駱馬湖國(guó)家級(jí)水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)20種魚(yú)類(lèi)的COI條形碼構(gòu)建和分析

李大命，劉 洋,2，劉燕山，張彤晴，殷稼雯，張 偉，穆新武，蔣琦辰

(1.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇省內(nèi)陸水域漁業(yè)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210017；2.南京師范大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇南京 210046；3.江蘇省駱馬湖漁業(yè)管理委員會(huì)辦公室，江蘇宿遷 223800)

我國(guó)是魚(yú)類(lèi)資源較為豐富的國(guó)家之一，近幾十年來(lái)，受氣候變化、環(huán)境污染、過(guò)度捕撈及水利工程的影響，我國(guó)漁業(yè)資源量銳減，物種多樣性和遺傳多樣性下降，嚴(yán)重威脅漁業(yè)資源可持續(xù)發(fā)展利用。快速、準(zhǔn)確鑒定魚(yú)類(lèi)，是科學(xué)保護(hù)和管理魚(yú)類(lèi)資源的前提和基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的魚(yú)類(lèi)鑒定是建立在魚(yú)類(lèi)形態(tài)特征基礎(chǔ)之上，對(duì)分類(lèi)人員的專(zhuān)業(yè)知識(shí)和鑒定能力要求較高。另外，由于魚(yú)類(lèi)的生物棲息環(huán)境多樣，其形態(tài)結(jié)構(gòu)易受到地理環(huán)境和不同發(fā)育階段的影響，且魚(yú)類(lèi)“同種異形”和“異種同形”現(xiàn)象廣泛存在，給魚(yú)類(lèi)種類(lèi)鑒定造成困難。

DNA條形碼(DNA barcoding)技術(shù)是通過(guò)對(duì)一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)目的基因的DNA序列進(jìn)行分析而進(jìn)行物種鑒定的技術(shù)，該技術(shù)具有不受樣品性別、發(fā)育階段、形態(tài)學(xué)變化限制的優(yōu)點(diǎn)，且可以使物種鑒定過(guò)程實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化和信息化，近年來(lái)已成為生物分類(lèi)學(xué)研究的熱點(diǎn)。線粒體COI基因的進(jìn)化速度比核DNA快，所積累的遺傳變異足以區(qū)分近緣種，且該基因容易被通用引物擴(kuò)增，因此COI基因被選定為動(dòng)物界物種鑒定的標(biāo)準(zhǔn)基因。目前，COI基因作為DNA 條形碼在魚(yú)類(lèi)的物種鑒定和多樣性分析上也得到廣泛應(yīng)用，且已經(jīng)建立了多個(gè)魚(yú)類(lèi)條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)，為開(kāi)展魚(yú)類(lèi)物種鑒定提供了便利。

建立水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)是水產(chǎn)種質(zhì)資源就地保護(hù)的一種有效形式，對(duì)保護(hù)水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)揮了重要作用。經(jīng)原農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)，駱馬湖國(guó)家級(jí)水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)于2009年批準(zhǔn)成立，保護(hù)區(qū)總面積3 160 hm，其中核心區(qū)面積1 000 hm，試驗(yàn)區(qū)面積2 160 hm。保護(hù)區(qū)的主要保護(hù)對(duì)象是鯉魚(yú)和鯽魚(yú)。近年來(lái)，有關(guān)駱馬湖漁業(yè)資源調(diào)查的研究已有較多報(bào)道，但鮮見(jiàn)有關(guān)駱馬湖魚(yú)類(lèi)DNA條形碼的研究報(bào)道。該研究通過(guò)PCR擴(kuò)增和測(cè)序，獲得了駱馬湖國(guó)家級(jí)水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)20種魚(yú)類(lèi)的COI條形碼，并對(duì)COI基因序列特征、種內(nèi)與種間遺傳距離及分子系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析，探索COI條形碼在魚(yú)類(lèi)物種鑒定和分類(lèi)中的適應(yīng)性，以期為保護(hù)區(qū)魚(yú)類(lèi)資源保護(hù)和可持續(xù)開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

