不同季節的微生物結構對垃圾滲濾液處理影響

黃 磊，孫宇飛，尹思雨，鄧冬梅

（廣西科技大學 生物與化學工程學院，廣西 柳州 545005）

0 引言

垃圾滲濾液是垃圾填埋后長期存在的副產物，其典型的污染物包括高濃度的溶解有機物、銨態氮、無機鹽和各種懸浮固體。由于缺乏可生物降解的有機碳源，垃圾滲濾液被認為是一種難以處理的廢水。生物脫氮是目前垃圾滲濾液降解的主流工藝，現有的生物脫氮工藝包括硝化反硝化工藝、內源性反硝化工藝和氨氧化工藝等。其中硝化和反硝化工藝被認為是目前最經濟的廢水生物脫氮處理技術，并用于垃圾填埋場的初期處理中。硝化反硝化過程是在硝化菌和反硝化菌存在的情況下將氨氮轉化成為氮氣，最終從水中逸出，從而達到生物脫氮的目的。由于硝化細菌和反硝化細菌所處的環境不同，通常硝化反應過程需要好氧條件，而反硝化反應過程則是在缺氧條件下進行；因此，需要將硝化和反硝化過程分開。單級A/O工藝預計不足以進行滲濾液處理，研究結果表明采用多級工藝處理可以達到較好的處理效果。多級工藝處理即在同一個處理系統中串聯多個缺氧段（A）和好氧段（O），一個缺氧段和一個好氧段構成一級反應器，一套污水系統通常包含2～5個反應器。多級硝化反硝化具有碳源利用率高，去除效果好的特點，而且缺氧段與好氧段的交替運行，能夠不斷地進行硝化與反硝化反應，缺氧段產生的堿度可以補充好氧段消耗的堿度。另外缺氧前期的反硝化利用了大量碳源，進入好氧階段的碳源相對較少，也可以抑制異養菌的生長，從而利于自養型硝化菌生長。膜生物反應器（MBR）是膜分離技術與傳統活性污泥法相組合的新型污水處理工藝技術，具有出水水質好、占地面積小、剩余污泥少、易于控制和改造等優點；因此，MBR 已被應用于城市污水處理、工業廢水處理、微污染飲用水凈化、填埋場和焚燒廠滲濾液處理等方面。將多級A/O 反應器與MBR組合，可以實現氨氮高效去除的目的，適合應用于城市垃圾滲濾液的大量處理。

在利用硝化反硝化處理垃圾滲濾液過程中，反應池中微生物是處理的關鍵因素，不同地區的垃圾滲濾液的組成和水質的處理量也有所差異，這導致反應池中的微生物結構也將不同。環境因素影響水處理的效果，比如溫度和水質變化會影響到水處理系統的微生物組成。在以往的其他水處理系統中，發現微生物的結構主要受季節影響，北半球的夏季溫度較高，優勢菌屬的豐富度要比冬季的優勢菌屬要高，微生物的結構也存在差異。冬季低溫會對微生物的數量和群落構成產生影響，延長系統的啟動時間、限制垃圾滲濾液污水處理效率等。認識垃圾滲濾液處理工藝中的微生物和水質去除的關系是了解水處理本質的關鍵，這將有助于水處理過程的設計和工藝優化。

為了解不同季節溫度下垃圾滲濾液處理池中的微生物結構組成和對水質去除的影響，本試驗分別在夏季和冬季從柳州某垃圾滲濾液污水處理廠生物反應池中采樣，通過理化測定分析水質處理效果和高通量測序測定微生物的組成，探究不同季節生物池中的群落結構對垃圾滲濾液處理結果的影響，為以后的垃圾滲濾液處理提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集測定方法

從柳州某垃圾滲濾液污水處理廠中收集生物樣品，該垃圾滲濾液污水處理廠工藝流程如圖1所示，污水處理廠采用硝化反硝化處理工藝，污水處理量約為600 t/d，生物反應池由2 級A/O+MBR 相結合，預處理后通過I級反硝化池后進入硝化池，之后再進入Ⅱ級硝化池和反硝化池。本次樣品采集時間為9 月和12 月，由于硝化和反硝化池中的大量回流導致在物種組成和結構上并無太大差異，所以將I級硝化池和反硝化池歸為I級反應池，Ⅱ級硝化池和反硝化池歸為Ⅱ級反應池。采樣點為I級反應池和Ⅱ級反應池2 個串聯系統，每個反應池取1 000 mL 的泥水混合樣。每次取I級硝化反硝化池和Ⅱ級硝化反硝化池各2 個樣品，每個季節取4 個時間點。其中夏季取樣16 個，冬季16個，總共32 個樣品，取樣后對每個樣品進行3 次平行測試。采樣信息如表1所示。

