慈菇消脂丸抗肝纖維化作用機制的探討

尹碩，馬燕花，王莉，王愛娣，趙秀萍

（甘肅中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000）

0 引言

非酒精性脂肪性肝炎（NASH）以肝細(xì)胞脂肪變伴壞死性炎癥和/或纖維化為主要特征[1]，是非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）發(fā)生發(fā)展過程當(dāng)中的重要階段。我國NASH患者中，發(fā)生肝纖維化、肝硬化，甚至肝癌的人數(shù)約有三分之一。NASH患者肝纖維化平均7～10年進展一個等級[2]。由于目前臨床尚無治療肝纖維化特效藥物[3]，因此，闡明NASH相關(guān)性肝纖維化發(fā)病機制并尋找有效的治療藥物顯得十分重要。

慈菇消脂丸由課題組自擬處方，整體組方以解毒化痰、消降濁脂為主，慈菇消脂丸的主要成分有山慈菇、澤瀉等，山慈菇有化痰解毒、消脂散結(jié)的功效[4]。臨床與基礎(chǔ)研究證實，中藥慈菇消脂丸具有治療脂肪肝、抗炎、抗纖維化等作用[5]。在實驗研究中用慈菇消脂丸對NASH相關(guān)肝纖維化進行干預(yù)治療，以明確中藥復(fù)方慈菇消脂丸通過調(diào)控Hedgehog(Hh)信號通路發(fā)揮抗肝纖維化的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康成年SD雄性大鼠(8周齡+，SPF級)60只，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，動物許可證號SCXK(甘)2015-0002，飼養(yǎng)于相對濕度50%-60%、溫度(22±2 )℃的環(huán)境中。

1.2 藥物制備

慈菇消脂丸組方主要包含了以下14味中藥：山慈菇10g，法半夏15g，茯苓20g，柴胡12g，丹參20g，土鱉蟲20g，薏苡仁30g，黃芩10g，澤瀉15g，枸杞20g，生山楂20g，生首烏30g，決明子20g，炙甘草10g，均購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。使用2L冷蒸餾水浸泡將藥材30 min，武火煮沸后，繼續(xù)使用文火保煎煮半小時。第一次過濾后，將藥渣倒入1.5 L冷蒸餾水再次煎煮。待第二次過濾后，把2次濾液合并到一起，過夜后，離心去除沉淀，在蒸發(fā)皿中濃縮上清液。濃縮為慈菇消脂丸高劑量（3.6 g/mL），稀釋1倍為慈菇消脂丸中劑量(1.8 g/mL)，稀釋2倍為慈菇消脂丸低劑量(0.9 g/mL)，制備完成后，保存在4℃冰箱中備用[6]。前期實驗中確定了藥物制備條件，多次實驗中均成功制備，藥物較為穩(wěn)定。

1.3 儀器

α-SMAantibody（GTX100034）、Shhantibody（GTX134453）、Collagen Iantibody（GTX41286）、G l i-1抗體antibody（GTX106207）購 自 美 國GeneTex公司；Ptchantibody（ab53715）購 自 美 國Abcam公司；β-actinantibody（YM3028）、Goat Anti Mouse IgG（RS0001）、Goat Anti Rabbit IgG（RS0002）購自Immunoway公司；顯微鏡，日本奧林巴斯IX51；切片機，德國LEICA2135。

2 方法

2.1 實驗分組

60只大鼠標(biāo)準(zhǔn)食水適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后，隨機分為六組：①正常對照組（n=10）；②模型組（n=10）；③鹽酸吡格列酮片陽性組（n=10）；④慈菇消脂丸低劑量組（n=10）；⑤慈菇消脂丸中劑量組（n=10）；⑥慈菇消脂丸高劑量組（n=10）。

2.2 造模

通過高脂飲食的喂養(yǎng)，以建立大鼠非酒精性脂肪性肝炎模型。正常對照組：使用普通標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)大鼠，同時按l0mL/kg鼠重灌服生理鹽水，每日1次；模型組：給予高脂飼料（高脂飼料:88%基礎(chǔ)詞料+10%豬油+2%膽固醇）喂養(yǎng)，同時按l0ml/kg鼠重灌服生理鹽水，每日1次；鹽酸吡格列酮片陽性組：在高脂飼料喂養(yǎng)的同時按鹽酸吡格列酮片1.35g/g體質(zhì)量進行灌胃，每日1次；慈菇消脂丸高、中、低劑量組：在高脂飼料喂養(yǎng)的同時給予l0ml/kg鼠重相應(yīng)濃度中藥灌胃，每日1次。高劑量組：按人等效劑量12倍量即0.648g/100體重；中劑量組：按人等效劑量6倍量即0.324g/100g體重；低劑量組：按人等效劑量3倍量即0.162g/100g體重。造模12周后，將實驗動物先禁食水12小時，再稱取各組體重并記錄。大鼠麻醉后，打開腹腔，迅速完整切除肝臟，并且盡量在一致部位進行切取，固定于4%中性甲醛溶液，以備后續(xù)用于組織病理學(xué)的觀察；余下的新鮮肝組織為后續(xù)可用于提取總RNA以及蛋白，及時保存在-80℃冰箱中。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 HE染色觀察肝組織病理變化