該研究魚(yú)類(lèi)樣本來(lái)源于2019年4月和9月對(duì)保護(hù)區(qū)開(kāi)展的漁業(yè)資源監(jiān)測(cè)所得漁獲物。根據(jù)《江蘇魚(yú)類(lèi)志》對(duì)魚(yú)類(lèi)樣本進(jìn)行種類(lèi)鑒定，所分析的20種魚(yú)類(lèi)樣本信息及其分類(lèi)地位見(jiàn)表1。剪取魚(yú)類(lèi)樣品背部的肌肉組織置于95%乙醇中保存，用于后續(xù)基因組DNA提取。

表1 魚(yú)類(lèi)樣品信息及分類(lèi)地位

采用TaKaRa公司的廣譜型基因組DNA小量試劑盒提取魚(yú)類(lèi)樣本的基因組DNA，并對(duì)DNA的完整性進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將DNA保存于-20 ℃冰箱備用。

采用魚(yú)類(lèi)DNA條形碼通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列F1：TCAACCAACCACAAA GACATTGGCAC，R1：TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA。PCR反應(yīng)體系為50 μL，其中包括0.4 μL聚合酶(5 U/μL)、4 μL dNTP (2.5 mmol/L)、5 μL 10×PCR Buffer (含Mg)，上、下游引物各2 μL (10 mmol/L)，2 μL DNA模板，剩余部分超純水補(bǔ)足。PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s,共30個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃再延伸10 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送上海生工生物工程股份有限公司純化并進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序引物與擴(kuò)增引物相同。

利用BioEdit 7.0.5.3軟件讀取原始序列并進(jìn)行人工校對(duì)，采用Clustal X1.83軟件對(duì)序列進(jìn)行多重比對(duì)分析，獲得長(zhǎng)度一致的同源序列，并在NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ blast.cgi) 和BOLD (http://www.boldsystems.org)分別進(jìn)行相似性檢索。采用DnaSP 6.12.03軟件定義序列的單倍型。利用MEGA 7.0軟件統(tǒng)計(jì)序列的堿基組成、變異位點(diǎn)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)、單一信息位點(diǎn)等，并基于Kimura′s 2-parameter雙參數(shù)替代模型計(jì)算不同分類(lèi)界元間的遺傳距離。采用鄰接法(neighbor-joining,NJ)構(gòu)建單倍型分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，并進(jìn)行1 000次自展分支檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

通過(guò)PCR擴(kuò)增、測(cè)序和分析，共獲得20種魚(yú)類(lèi)的201條COI基因條形碼序列，COI條形碼長(zhǎng)度為630 bp。COI序列堿基的平均含量分別為A 24.4%、C 28.3%、T 28.5% 和G 18.8%，堿基A+T的含量(52.9%)高于G+C的含量(47.1%)，表現(xiàn)出明顯堿基組成偏倚性，符合多數(shù)魚(yú)類(lèi)線粒體COI序列的堿基組成特征。另外，各密碼子的堿基含量差異明顯，第1密碼子位點(diǎn)G+C的含量(58.8%)明顯高于第2和第3密碼子位點(diǎn)G+C的含量(分別為44.2%和38.5%)。所有COI序列沒(méi)有插入或缺失位點(diǎn)，保守位點(diǎn)有379個(gè)，變異位點(diǎn)有251個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)有239個(gè)，單一信息位點(diǎn)有12個(gè)。

表2 不同分類(lèi)界元間的遺傳距離

基于20種魚(yú)類(lèi)的COI基因序列，構(gòu)建COI序列單倍型NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖1)。從圖1可以看出，同一種類(lèi)的所有個(gè)體都聚為一支，且置信度很高，20種魚(yú)類(lèi)全都形成了單系類(lèi)群，與基于形態(tài)學(xué)的物種鑒別一致。且同一屬內(nèi)、科內(nèi)、目?jī)?nèi)的不同種類(lèi)也能很好的聚類(lèi)，形成了獨(dú)立的進(jìn)化分支，表明COI條形碼對(duì)于不同分類(lèi)界元的魚(yú)類(lèi)具有廣適性。

圖1 基于COI序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1 NJ phylogenetic tree constructed based on COI sequence

