.4常見(jiàn)綿羊血液原蟲(chóng)病系統(tǒng)發(fā)育分析

通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GenBank BLASTn分析，確定核苷酸序列一致性，并運(yùn)用MEGA 5.0利用最大似然（ML）法，基于Kimura 2參數(shù)模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPPS 20.0軟進(jìn)行件t檢驗(yàn)和單因素方差分析。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 常見(jiàn)綿羊血液原蟲(chóng)病病原檢測(cè)結(jié)果

血涂片鏡檢結(jié)果顯示，兩個(gè)地區(qū)的綿羊血涂片均未發(fā)現(xiàn)明顯蟲(chóng)體。

2.1.1 不同地區(qū)常見(jiàn)綿羊血液原蟲(chóng)病原PCR檢查結(jié)果（見(jiàn)表1）

由表1可知，兩個(gè)地區(qū)的綿羊無(wú)漿體陽(yáng)性率為5.32%（5/94）、100%（49/49）；而羊感染伯氏立克次氏體的陽(yáng)性率分別為7.45%（7/94）、42.86%（21/49）。巴音郭楞和靜縣地區(qū)綿羊無(wú)漿體和伯氏立克次氏體感染情況比克拉瑪依烏爾禾地區(qū)嚴(yán)重，且兩地均未檢出其他血液原蟲(chóng)病。

表1 不同地區(qū)常見(jiàn)綿羊血液原蟲(chóng)病原PCR檢查結(jié)果Tab.1 PCR test results of common sheep blood protozoa in different regions

2.1.2 不同性別常見(jiàn)綿羊血液原蟲(chóng)病原PCR檢查結(jié)果（見(jiàn)表2）

由表2可知，公羊的綿羊無(wú)漿體陽(yáng)性數(shù)極顯著低于母羊（P＜0.01）。

表2 不同性別常見(jiàn)綿羊血液原蟲(chóng)病原PCR檢查結(jié)果Tab.2 PCR test results of common sheep blood protozoa in different genders

2.1.3 不同年齡常見(jiàn)綿羊血液原蟲(chóng)病原PCR檢查結(jié)果（見(jiàn)表3）

表3 不同年齡綿羊血液原蟲(chóng)病原PCR檢查結(jié)果Tab.3 PCR test results of common sheep blood protozoa in different ages

由表3可知，各年齡段均有無(wú)漿體和伯氏立克次氏體感染，各年齡段感染情況差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 綿羊血液原蟲(chóng)系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育分析

2.2.1 綿羊無(wú)漿體部分PCR擴(kuò)增結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育分析（見(jiàn)圖1、圖2）

由圖1可知，綿羊無(wú)漿體進(jìn)行凝膠電泳得到約為

圖1 綿羊無(wú)漿體PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.1 PCR results of Anaplasma ovis in sheep

由圖2可知，3株綿羊無(wú)漿體的OL859534基因序列的分歧度和相似性差異不大。新疆株與德國(guó)株和美國(guó)株相似性達(dá)99.0%～99.9%；分歧度1.0%～0.1%。

2.2.2 綿羊伯氏立克次氏體部分PCR擴(kuò)增結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育分析（見(jiàn)圖3、圖4）

由圖3可知，伯氏立克次氏體進(jìn)行凝膠電泳得到約為501 bp的目的條帶。

圖3 綿羊伯氏立克次氏體PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.3 PCR results of Coxielle burnetii in sheep

由圖4可知，本試驗(yàn)檢出的伯氏立克次氏體序列與GenBank中存在綿羊無(wú)漿體的法國(guó)、阿聯(lián)酋、尼日利亞、俄羅斯4個(gè)國(guó)家共17條序列并一支，序列包括：法國(guó)株（EU88863）、阿聯(lián)酋（MW057693）、北京株AY251297、AY251298）、西伯利亞株（MK335931）等。其中本文測(cè)定的伯氏立克次氏體序列與法國(guó)株和突尼斯株相似性最大，達(dá)到97.0%～99.9%。347 bp的目的條帶。之后產(chǎn)物送往上海生工有限公司測(cè)序，運(yùn)用MEGA 5.0進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，見(jiàn)圖2。

圖2 綿羊無(wú)漿體系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Phylogenetic analysis of Anaplasma ovis

圖4 綿羊伯氏立克次氏體系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.4 Phylogenetic analysis of Coxielle burnetii

3 討論

伯氏立克次氏體作為人畜共患病的病原可引起人的Q熱。雖然許多病例無(wú)癥狀，但Q熱的癥狀因人而異，以流感樣疾病和肌痛等為主，國(guó)外已有報(bào)道其感染情況。Sun等[6]報(bào)道，伯氏立克次氏體作為我國(guó)目前已篩選的新興病媒傳播病原體中報(bào)道最多的病原體之一，進(jìn)行區(qū)域內(nèi)的研究利于降低其對(duì)全球健康構(gòu)成的影響[6]。感染伯氏立克次氏體的非妊娠動(dòng)物無(wú)癥狀或表現(xiàn)出輕微的流感樣癥狀，小型反芻動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)主要因流產(chǎn)、死胎、乳腺炎等生殖疾病造成經(jīng)濟(jì)損失。而且伯氏立克次氏體可持續(xù)潛伏多年，甚至?xí)K生攜帶病原體而無(wú)相關(guān)并發(fā)癥[7-8]。