石蠟包埋肝組織切成厚度4μm的組織切片。組織脫蠟后，按照HE染色試劑盒說明對切片進行HE染色。

2.3.2 免疫組化檢測肝組織Gli-1、Ptch、Shh、CollagenI及α-SMA蛋白表達(dá)

石蠟切片脫蠟后，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，使用檸檬酸鈉緩沖液置于微波爐內(nèi)100℃8 min ，60℃25 min進行抗原修復(fù)，自然冷卻至室溫后，PBS洗3次，3%過氧化氫對內(nèi)源性過氧化物酶活性進行阻斷，PBS洗3次，血清封閉30 min，滴加一抗（Gli-1、Ptch、Shh、CollagenI、α-SMA及β-actin）4℃孵育過夜，PBS洗3次，滴加二抗（除使用β-actinantibody后滴加Goat Anti Mouse IgG，其余滴加Goat Anti Rabbit IgG），PBS洗3次，DAB顯色，蘇木素染核，0.4%鹽酸乙醇分化，自來水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，樹脂封片，將封好的片子使用數(shù)據(jù)掃描切片機自動掃描，并觀察肝組織中Gli-1、Ptch、Shh、CollagenI及α-SMA蛋白表達(dá)情況，采用Image J軟件統(tǒng)計作積分光密度(IOD)值半定量分析。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 大鼠肝組織形態(tài)學(xué)觀察

在光鏡下觀察，正常對照組染色均勻，肝臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，肝板呈條索狀，肝竇也未見充血、出血和水腫，小葉內(nèi)肝細(xì)胞排列整齊成肝細(xì)胞索，肝細(xì)胞無損傷壞死。模型組與正常對照組比較，正常小葉結(jié)構(gòu)的完整性被破壞，肝細(xì)胞排列紊亂，有較多的肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性，有大量的脂肪充斥，胞質(zhì)染色較淺。治療組可見肝細(xì)胞索排列出現(xiàn)紊亂，伴有脂肪充斥，細(xì)胞變性，但與模型組相比，結(jié)構(gòu)較為完整，充斥大量脂肪的情況均出現(xiàn)好轉(zhuǎn)，且隨著慈菇消脂丸藥物濃度的增大好轉(zhuǎn)情況更為顯著，其中高劑量組和鹽酸吡格列酮片陽性組效果最好，接近正常對照組。見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織形態(tài)學(xué)觀察(HE，x200)

4.2 采用免疫組化技術(shù)檢測Gli-1、Ptch、Shh、CollagenI及α-SMA的表達(dá)水平

免疫組化結(jié)果顯示，模型組中Gli-1、Ptch、Shh、CollagenI及α-SMA陽性染色廣泛存在于纖維間隔及周圍肝細(xì)胞胞漿中，胞核無明顯著色，正常對照組中CollagenI、α-SMA陽性染色可少量見于纖維間隔和周圍肝細(xì)胞胞漿中，而Gli-1、Ptch、Shh蛋白在正常對照組幾乎不表達(dá)。根據(jù)正態(tài)性和方差齊性檢驗結(jié)果，各組P＞0.05，均符合正態(tài)分布，基于均值的P＞0.05，各組方差齊。與正常對照組比較，模型組大鼠Gli-1、Ptch、Shh、CollagenI及α-SMA呈深褐色，胞漿陽性染色顯著增強（P＜0.05）；與模型組相比，慈菇消脂丸高、中、低劑量組及鹽酸吡格列酮陽性組Gli-1、Ptch、Shh、CollagenI及α-SMA在胞漿呈棕黃色，陽性染色均出現(xiàn)下調(diào)（P＜0.05），且隨慈菇消脂丸劑量增加，表達(dá)降低更為明顯；與鹽酸吡格列酮陽性組相比，除高劑量組Gli-1、Ptch、Shh、CollagenI及α-SMA和中劑量組α-SMA較陽性組沒有明顯差異外，慈菇消脂丸中、低劑量組中Gli-1、Ptch、Shh、CollagenI及α-SMA表達(dá)水平較陽性組均有升高（P＜0.05）。見表1，圖2，圖3。

圖3 免疫組化技術(shù)檢測肝組織相關(guān)因子Gli-1、Ptch、Shh、CollagenI及α-SMA的表達(dá)水平

表1 免疫組化技術(shù)檢測肝組織相關(guān)因子Gli-1、Ptch、Shh、CollagenI及α-SMA的表達(dá)水平（±s）

表1 免疫組化技術(shù)檢測肝組織相關(guān)因子Gli-1、Ptch、Shh、CollagenI及α-SMA的表達(dá)水平（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與陽性組比較，cP＜0.05。

