應用固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法同時檢測城市污水中氟胺酮及2種位置異構體

王 平，劉曉云，鄭振成，梁桂巧，賴勝強

（廣州正孚檢測技術有限公司 廣東正孚法醫毒物司法鑒定所，廣東 廣州 510663）

近幾年來，隨著國家禁毒部門對污水流行病學（Wastewater-Based Epidemiology,WBE）應用于毒情監測的認可和推廣，全國掀起了相關檢測與科研工作的熱潮。WBE最早由環境科學家提出，起源于違禁藥品的消費調查。2001年，美國國家環境保護局環境科學家DAUGHTON首次提出基于市政污水分析的估計藥物消費方法。WBE在調查成癮性物質、毒品等方面具有巨大的優勢，且相比傳統流行病學，該方法具有可提供客觀的、連續的以及實時數據的優勢。我國污水毒品流行病學的研究起步較晚，最早的流行病學研究起源于國際合作，KHAN等首次報道了我國北京、廣州、深圳和上海四大主要城市的毒品消費情況。隨著WBE的成熟應用和推廣，新精神活性物質也逐漸得到國內外禁毒領域專家的關注，并開始將新精神活性物質的監控納入各地常規監控范圍。

2021年5月11 日，公安部、國家衛生健康委員會和國家藥品監督管理局聯合發布《關于將合成大麻素類物質和氟胺酮等18種物質列入〈非藥用類麻醉藥品和精神藥品管制品種增補目錄〉的公告》，正式決定整類列管合成大麻素類新精神活性物質，并新增列管氟胺酮等18種新精神活性物質。自2021年7月1日起，氟胺酮（2-fluoro Deschloroketamine，2-FDCK）正式作為國家管制化學物品進行列管。

氟胺酮的麻醉效果與氯胺酮類似，但在有效劑量和蘇醒時間上優于氯胺酮。根據現有動物實驗數據可知，氟胺酮的半數致死量LD50與氯胺酮相當，但其半數抑制濃度IC50明顯高于氯胺酮，即氟胺酮在動物實驗層面上的毒性小于氯胺酮，但仍不能忽略氟胺酮的不良反應：幻覺、意識喪失、抽搐、運動抑制、高血壓、心動過速，部分會出現呼吸抑制、惡心嘔吐、肝腎功能紊亂等。

本輪列管的氟胺酮為2位氟取代的氟胺酮（2-FDCK），列管通知發布后，很多互聯網化工交易平臺隨即出現了3位氟取代的氟胺酮（3-fluoro Deschloroketamine，3F-DCK）和4位氟取代的氟胺酮（4-fluoro Deschloroketamine，4F-DCK），2-FDCK、3F-DCK與4F-DCK的化學結構式如圖1所示。由于氟元素取代的位置均在氟胺酮的苯環上，因此3F-DCK、4F-DCK在色譜保留和質譜特征上與已列管的2-FDCK相似，容易在污水毒品檢測的各類實踐中產生誤判。本文建立了污水中氟胺酮及2種位置異構體的分析方法，以期為毒品、毒物檢測工作者更好地理解和區分氟胺酮及2種位置異構體提供理論依據。

圖1 氟胺酮及2種位置異構體的化學結構式

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LCMS-8045型超高效液相色譜質譜聯用儀（日本島津公司）；SPE Ware CEREX48TM固相萃取氮吹儀（瑞士帝肯公司）；Sorvall ST16R型高速冷凍離心機（賽默飛世爾科技公司）；Milli-Q型超純水機（德國默克公司）；CNW Poly-Sery MCX型固相萃取柱（60mg/3mL，上海安譜實驗科技股份有限公司）；1.2 μm玻璃纖維濾膜（上海興亞凈化材料廠）；CNW柱管（60 mL）及柱管連接件轉換接頭（上海安譜實驗科技股份有限公司）。

2-FDCK（純度為98%）、3F-DCK（純度為98%）、4FDCK（純度為98%）均購自美國Cayman Chemical公司；內標物氟胺酮-D（Ketamine-D，美國Cerilliant公司）；甲醇、乙腈、乙酸乙酯均為色譜純（德國默克公司），其余試劑均為市售分析純；實驗用水為Milli-Q型超純水機制備的超純水。

