基于SSR標記的我國主栽日本栗品種(系)遺傳結構分析和指紋圖譜構建

聶興華 劉 松 王碧瑤 李 琰 練蔓青 秦 嶺,2 鄭瑞杰 邢 宇,2,*

(1 北京農學院植物科學技術學院，北京 102206；2 林木分子設計育種高精尖創新中心，北京 102206；3 遼寧省經濟林研究所，遼寧 大連 116000)

栗營養含量高，脂肪含量低，富含核黃素和多種維生素，具有良好的可食用價值和藥用價值，是世界上重要的干果作物[1-2]?，F今公認的栗屬植物共有7個種，分別為錐栗[Castaneahenryi(Skam)Rehd.et Wils.]、板栗(CastaneamollissimaBl.)、茅栗(CastaneaseguiniiDode)、歐洲栗(CastaneasativaMill.)、日本栗(CastaneacrenataS.et Z.)、美洲栗[Castaneadentata(Marsh.)Brokh.]和美洲榛果栗(CastaneapumilaMill.)[3-4]。日本栗，又稱丹東栗，主要分布于日本、韓國、朝鮮以及我國遼寧和山東地區。我國現今分布和栽培的日本栗有兩個分支，其一為20世紀20年代由朝鮮傳入山東適應暖濕環境的文登栗，其二為位于丹東市和遼南地區適應干旱寒冷環境的丹東栗[3]。日本栗不僅具有堅果大、適應性強、耐寒、豐產性高等優點，而且對栗疫病、墨水病等病害表現出較好的抗性，是世界各地栗屬植物獲取抗性基因的重要親本?，F階段育種者已培育出諸多抗性強、豐產性高的歐日、中日雜交品種[5-8]。近些年，隨著日本栗良種在我國東北部省區的不斷推廣，其經濟效益與生態效益得到顯著提升，已發展成我國遼寧省山區的主要支柱產業[9]。中國板栗和日本栗在歷史上有著相互引種且部分生態區域重合，種間漸滲類型較多，特別是日本栗品種選育譜系分類不清，加上各產區使用沒有標簽的接穗進行繁殖，導致日本栗品種資源混亂的現象，資源鑒定的研究較為滯后。因此，探究科學有效的分子鑒定方法，對日本栗品種(系)資源保護利用具有重要意義。

上世紀80年代以來，隨著分子標記技術不斷發展，該技術被廣泛應用于植物的遺傳多樣性、遺傳圖譜、指紋圖譜和數量性狀位點(quantitative trait locus, QTL)分析[10-13]，其中簡單重復序列(simple sequence repeat，SSR)具有共顯性、穩定性、可重復性和多態性等特點，是諸多分子標記中應用最為廣泛的標記之一。在日本栗的最新研究中，SSR主要用于遺傳多樣性和性狀關聯分析等領域。2018年Nishio等[14]利用SSR和單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)對99份日本栗資源進行關聯分析，挖掘了12個與堅果性狀相關的分子標記。2020年Nishio等[15]使用36個SSR分子標記對230份日本栗品種資源和中國板栗品種資源進行遺傳多樣性評估和親緣關系分析，闡明了日本栗和中國板栗品種之間具有很高雜交育種前景。2021年Terakami等[16]利用374個SSR分子標記構建了日本栗的遺傳圖譜，并定位到與垂枝性狀相關的標記位點。日本栗雖然在世界栗屬種質資源中發揮著非常重要的作用，但是目前有關日本栗與其他栗屬植物的親緣關系和日本栗主栽品種分子鑒定的研究卻鮮有報道。基于此，本研究全面收集我國主栽日本栗品種，并利用熒光SSR分子標記對124份栗屬植物資源進行親緣關系分析，解析日本栗的分類地位和日本栗品種的遺傳結構，旨在為日本栗在栗屬植物中的分類地位和應用價值提供支撐；并構建59份日本栗主栽品種的指紋圖譜，以期為日本栗在繁殖過程中品種的純度和品種的獨特性提供基礎數據，為今后日本栗的資源的鑒定和種質創新提供參考，同時為日本栗品種知識產權的保護提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究的供試材料采于2019—2021年，共計124份，詳細信息見表1，包括30份板栗資源、13份錐栗資源、22份茅栗資源和59份日本栗品種(系)資源，其中日本栗采自遼寧經濟林研究所日本栗資源圃。每份供試材料采集嫩葉6片，液氮冷凍后，-20℃條件保存于低溫冰箱。