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圖2 慈菇消脂丸對非酒精性脂肪性肝纖維化大鼠肝組織Gli-1、Ptch、Shh、CollagenI及α-SMA免疫組化的影響(免疫組化，x200)

5 討論

NASH可向纖維化發(fā)展，實現(xiàn)肝纖維化病理進程的逆轉(zhuǎn)已成為可能，但目前對于NASH相關(guān)性肝纖維化復(fù)雜的發(fā)病機制尚不完全了解[1]。有研究[2]證明，Hh信號通路對于肝組織的生長、分化、模式化和血管化的調(diào)節(jié)起到重要作用，可參與肝組織的纖維化過程。肝星狀細(xì)胞的活化是造成肝纖維化的中心環(huán)節(jié)[3]，Hh信號通路的激活可以促進靜止期的HSC向肌纖維母細(xì)胞HSC分化[4]，使細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，形成肝纖維化[5]。在Shh、Ihh和Dhh三種Hh同源基因的Hh同源配體中[6]，Shh配體的分布更加廣泛，目前的研究較多。Hh配體、兩個跨膜受體smo和patched、一些中間轉(zhuǎn)移分子和下游轉(zhuǎn)錄因子Gli家族是Hh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的主要組成部分[7]。Hh配體缺乏時，Ptch可結(jié)合Smo，抑制Smo蛋白活性，從而抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄[12]。Hh配體存在時，能夠與Ptch結(jié)合，恢復(fù)Smo的蛋白活性，激活下游Gli-1等靶基因，進一步啟動轉(zhuǎn)錄過程[8]。

目前還未有特異有效的藥物進行治療，而中藥及其活性成分具有多層次、多靶點的作用特點，能夠充分發(fā)揮綜合優(yōu)勢[9]。NASH相關(guān)性肝纖維化的中醫(yī)治療需要解毒祛濕、疏肝活血、治肝補脾、滋補肝腎[10]。慈菇消脂丸的主要成分中的山慈菇有化痰解毒、消脂散結(jié)的功效；澤瀉、山楂有祛脂化濁的作用；丹參、土鱉蟲可逐瘀通絡(luò)；柴胡、黃芩、法半夏可以疏肝理脾；決明子能夠清肝降脂[6-7]，通過臨床與基礎(chǔ)研究證實，中藥慈菇消脂丸具有治療脂肪肝、抗炎、抗纖維化等作用。

本研究HE染色結(jié)果顯示，模型組有大量的脂肪充斥，胞質(zhì)染色較淺，肝細(xì)胞排列紊亂。而經(jīng)過慈菇消脂丸治療后，出現(xiàn)好轉(zhuǎn)，肝組織病變明顯減輕，隨著藥物濃度的增大顯著減少，高劑量效果最好，和鹽酸吡格列酮片陽性組的治療效果都接近對照組，由此表明，慈菇消脂丸可有效抑制大鼠肝纖維化。

本研究免疫組化，模型組大鼠肝組織中Hh信號通路關(guān)鍵因子Gli1，Ptch，Shh，肝纖維化因子CollagenI及α-SMA胞漿中陽性染色呈深褐色，表達(dá)水平較正常對照組均有升高（P＜0.05）。不同劑量慈菇消脂丸組和陽性組在胞漿呈棕黃色，與模型組比較，Gli-1、Ptch、Shh、CollagenI及α-SMA的含量均降低（P＜0.05），且隨慈菇消脂丸劑量增加，治療效果明顯。與鹽酸吡格列酮陽性組相比，除高劑量組Gli-1、Ptch、Shh、CollagenI及α-SMA和中劑量組α-SMA較陽性組沒有明顯差異外，慈菇消脂丸中、低劑量組中Gli-1，Ptch，Shh，CollagenI及α-SMA表達(dá)水平均高于陽性組（P＜0.05）。研究結(jié)果表明，實驗12周后，在采用高脂飼料建立NASH大鼠模型中，可能通過激活Hh信號通路，上調(diào)Gil-1和Ptch表達(dá)，并且促進肝纖維化CollagenI及α-SMA的表達(dá)。慈菇消脂丸能夠降低Hh信號通路相關(guān)因子、肝纖維化相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)，提示Hh信號通路得到抑制，并顯著減輕肝組織脂肪變性程度和炎癥反應(yīng)，抑制纖維化進程，且高劑量組藥物組的效果好于低、中劑量組，與陽性組的治療作用相近。由此表明，慈菇消脂丸抑制大鼠肝纖維化的作用，與Hh信號通路激活有關(guān)。

綜上所述，表明慈菇消脂丸可通過抑制Hh信號通路發(fā)揮抗肝纖維化的作用，能明顯抑制Hh信號通路的激活，并能顯著減少肝組織膠原纖維的生成，對于非酒精性脂肪性肝病、肝纖維化等具有一定的干預(yù)作用。但NASH相關(guān)性肝纖維化信號通路較為復(fù)雜，慈菇消脂丸對其他通路是否有影響尚未可知，有待進一步研究。