實驗中的空白污水樣品均采集自廣州市黃埔區市政污水的瞬時樣，經實驗室檢測均不含氟胺酮及2種位置異構體。其他測試樣品均通過水質采樣器采集12個瞬時樣品（每2 h采集1次）等體積混合于預置有鹽酸的采樣瓶中，采集過程中保持在-20℃下進行，單樣采樣體積為600 mL。

氟胺酮及2種位置異構體的標準儲備溶液：1 mg/mL，分別準確稱取氟胺酮及2種位置異構體標準物質5 mg，用甲醇溶解并轉移至5 mL容量瓶中，用甲醇定容，使用時用甲醇稀釋至所需質量濃度。

氟胺酮及2種位置異構體的工作溶液系列：用甲醇將氟胺酮及2種位置異構體標準儲備溶液逐級稀釋配制為10、100 μg/L的工作溶液系列。由于氟胺酮位置異構體的標準物質均為鹽酸鹽，因此以上溶液的質量濃度均為其鹽酸鹽的質量濃度。

氯胺酮-D（KET-D）內標儲備溶液：100μg/mL，氟胺酮的市售同位素內標較難獲取，實驗將氯胺酮的同位素內標氯胺酮-D（KET-D）作為氟胺酮及2種位置異構體的通用內標，使用時用甲醇稀釋至所需質量濃度。

KET-D內標工作溶液：100 μg/L。

1.2 方法

1.2.1 儀器工作條件

色譜條件 日本島津GL Sciences Intersil HILIC（3.0 mm×150 mm，3 μm）色譜柱；柱溫為30℃；流動相A為10 mmol/L乙酸銨，流動相B為乙腈；流量為0.28mL/min；進樣量為1μL；采用體積比為98∶2的乙腈-10 mmol/L乙酸銨等度洗脫。

質譜條件 離子源為電噴霧離子源（Electron Spray Ionization,ESI）；檢測方式為電噴霧離子源正離子模式（ESI）；掃描方式為多反應監測模式（Multiple Reaction Monitoring,MRM）；接口電壓為4.5 kV；霧化氣（氮氣）流量為3.0 L/min，干燥氣（氮氣）流量為10.0 L/min，加熱氣（氮氣）流量為10.0 L/min；接口溫度為300℃，脫溶劑管溫度為250℃，加熱模塊溫度為400℃；碰撞氣為氬氣（230 kPa）。其他質譜參數見表1。

表1 氟胺酮及2種位置異構體和內標物質的質譜參數

1.2.2 樣品處理過程

用鹽酸溶液調節污水樣品的pH值約為2，在高速冷凍離心機中以12 000 r/min的轉速離心5 min，取上清液經玻璃纖維濾膜過濾去除固體顆粒物，取50 mL過濾后的水樣，分別加入質量濃度為100 μg/L的工 作內標溶液30 μL，充分搖勻后待固相萃取富集凈化。使用CNW Poly-Sery MCX固相萃取柱進行富集凈化，固相萃取柱經過4 mL甲醇、4 mL pH為6.0的磷酸緩沖鹽（PBS）緩沖液活化。加入水樣，為保證固相萃取柱的填料與水樣中目標物的充分吸附，上樣過程不加壓。上樣完成后，依次加入2 mL去離子水、2 mL 0.1mol/L鹽酸溶液，41.4 kPa氮氣正壓吹干1 min；加入2 mL甲醇和2 mL乙酸乙酯，206.9 kPa氮氣正壓吹干5 min，完成雜質的清洗工作；再加入4 mL體積比為78∶20∶2的二氯甲烷-甲醇-氨水混合溶液，以洗脫目標物成分。洗脫液經氮吹儀正壓40℃吹干，加入100 μL體積比為1∶1的含0.05%（體積分數，下同）甲酸的5 mmol/L乙酸銨-甲醇混合溶液復溶殘留物，經過0.22 μm有機系濾膜過濾，取上清液待上機分析。

1.3 方法學驗證

1.3.1 工作曲線、檢出限與定量限

城市污水中常見的毒品類型甲基苯丙胺的濫用質量濃度可達100 ng/L以上，針對新型氟胺酮類毒品，因其濫用的群體覆蓋區域和人員遠不及傳統毒品甲基苯丙胺，大型城市的污水處理廠、泵站等污水典型采樣位點的質量濃度通常低于50 ng/L。