圖1 垃圾滲濾液污水處理工藝圖

表1 采樣信息

水質指標參數化學需氧量（COD）通過重鉻酸鉀法測定（GB 11914—89），氨氮（NH—N）測定使用納氏試劑比色法（HJ 535—2009），硝酸鹽氮（NO—N）通過酚二磺酸分光光度法測定（GB/T 7480—1987），亞硝酸鹽氮（NO—N）通過分光光度法測定（GB/T 7493—1987）。

1.2 樣品的預處理及提取DNA

將采集的泥水混合樣取100 mL 進行離心，得到沉淀的污泥，用Powersoil 土壤DNA 提取試劑盒來提取污泥中的總DNA。所提取的DNA 溶液，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度。取適量DNA溶液，使用Nanodrop 檢測DNA 濃度。用通用引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′），806R（5′-GGACTACHⅤGGGTWTCTAAT-3′）進行PCR 擴增。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，72 ℃延伸10 min，30個循環，完成后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。根據PCR產物的濃度，將各樣品進行等濃度混樣?；鞓赢a物利用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并切膠回收產物。最后通過Illumina Hiseq 2500測序平臺對樣品進行細菌16SrDNA 高通量測序。

1.3 數據分析

用Qiime將測序得到的序列在97%相似度水平下進行聚類和注釋，并分別在各個分類水平統計各樣本的群落組成與OTU 信息。樣本微生物多樣性指數算法參考計算Chao 指數和Shannon 指數，通過比對夏季和冬季2 個時間點的多樣性，計算差異性并作圖。利用R 語言Prcomp 函數對門水平和屬水平進行樣本主成分分析（principal component analysis，PCA）和作圖。對不同季節反應池中微生物群落進化分支進行LEfSe 分析，線性判別分析（LDA）閾值設為2。分別對門水平和屬水平豐度大于1%的物種繪制物種組成圖。

2 結果和分析

2.1 不同季節的進水水質及污染物去除效果分析

化學需氧量（COD）和氮含量是評估垃圾滲濾液的2 個重要指標，也是垃圾滲濾液需要去除的2 個重要污染物，圖2 是I/Ⅱ級反應池中2 個季節的COD、NH—N、NO—N 和NO—N 的進水質量濃度對比。I級反應池COD 的進水質量濃度范圍是12 480～12 590 mg/L，夏季進水質量濃度低于冬季，Ⅱ級反應池COD 的進水質量濃度范圍是1 309～1 320 mg/L。NH—N 的2 個季節進水差異較大，夏季進水質量濃度要高于冬季進水質量濃度，I級進水質量濃度范圍是1 311～2 120 mg/L，Ⅱ級進水質量濃度范圍是39～126 mg/L，2個季節進水具有顯著差異。NO—N和NO—N在2個季節的進水差異較小，I級反應池NO—N進水質量濃度夏季低于冬季，而NO—N冬季進水質量濃度要略低于夏季。從I級反應池對這幾個進水指標的去除效果上看，COD、NH—N、NO—N冬季的去除率要大于夏季的去除率，NO—N夏季的去除率大于冬季。

圖2 （網絡版彩圖）反應池進水水質及污染物去除效果（**表示p ＜0.01）

圖2 （續）

2.2 反應池中細菌群落的α多樣性分析

對冬夏兩季收集的生物樣品進行高通量測序，所測的樣品中含有的多樣性指數如圖3所示。Chao指數是用來估計群落中含OTU 數目的指數，常用來估計物種總數，表示樣品的物種豐富度。在夏季和冬季2個季節中，2個反應池中夏季的Chao指數高于冬季，并且具有顯著性差異（＜0.05），說明夏季的物種豐富度高于冬季的物種豐富度，并且溫度影響了反應池中的菌群豐富度（圖3（a））。Shannon指數是用來估算樣品中微生物的多樣性指數之一，數值越大，說明群落多樣性越高。在不同取樣時間的樣品中，2 個反應池中夏季的Shannon 指數要高于冬季，所以夏季的群落多樣性高于冬季，這說明了溫度是影響群落多樣性的重要因素。