表1 124份供試材料信息表

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取 板栗基因組DNA提取采用改良的十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium bromide, CTAB)方法[17]。提取DNA后，使用1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop One分光光度計(Thermo Fisher Scientific, 美國)分別檢測DNA的質量和濃度，并將每份DNA的濃度稀釋至20～50 ng·μL-1以備擴增使用。

1.2.2 SSR分子標記的來源 本試驗使用的17對SSR引物由北京農學院板栗分子發育生物學實驗室前期篩選所得[17]，詳細信息見表2。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

表2 17對SSR引物的信息

1.2.3 毛細管電泳SSR-PCR擴增體系 擴增體系20 μL：1 μL DNA底物、10 μL 2×Taq Plus PCR MasterMix(Biomed, 北京)、10 μmol·L-1正向引物(0.1 μL)、10 μmol·L-1反向引物(0.3 μL)、10 μmol·L-1含熒光標記(FAM,HEX,ROX或TAMRA)的M13引物(0.2 μL)(擎科，天津)和8.4 μL ddH2O。使用T100 PCR儀(Bio-Rad, 美國)進行擴增。PCR反應程序：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸30 s，36個循環；72℃延伸10 min。10℃條件下保存。

1.2.4 毛細管電泳位點信息檢測 將不同熒光的PCR擴增產物混合在一起，然后使用ABI 3730XL DNA測序儀(Applied Biosystems，美國)進行位點信息檢測，再使用Gene Marker v 2.2.0軟件(Soft Genetics LLC，美國)精準讀取片段大小。

1.3 數據分析

使用PowerMarker 3.25[18]和GenAlEx 6.51[19]軟件進行計算，包括多態信息含量(polymorphism information content, PIC)、主要等位位點頻率(major allele frequency, MAF)、等位位點數量(number of alleles,Na)、遺傳多樣性(genetic diversity,GD)、期望雜合度(expected heterozygosity,He)、鑒別概率(probability of identification,PI)等遺傳多樣性指標。使用PowerMarker 3.25評估各資源間的Nei’s遺傳距離，并使用FigTree v1.4.3構建UPGMA聚類樹。使用Structure 2.3.3[20]的貝葉斯模型進行群體結構的分析，參數迭代次數(length of burnin period)設置為 10 000，馬爾可夫鏈重復次數(number of MCMC Reps after burnin)設置為100 000。使用GenAlEx 6.51對供試資源進行主坐標分析(principal co-ordinates analysis, PCoA)。使用Prism 9.0進行指紋圖譜的圖像化處理。

2 結果與分析

2.1 日本栗的親緣關系與聚類特點

為了了解日本栗在東亞栗屬的分類地位及其與其他栗屬植物的親緣關系，本試驗加入了13份錐栗、22份茅栗和30份板栗資源進行聚類和群體結構分析。結果顯示(圖1-A、C)，整個東亞栗屬植物為單系群，存在明顯的種間界限。錐栗位于所有資源的基部位置，板栗位于次基部位置，隨后日本栗和茅栗組成了一個姊妹系。說明日本栗與茅栗具有較近的親緣關系。同時在聚類分析中發現，板栗資源CM-18聚于茅栗資源，結合群體結構分析結果顯示，CM-18資源中11.8%遺傳成分來之茅栗，判定其為種間雜種。