準確量取50 mL空白污水樣品，加入質量濃度分別為10、100 μg/L的氟胺酮及2種位置異構體混合標準溶液，并用甲醇逐級稀釋為質量濃度分別是1、3、5、8、10、30、50、80 ng/L的工作溶液系列，各添加樣品中加入質量濃度為100 μg/L的內標氯胺酮-D溶液30 μL，按照實驗方法進行測定。以氟胺酮及2種位置異構體的質量濃度為橫坐標，以氟胺酮及2種位置異構體峰面積與內標物峰面積的比值為縱坐標，以不強制過零點、不對曲線進行加權的方式繪制工作曲線。

1.3.2 準確度與精密度

使用空白污水基質配制低、中、高（3、50、80 ng/L）3個質量濃度的質控樣品各6份，按照實驗方法進行測定，每個質量濃度的樣品連續測定5 d，求得各目標物準確度與精密度的平均值。

1.3.3 回收率與基質效應

取適量氟胺酮及2種位置異構體的混合標準溶液加入空白污水基質中，配制成質量濃度分別為3、50、80 ng/L的添加樣品，按照樣品處理過程對空白污水和添加樣品進行處理，計算氟胺酮及2種位置異構體的回收率。

在日常污水檢測過程中，經常利用不同類型的水源來制備添加樣本，而不同來源、性狀的水對監控目標物的基質效應存在一定的差異。實驗對已知空白污水、廣州市自來水、屈臣氏純化水這3種常見基質水的基質效應進行考察。按照實驗方法對3種空白基質水進行固相萃取，萃取洗脫液吹干后加入100 μL質量濃度分別為1.5、25、40 μg/L的氟胺酮及2種位置異構體混合工作溶液（相當于3、50、80 ng/L的添加質量濃度），計算各物質的基質效應。

2 結果與討論

2.1 氟胺酮位置異構體的定性判定

在質譜離子對豐度比上，氟胺酮及2種位置異構體的特征離子對一致，3種物質的定量離子對均為222.1/109.2，另外兩對離子對222.1/163.2、222.1/191.2的相對離子對豐度比存在一定的差異，對位氟取代4F-DCK的離子對222.1/191.1相對豐度比最高，其次為間位氟取代3F-DCK，最后為鄰位氟取代2-FDCK，而222.2/163.1離子對的相對豐度比相對差異較小。

2.2 方法優化

2.2.1 色譜柱的選擇

氟胺酮及2種位置異構體因其結構的相似性，色譜保留時間和質譜特征離子對的差異較小。實驗比較了親水作用HILIC色譜柱、五氟苯基和聯苯基鍵合填料的色譜柱對氟胺酮及2種位置異構體分離效果的影響。結果表明：五氟苯基和聯苯基鍵合填料的色譜柱在色譜保留上不能有效分離氟胺酮及2種位置異構體，無法達到基線分離，并且即使調整有機相比例、水相組成也不能明顯改善氟胺酮及2種位置異構體的分離度；通過采用親水作用的HILIC色譜柱并調整流動相比例，可將氟胺酮及2種位置異構體進行有效分離。因此，實驗選擇的色譜柱為親水作用的HILIC色譜柱。

多反應監測模式下質量濃度為10 ng/L的氟胺酮及2種位置異構體的色譜圖如圖2所示。

圖2 氟胺酮及2種位置異構體的色譜圖（質量濃度為10 ng/L）

2.2.2 流動相及其流量的選擇

實驗選擇的親水作用HILIC色譜柱通常將乙腈作為流動相中的有機相。結果表明：為有效分離氟胺酮及2種位置異構體，實驗將有機相乙腈的比例從80%遞增至100%時，發現可顯著改善氟胺酮及2種位置異構體的分離度；當有機相乙腈的比例低于90%時，2-FDCK和3F-DCK的多反應監測模式色譜圖存在部分重合；當有機相乙腈的比例高于98%時，3F-DCK的多反應監測模式色譜圖的峰形發生明顯分裂。因此，實驗選擇流動相中的有機相為98%（體積分數，下同）的乙腈。