3 討論與結(jié)論

近20年來(lái)，DNA條形碼技術(shù)發(fā)展迅速并被廣泛應(yīng)用，它突破了分類(lèi)學(xué)只能依靠形態(tài)特征來(lái)完成的傳統(tǒng)，為分類(lèi)學(xué)開(kāi)辟了一條新的途徑，將完成一些傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定手段無(wú)法完成的工作。隨著魚(yú)類(lèi)DNA條形碼序列的積累和全球魚(yú)類(lèi)條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)的建立，DNA條形碼在魚(yú)類(lèi)物種鑒定的準(zhǔn)確性進(jìn)一步提高，應(yīng)用范圍也越來(lái)越廣泛。

截至目前，線粒體的COI基因是動(dòng)物DNA條形碼研究中使用最為廣泛的標(biāo)準(zhǔn)基因，它具有DNA條形碼理想序列的3個(gè)基本判斷標(biāo)準(zhǔn)：①序列變異水平適宜；②變異區(qū)域兩端的序列高度保守；③序列長(zhǎng)度適宜且易于獲得。一般來(lái)說(shuō)，基于DNA 條形碼進(jìn)行物種鑒定取決于2個(gè)方面:①同一物種的種內(nèi)遺傳距離要小，不同物種的種間距離要大，且種間距離要明顯大于種內(nèi)距離；②在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上，同一物種的不同個(gè)體能聚為同一分支。有研究指出，利用線粒體COI 基因作為條形碼對(duì)物種鑒別時(shí)認(rèn)為種內(nèi)的遺傳距離不得大于0.02， 且種間距離至少是種內(nèi)距離的10倍以上才可有效判別物種。該研究首次獲得了駱馬湖國(guó)家級(jí)水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)20種魚(yú)類(lèi)的COI條形碼序列，并計(jì)算了各個(gè)分類(lèi)單元的遺傳距離。結(jié)果顯示，20種魚(yú)類(lèi)的種內(nèi)遺傳距離均小于0.02，種內(nèi)遺傳距離平均值為0.002 9；種間遺傳距離為0.008 0～0.308 8，平均值為0.202 5，種間遺傳距離為種內(nèi)遺傳距離的70倍。從系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)來(lái)看，20種類(lèi)魚(yú)類(lèi)均形成單系群，說(shuō)明基于COI條形碼對(duì)魚(yú)類(lèi)進(jìn)行物種鑒別是可行和有效的。該研究結(jié)果進(jìn)一步證明了COI條形碼在魚(yú)類(lèi)鑒定中的適用性，也補(bǔ)充和豐富了魚(yú)類(lèi)條形碼數(shù)據(jù)。另外，科內(nèi)屬間的遺傳距離平均為0.150 3，目?jī)?nèi)科間的遺傳距離平均值為0.206 1，目間的遺傳距離平均為0.236 4，表明遺傳距離隨著分類(lèi)階元的提高而增大，且不同的目科屬內(nèi)的種類(lèi)也都獨(dú)立聚為一支，說(shuō)明COI條形碼對(duì)于高階分類(lèi)單元的系統(tǒng)進(jìn)化分析也有重要的參考價(jià)值。

線粒體的COI基因作為DNA條形碼在不同生物類(lèi)群中應(yīng)用的有效性得到了越來(lái)越多的驗(yàn)證，COI通用引物的廣泛適用性也已在魚(yú)類(lèi)研究中得到良好證明。然而，COI條形碼在近緣?mèng)~類(lèi)物種鑒定過(guò)程中仍存在一定局限性。比如，該研究中大鰭鱊和興凱鱊的種間遺傳距離較小，僅為0.008 0。還有研究表明，光澤黃顙魚(yú)與瓦氏黃顙魚(yú)和長(zhǎng)須黃顙魚(yú)以及長(zhǎng)須黃顙魚(yú)與瓦氏黃顙魚(yú)的種間遺傳距離均小于種內(nèi)遺傳距離的10倍。因此，對(duì)于親緣關(guān)系較近的魚(yú)類(lèi)，可以選擇其他DNA條形碼(線粒體Cytb基因或控制區(qū)序列)和COI條形碼聯(lián)合進(jìn)行物種鑒定和進(jìn)化分析，以獲得更加準(zhǔn)確的結(jié)果。