本試驗(yàn)中，調(diào)查范圍內(nèi)的綿羊亦無(wú)明顯臨床癥狀，且伯氏立克次氏體陽(yáng)性率為37.76%，高于前期在新疆部分區(qū)域內(nèi)牛感染伯氏立克次氏體（20.5%）和湖北省的山羊陽(yáng)性率（4.7%）[9-10]。此外，對(duì)不同年齡綿羊感染情況調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，成年綿羊無(wú)漿體陽(yáng)性率高于幼年，Q熱的陽(yáng)性率在幼年時(shí)較高，可能是由于幼年綿羊免疫系統(tǒng)發(fā)育不完全，機(jī)體抵抗力較差，容易受到感染侵害。

無(wú)漿體病的病原是寄生于動(dòng)物血細(xì)胞內(nèi)的血液寄生蟲(chóng)，主要經(jīng)蜱和吸血昆蟲(chóng)傳播，廣泛存在于熱帶和亞熱帶地區(qū)，溫帶地區(qū)也有少量分布[4]。1983年首次在新疆發(fā)現(xiàn)綿羊無(wú)漿體感染，隨后內(nèi)蒙古等地相繼出現(xiàn)相關(guān)的報(bào)道[11]。無(wú)漿體疾病的流行多發(fā)生在蜱和各種吸血昆蟲(chóng)活動(dòng)的季節(jié)[12]，雨量稀少的地區(qū)傳播媒介的數(shù)量有所減少，當(dāng)?shù)鼐d羊無(wú)漿體病例也相對(duì)較少。各種蜱蟲(chóng)均可通過(guò)吸血的方式機(jī)械傳播病原，而經(jīng)卵傳遞和發(fā)育階段性傳遞試驗(yàn)均未使綿羊遭到感染。本調(diào)查推測(cè)，調(diào)查地區(qū)的蜱蟲(chóng)可能是綿羊無(wú)漿體普遍感染的重要原因之一，某些病例也可能經(jīng)胎盤(pán)垂直感染[13]，造成一定程度的幼年綿羊感染。無(wú)漿體原蟲(chóng)通過(guò)硬蜱傳播的陽(yáng)性率較高[14-15]，進(jìn)一步表明了蜱蟲(chóng)傳播的廣泛性。本調(diào)查公羊的陽(yáng)性數(shù)高于母綿羊無(wú)漿體陽(yáng)性數(shù)可能是由于本次公羊的樣本數(shù)量太少，導(dǎo)致結(jié)果存在誤差而不足以說(shuō)明具體情況。

根據(jù)前期相關(guān)報(bào)道，已知綿羊體內(nèi)攜帶綿羊泰勒蟲(chóng)、綿羊巴貝斯蟲(chóng)等病原，但本調(diào)查并未發(fā)現(xiàn)上述病原體，可能與不同地理位置媒介蜱的分布及其生態(tài)環(huán)境不同有關(guān)。我國(guó)羊泰勒蟲(chóng)病的傳播媒介為青海血蜱和長(zhǎng)角血蜱，已確認(rèn)青海省、寧夏回族自治區(qū)及甘肅省境內(nèi)羊泰勒蟲(chóng)病的傳播媒介為青海血蜱，鑒定河北省和遼寧省羊泰勒蟲(chóng)病的媒介蜱是血蜱屬的蜱，河南省羊泰勒蟲(chóng)病的媒介蜱則為長(zhǎng)角血蜱，新疆維吾爾自治區(qū)羊泰勒蟲(chóng)病的傳播媒介主要為小亞璃眼蜱。本調(diào)查發(fā)現(xiàn)，所采集樣點(diǎn)的無(wú)漿體陽(yáng)性率較高，可能是當(dāng)?shù)氐牡乩憝h(huán)境為蜱等宿主的生存提供了良好條件。與以往其他地區(qū)相比，綿羊感染無(wú)漿體平均陽(yáng)性率小幅度上升，各地區(qū)陽(yáng)性率差異性較大，可能與當(dāng)?shù)氐尿缦x(chóng)種類(lèi)不同、環(huán)境（濕度和溫度）以及飼養(yǎng)管理方面有關(guān)[4]。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，兩區(qū)域內(nèi)均存在綿羊無(wú)漿體和伯氏立克次氏體感染情況，表明本地動(dòng)物中存在一定潛在感染風(fēng)險(xiǎn)。伯氏立克次氏體可引發(fā)人與動(dòng)物共患病，今后需加大調(diào)查與防控力度，提高人與動(dòng)物健康水平。