圖3 （網絡版彩圖）反應池中夏季和冬季的物種多樣性和群落豐富度（**表示p ＜0.01）

2.3 垃圾滲濾液處理反應池中細菌群落差異分析

PCA是基于原始的物種組成矩陣所做的排序分析，通過主成分分析方法對2個反應池中不同取樣時間門水平和屬水平進行差異分析。圖4是門水平和屬水平上不同季節不同樣品之間微生物群落的PCA圖。圖4顯示微生物在門水平和屬水平上以季節聚類到一起，說明季節是影響物種組成的重要因素，2個反應池中的物種差異性小，溫度對微生物群落的差異性起到更大作用。在門水平上，PCA結果顯示PC1和PC2占菌門的47.7%和11.2%的解釋量，此時整體的菌門主要是按季節分布的，但在冬季的2個樣品偏向夏季，這說明在門水平上還是具有一定的組成相似性。在屬水平上，PCA結果顯示2個季節的樣品距離更遠，說明屬水平的差異性更大。

圖4 （網絡版彩圖）基于PCA不同季節細菌微生物群落差異性

圖4 （續）

對不同季節和不同處理階段反應池中優勢微生物進化分支的LEfSe分析見圖5，從菌群結構上看，反應器在豐度上具有統計學差異的菌群，LDA 設為2，LEfSe 分析結果顯示各階段中的biomarker 分別為夏季I級反應池1個，夏季Ⅱ級反應池11個，冬季I級反應池2個，冬季Ⅱ級反應池20個。主要的差異物種主要體現在Ⅱ級反應池中，冬季的顯著差異物種要大于夏季。

圖5 （網絡版彩圖）不同季節反應池中微生物群落進化分支LEfSe分析

2.4 不同季節硝化反硝化池中細菌群落的組成和多樣性

在不同季節對I級和Ⅱ級反應池進行取樣，在屬水平上對反應池中的微生物多樣性進行分析。結果顯示夏季和冬季部分優勢物種豐富度具有明顯差異，I級和Ⅱ級反應池的微生物相對差異性較?。▓D6）。屬水平的主要優勢屬為陶厄氏菌屬（）、甲烷食甲基菌屬（）、懶小桿屬（）、甲烷八疊球菌屬（）和厭氧繩菌屬（）等。是夏季和冬季最優勢的菌屬，在夏季的豐富度為37.79%～48.54%，冬季的豐富度為84.52%～88.37%，2個季節的豐富度具有明顯差異。作為一類具有反硝化能力的革蘭氏陰性細菌，可將NO中的氮元素通過一系列中間產物（NO、NO、NO）還原為N，對氮元素的去除具有重要的作用。在夏季和冬季不同時間點的豐富度分別為9.06%～29.87%和0.81%～1.86%。而常存在于脫氮系統中，是一種具有反硝化功能的細菌，夏季的豐富度要大于冬季。在厭氧消化的產甲烷化作用和對氮元素的去除中發揮著重要的作用，其在夏季和冬季的豐富度分別為0.42%～1.94%和0.25%～0.93%。

圖6 （網絡版彩圖）不同季節反應池中屬水平生物組成

3 討論

3.1 不同季節下反應池對垃圾滲濾液的去除

2 個硝化反硝化池對水質中COD、NH—N、NO—N 和NO—N 的去除中，NH—N 夏季和冬季的去除率分別為98.0%和99.4%，說明反應池能夠高效地去除NH—N，這與反應器中豐富的變形菌門有關（圖6）。COD夏季和冬季去除率為92.6%和93.7%。NO—N 的去除率略低，夏季和冬季為79.7%和77.8%；NO—N的去除最差，夏季和冬季為60.0% 和68.5%，結 合NH—N、NO—N 和NO—N 的去除，滲濾液中的總氮的去除率也達到了夏季的92.6%和冬季的93.5%，這些結果表明滲濾液中的污染物得到有效去除。在夏季和冬季中，反應池對滲濾液中的COD、NH—N、TN 的去除效果并無太大區別，雖進水中如NH—N 的量具有差異性（夏季為2 011 mg/L，冬季為1 548 mg/L），但是最終的處理效果相近（為98.0%和99.4%），這表明溫度的變化對COD 和氮的去除結果影響較小。