日本栗品種資源單獨聚類結果顯示(圖1-D)，所有資源主要分為2個分支，其中資源CC-12(遼栗23號)、CC-14(08-3)、CC-18(208)、CC-22(寬優9113)、CC-27(927)、CC-43(遼丹58)、CC-44(9912)、CC-45(遼栗15號)、CC-55(包營獨果)和CC-58(遼丹61)等10份來源于我國的日本品種(系)資源組成了簇1(Cluster 1)；其余日本栗品種資源獨立一支組成簇2(Cluster 2)，包括25個日本本土品種資源、8個朝鮮半島品種資源和16個中國品種資源且均為已知中日雜交品種(系)，其中5個朝鮮半島品種位于Cluster 2的基部位置。

注：A：124份栗屬植物的系統發育樹；青色部分為日本栗，紫色為茅栗，粉色為板栗，綠色為錐栗；B：不同K值的ΔK分布；C：124份供試材料的群體結構；D：日本栗品種的種內系統發育樹；藍色部分為Cluster 1，紅色部分為Cluster 2。

2.2 日本栗品種資源的遺傳多樣性

對59個日本栗品種進行熒光毛細管電泳檢測，在17對SSR引物中共獲得131個等位位點(表3)。每個基因座上的等位位點(Na)為5～13，平均值7.706個；主效等位位點頻率(MAF)為0.194～0.732，平均值為0.442；觀察雜合度(Ho)為0.068～0.831，平均值為0.568；期望雜合度(He)為0.370～0.875，平均值為0.689；多態信息含量(PIC)為0.373～0.815，平均值約為0.605；香農指數(I)為0.733～2.233，平均值為1.459。以上數據表明，選用的SSR標記具有豐富的多態性，供試日本栗品種(系)資源具有較高雜合度且遺傳多樣性豐富。

2.3 日本栗品種資源的群體結構與主坐標分析

為了進一步評估日本栗品種資源的遺傳特征，本試驗利用structure 2.3.3和GenAlEx 6.51進行了群體結構和主坐標分析(圖2)。結果顯示，當K=2時，ΔK有最大值，表明59份日本栗品種(系)資源最佳可為兩個類群。大部分資源為混合類型，說明兩個分群之間存在著廣泛的雜交現象，其中組1中Q值大于0.8的資源分別是CC-12(遼栗23號)、CC-14(08-3)、CC-18(208)、CC-22(寬優9113)、CC-27(927)、CC-34(山大)、CC-35(1401)、CC-43(遼丹58號)、CC-44(9912)、CC-45(遼栗15號)、CC-55(包營獨果)和CC-58(遼丹6號)，這些品種與聚類樹Cluster 1的資源一致，分別是中國境內的日本栗品種(系)，同時也與主坐標分析中組1聚類資源一致。組2 Q值大于0.8的資源共13個，分別是CC-1(有磨)、CC-3(1903)、CC-7(紫峰)、CC-8(芳養玉)、CC-11(遼栗10號)、CC-13(伊吹)、CC-19(武藏)、CC-20(國見)、CC-21(石槌)、CC-25(出云)、CC-26(兔山9號)、CC-31(大丹波)和CC-32(1703)，其中日本本土品種9個，中國品種3個、朝鮮半島品種1個。當K=3時，CC-8(芳養玉)、CC-25(出云)、CC-53(大國)、CC-3(1903)、CC-37(玉光)、CC-49(農林8號)、CC-9(黃豐)和CC-15(燒鍋8號)等組成了新的分群。綜上可知，中國境內的日本栗品種與日本本土的日本栗品種存在一定程度的分化，且各資源間存在著頻繁的基因交流。

注：A：利用structure 2.3.3計算不同K值的ΔK分布，K代表樣品分群個數，ΔK值越大支持所對應的K值越合理；B：品種資源的群體結構；C：品種資源的主坐標分析(PCoA)。紅色圈為部分中國境內的資源，藍色圈主要是日本和朝鮮半島的資源，其中綠色主要是日本本土的資源。