實驗進一步考察了流動相的流量分別為0.1、0.2、0.25、0.3 mL/min時對氟胺酮及2種位置異構體色譜峰形與分離度的影響。結果表明：當流量高于0.3 mL/min時，2-FDCK和3F-DCK的色 譜 分 離度較低，無法達到基線分離；當流量低于0.2 mL/min時，4F-DCK的色譜峰形過寬。綜合考慮，實驗選擇流動相的流量為0.28 mL/min。

2.2.3 洗脫劑種類的選擇

實驗比較了氨化的甲醇[含2%（體積分數，下同）氨水的甲醇]和體積比為78∶20∶2的二氯甲烷-甲醇-氨水混合溶液的洗脫效果以及在氮吹吹干時間上的差異。結果表明：以含2%氨水的甲醇作為洗脫溶劑時，提取回收率比以體積比為78∶20∶2的二氯甲烷-甲醇-氨水混合溶液的提取回收率高約20%，但在洗脫時間、氮吹吹干的時間明顯更長。綜合實際應用情況，實驗在保證洗脫效果和前處理時間平衡的前提下，選擇以體積比為78∶20∶2的二氯甲烷-甲醇-氨水混合溶液作為洗脫溶液。

2.3 方法學驗證結果

2.3.1 工作曲線、檢出限與定量限

氟胺酮及2種位置異構體的線性范圍、線性回歸方程和相關系數見表2。以3倍信噪比和10倍信噪比計算方法的檢出限（3×/）和定量限（10×/），結果見表2。結果表明：氟胺酮及2種位置異構 體 在1～80 ng/L內 線 性 關 系 良 好，2-FDCK、3F-DCK、4F-DCK的最低檢出限分別為0.2、0.3、0.4 ng/L，最低定量限均為1.0 ng/L。

表2 線性參數、檢出限和定量限

2.3.2 精密度和準確度實驗

氟胺酮及2種位置異構體在不同質量濃度下的準確度為94.7%~101%，日內精密度和日間精密度為2.7%~8.1%，詳見表3。

表3 污水中氟胺酮及2種位置異構體的精密度、準確度、回收率和基質效應

2.3.3回收率和基質效應

空白污水樣品基質的基質效應平均值見表3。結果表明：空白污水樣品基質對氟胺酮及2種位置異構體均體現出基質減弱效應；氟胺酮及2種位置異構體的回收率為69.5%~108%。

2.3.4 延遲效應

將氟胺酮及2種位置異構體混合標準溶液加入空白污水基質中，配制成質量濃度為500 ng/L的添加樣品。按照實驗方法對其平行測定6次，每個添加樣品進樣后增加3針空白流動相進樣，以監測不同來源污水的高濃度添加樣品的延遲響應。結果表明：高濃度進樣的各目標物殘留響應值低于其各目測物定量限響應值的10%，這說明高濃度延遲對水樣中各目標物測定結果的影響可忽略不計。

2.4 實際樣品分析

按照實驗方法對華南地區某省一縣級市8個疑似有氟胺酮濫用的污水處理廠（含泵站）的實際樣品進行分析，每個樣品測定2次，以堿型質量濃度計算，氟胺酮及2種位置異構體的測定結果見表4。

表4 8個城市污水樣品中氟胺酮位置異構體的測定結果（ng/L）

北京大學李喜青教授團隊于2022年首次發表污水中氟胺酮（2-FDCK）的檢測和評估方法，通過污水監控分析了國內氟胺酮的濫用水平呈逐年遞減的趨勢。本研究監控的8個位點的氟胺酮與李喜青教授報道的國內濫用水平符合性較好。目前，國內外針對氟胺酮的檢測尚未涉及氟胺酮的位置異構體，從檢測結果來看，我國部分地區已少量存在3F-DCK濫用的情況。為科學評估、有效監管氟胺酮及其位置異構體的濫用水平，各地可根據毒情形勢適時建立對應的分析和評估方法。

3 結論

本文建立一種可同時檢測城市污水中氟胺酮及2種位置異構體的固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜分析方法，該方法具有較高的準確度和可靠性，為精準掌握氟胺酮及2種位置異構體的濫用信息提供了技術保障。