3.2 不同季節下反應池中的群落結構

多樣性分析結果顯示不同組分的生物樣品夏季的Chao 指數和Shannon 指數均高于冬季，并且具有顯著差異（＜0.05），這說明在垃圾滲濾液處理硝化反硝化反應池中夏季的物種豐富度和菌落多樣性要高于冬季。溫度的變化對反應池中的微生物多樣性產生重要影響，高的溫度對更多的微生物生長有利，所以夏季的物種豐富度和菌落多樣性明顯要高于冬季。在對反應池中細菌群落進行差異分析時，PCA結果顯示夏季和冬季2個季節門水平和屬水平上是以季節為聚類的，來自2個反應池之間的微生物聚類到了一起，說明在空間上的微生物差異性小，主要由季節溫度主導反應池中細菌微生物組成和結構。

對物種組成進行差異性分析，結果顯示差異的物種較少，其主要的差異物種主要體現在Ⅱ級反應池中，冬季的顯著差異物種要大于夏季。在物種組成上，I級和Ⅱ級反應池在物種豐富度上并無太大差異，這是硝化和反硝化池中的大量回流導致的結果。反應池中的微生物在門水平的組成主要由變形菌門（）、擬桿菌門（）、疣微菌門（）、綠彎菌門（）、綠菌門（）、OD1 菌門和廣古菌門（）所主導，不同菌門分布呈現明顯的季節特征。根據之前的研究發現，是污水處理廠中最主要的微生物群，這對于高氮含量的垃圾滲濾液來說，該菌門在碳氮去除方面發揮著重要的作用。包含優勢的屬和，具有反硝化能力，它們的存在說明在反應池中起到重要的反硝化作用；是一種能夠產生甲烷的微生物，可將甲烷氧化并釋放出中間體，這些中間體可以作為共生細菌呼吸的電子供體。2個反應池的在冬季的豐富度均高于夏季，并且差異顯著，說明該菌可以在溫度較低的時候發揮積極的作用，這也是冬季的氮去除率高于夏季的原因（圖2、圖3）。是除外豐富度最高的菌門，是環境中常見的水解-酸化細菌，可利用長鏈揮發性脂肪酸（例如丙酸和丁酸）作為底物，降解垃圾滲濾液中的許多大分子物質，例如碳水化合物、蛋白質和脂質，并且將可溶性糖轉化為單糖和短鏈脂肪酸。在夏季的豐富度要高于冬季的豐富度，這對垃圾滲濾液中的大分子物質的去除具有重要作用。相對于其他污水處理廠，是硝化反硝化池中比較特殊的優勢菌門，且在反應池中的豐富度較高，是2 個季節相差最大的一個菌類。據研究表明該菌類存在于低溫環境中，NO—N對Ⅴer豐富度有顯著影響，該菌與纖維素的厭氧降解有關且能夠降解有機物，這對冬季的垃圾滲濾液處理起重要作用。和是普遍存在于水處理系統中的2 個優勢菌門，其夏季的豐富度要顯著高于冬季。該菌的作用是在缺氧條件下將EPS基質中腐爛的細菌細胞物質和細胞外肽分解成更簡單的有機物，例如乳酸和乙醇，其他物種可以利用它們進行新陳代謝，在此過程中產生NO—N 可作為厭氧氨氧化過程電子受體。此外，還能夠降解芳香族化合物（例如腐殖質），這可能在難處理的有機物中起關鍵作用。和的優勢屬分別為和，其中具有降解碳水化合物的功能，而是具有反硝化功能的一類細菌。是2 個季節反應池中豐富度最高的古菌，其主要以為主，在厭氧硝化時的產甲烷化作用和氮元素的去除中發揮著重要的作用。結合水質的去除和物種差異情況分析，表明垃圾滲濾液的處理效果和主要功能菌種相關，與物種豐富度相關不大。

4 結論

1）不同季節垃圾滲濾液的NH—N、COD、NO—N、NO—N 均能得到良好去除，其中NH—N 在夏季和冬季的去除率達到了98.0%和99.4%，COD 在夏季和冬季的去除率也達到了92.6%和93.7%，NO—N 和NO—N 去除效果較差，反應池在夏季對污染物的去除率要低于冬季。

2）溫度的變化影響反應池中的物種豐富度，I級和Ⅱ級反應池中微生物的差異性小，夏季的物種豐富度和菌落多樣性要高于冬季。

3）夏季和冬季反應池中主要以、、、和為主，物種豐富度對不同季節的微生物對水質的去除效果相關不大，主要和優勢的功能菌屬有關。