2.4 日本栗品種的指紋圖譜構建

通過17個SSR分子標記的位點檢測，共獲得多態性和可重復等位位點組成的232個基因型?；诨蚍中蛿祿贕enAlex 6.51中對59個日本栗品種進行了多基因座匹配分析，未檢測到基因型完全一致的兩個品種，表明在59個日本栗品種都有其獨特的SSR多位點基因型組合。為了評估17個分子標記的指紋識別能力，計算了兩個關鍵統計值PI和PIsibs(表3)。結果表明，每個引物的PI值范圍為0.028(CmSI0922)～0.424(CmSI0614)，平均值為0.151。假設所有標記位點獨立分離，兩個隨機個體在所有17個引物中存在完全相同多位點基因型的概率估算為3.471×10-16。PIsibs被定義為PI上限，17個SSR標記的PIsibs在0.319(CmSI0922)～0.574(CmSI0396和CmSI0561)之間，平均每個位點為0.443，組合的PIsibs為7.764×10-7。

表3 17對SSR分子標記在59個日本栗資源的遺傳數據

根據位點組合數據，計算了17個SSR標記在不同標記數量隨機組合下的識別能力，以評估能完全區分所收集的日本栗品種需要的標記數量。結果顯示，當3個SSR標記相結合時，PI值接近0，說明在標記數為3時，所有收集日本栗品種可以被獨立鑒定(圖3)。根據核心標記選擇原則和基因型數據結果，本試驗篩選出3個SSR分子標記作為核心標記。首先選擇具有較高PIC值和較低PI值的CmSI0922，該引物將59個品種獨立分為32組，從所有品種中獨立分離出14個品種。當添加第二個標記(CmSI0702)進行進一步分析時，可以唯一識別59個品種中的48個，占所有品種資源的81.36%。添加第三個(CmSI0658)標記進行分析時可以完全區分59個日本栗品種，而3個核心標記的PI和PIsibs組合分別為2.256×10-4和5.184×10-2，隨后總結了這些核心標記的等位基因大小和頻率(圖4)。由此，本研究使用這3個核心標記以熱圖的形式構建了59個日本栗品種的指紋圖譜(圖5)，其中每個標記有兩個等位位點組成，每列中的一個顏色代表一個變異位點信息。

注：PI為兩個隨機個體具有相同基因型的平均概率，PIsibs為從一個種群中隨機發現具有相同基因型的兩個個體的概率。

圖4 核心引物的位點頻率

注：每種顏色框代表一個等位位點，其中白色框代表缺失位點；縱坐標為品種編號，橫坐標為核心標記號。

3 討論

3.1 日本栗品種的遺傳多樣性與群體結構

SSR分子標記作為第二代分子標記技術，隨著基因組學和轉錄組學的普及，其開發利用也得到前所未有的發展，現階段已經被廣泛應用于動植物資源鑒定、物種遺傳多樣性以及遺傳圖譜構建等各種遺傳相關領域[15，17]。國際植物新品種保護聯盟(International union for the protection of new varieties of plants, UPOV)建議使用SSR分子標記作為構建植物DNA指紋圖譜的首選方法[21]。SSR分子標記的多態性、穩定性和可重復性的好壞程度決定著相關遺傳研究的有效性和成功與否[22-23]。本研究為了獲得更有效的基因分型，使用了前期篩選的17對高效SSR引物[17]。17對SSR引物在59份日本栗資源中共檢測到131個等位位點，每個標記平均有7.706個等位位點，位點數量高于Muller等[24]、Jiang等[25]和Terakami等[16]關于栗屬植物SSR位點的報道；各基因座的PIC變幅為0.375～0.815，平均值為0.605。所有標記中有4個標記的PIC在0.25～0.50之間，表現出中等多態性；13個標記的PIC大于0.50，說明選用的SSR引物表現出高多態性，能夠準確地評估供試日本栗品種的遺傳特點。59份日本栗品種資源的雜合度變幅為0.389～0.857，平均值為0.685，與Nishio等[26]關于日本栗雜合度的計算結果一致，表現出較高的雜合度。這一現象是栗屬植物的典型特征，究其原因是由于栗屬植物為自交不親和植物，同域內的栗屬植物僅有通過雜交才能繁衍所致[17,27]。同時，日本栗雜合度略高于板栗品種的0.652[17]，說明日本栗品種資源間存在較高頻率的雜交事件，這一特點在日本栗群體結構的分析中也得到了驗證：各個資源可以觀察到有來自不同分群不同程度的遺傳成分。與中國板栗品種的PIC值和香農指數(I)[17]相比可知，日本栗品種的多樣性略低于中國板栗，推測有兩方面的原因：其一為本試驗的供試品種資源數量相比板栗品種較少；其二為日本栗進化地位較低，物種本身的多樣性較低。

3.2 日本栗的分類地位與日本栗品種的聚類特征

栗屬植物系統發育樹的結果顯示，日本栗和茅栗具有較近的種間親緣關系，這一結果與聶興華等[28]的研究結果一致；而Lang等[6]和Kang等[2]利用葉綠體序列聚類分析的結果則顯示日本栗位于栗屬植物的基部位置，出現了明顯的核質沖突現象。核質沖突現象通常認為是由趨同進化、譜系分選不完全和雜交或基因漸滲三方面因素造成的[29]。栗屬植物屬內共7個種，其譜系分選明確，本研究推測日本栗在漫長的歷史演化過程中可能保留著栗屬植物祖先種的葉綠體信息，由于日本栗與其他栗屬植物在歷史上發生過多世代的基因漸滲，進而導致現今的日本栗核信息與日本栗祖先種已經發生了顯著分化。

日本栗品種的種內系統發育樹、群體結構和主坐標分析一致支持中國境內的部分日本栗品種獨立形成一個分支。日本栗品種間存在著較為豐富的基因交流，尤其是朝鮮半島的品種資源大多為混合類型，這與其所在的地理位置密切相關。

3.3 引物的鑒別能力與日本栗栽培品種(系)的指紋圖譜

傳統園藝果樹和經濟林木鑒別主要以形態分類法為主，而種內家系、雜交系、無性系等形態上較難區別，利用分子標記構建的指紋圖譜能夠檢測到的在分子水平上的位點變異，實現簡單、快速和有效的資源鑒別[30]。本研究在基因分型后，對PI和PIsibs這兩個指紋識別的重要指標進行計算，使用17個SSR分子標記進行多位點匹配計算后，其值分別為3.471×10-16和7.764×10-7。Waits等[31]認為當PI約為1×10-4～1×10-2時，便可以鑒定出隨機出現的大多數自然個體，表明本研究選用的SSR分子標記識別具有巨大潛力。為了快速鑒定日本栗資源，本研究根據多位點匹配分析的結果，確定了至少需要3個核心引物才能完全匹配到有唯一對應的指紋信息，并利用PIC和PI兩個參數對17個SSR標記進行評估篩選，最終確定CmSI0922、CmSI00702和CmSI0658作為核心引物，3個核心引物的PI為2.256×10-4，也在Waits等[31]建議的范圍之內。隨后本研究利用3個核心引物構建了日本栗品種(系)資源的圖像化指紋圖譜，該圖譜能夠完全區分59份日本栗品種?，F階段中國板栗品種的指紋圖譜已經構建完成[14]，日本栗品種指紋圖譜的補充為栗屬植物的資源鑒定和保護利用提供了有力支撐。

4 結論

日本栗與中國的茅栗具有較近的種間親緣關系，相比其他栗屬植物,日本栗栽培資源分布范圍較狹窄，但是其具有較為豐富的遺傳多樣性。此外，通過遺傳分析發現中國境內的部分日本栗品種(系)相對獨立，且各品種(系)間存在較為廣泛的基因交流。本研究利用3個核心引物構建完成了能夠完全區分59份日本栗品種(系)的指紋圖譜，為今后日本栗資源的保護與利用提供了理論參考。