黃秋葵MYB轉錄因子的鑒定及與果實老化關系分析

李永平 白昌輝 薛珠政 朱海生 溫慶放

(福建省蔬菜遺傳育種重點實驗室/福建省農業科學院作物研究所，福建 福州 350013)

黃秋葵(HibiscusesculentusL.)，錦葵科草本植物，含有豐富的蛋白質、脂肪、纖維素、多糖等物質[1]，同時，幼果中含有大量果膠、牛乳聚糖、阿拉伯聚糖和豐富的膳食纖維[2]，是一種高檔保健蔬菜[3]。黃秋葵的食用價值較高，但其采收期短；坐果5～7 d內采收適宜，之后果莢快速老化，口感堅韌難嚼，食用性差[4]；采收后常溫保存1～2 d即失去商品性。

有研究發現，黃秋葵果實老化的生理過程中果莢的維管束細胞壁增厚，纖維素、木質素等大量積累[5-6]。植物次生細胞壁由纖維素、半纖維素和木質素交織構成，除了大量的蛋白與酶參與植物細胞壁的生物合成外，還受到轉錄因子的級聯調控[7]。在植物體內的50多個轉錄因子家族中，參與次生細胞壁合成的轉錄因子主要有NAC(NAA、ATAF 1/2、CUC 1/2)和MYB(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homology)類轉錄因子[8]。MYB類轉錄因子是植物中數量最龐大、功能最多的轉錄因子家族。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中已發現近200個MYB成員[9]。植物細胞周期、新陳代謝及環境響應等眾多生命活動都有MYB類轉錄因子的作用。隨著生物科學研究的發展，植物中越來越多的MYB類轉錄因子被鑒定和分析，已成為研究植物基因功能和表達調控的熱點[10]。

植物MYB轉錄因子參與眾多生物學過程，包括細胞壁組分合成及類黃酮代謝途徑等多種初生和次生代謝反應過程，對纖維素、木質素和木聚糖生物合成與沉積，以及次生細胞壁形成具有重要的調控作用[10]。擬南芥的AtMYB46[11]、AtMYB83、AtMYB58[12]、AtMYB63、AtMYB52、AtMYB54、AtMYB69和AtMYB85[13]正調控纖維素、木質素、木聚糖和半纖維素的合成，影響植物次生細胞壁的形成；AtMYB103調控纖維素的合成，以及參與花粉孢子外壁的形成[14]。擬南芥中AtMYB4、AtMYB32和AtMYB68負調控根部木質素累積[15]。火炬松(Pinustaeda)中PtMYB4[16]和PtMYB8[17]、楊樹(Populus)中MYB6[18]以及蘋果桉(Eucalyptusgunnii)中EgMYB2[19]等基因均在次生木質部特異表達，調控整個次生壁的合成；金魚草(Antirrhinummajus)的AmMYB308、AmMYB330[20]和蘋果桉中EgMYB1[21]的過表達均能抑制木質素的合成和次生細胞壁形成。黃秋葵中MYB46、MYB83 調節黃秋葵果實纖維素合成[5]。本研究通過顯微鏡觀察其細胞組織結構變化，測定黃秋葵果實發育過程和采后貯存的纖維素、木質素等含量變化，明確其老化原因；并分析黃秋葵MYB家族的10個基因生物序列特征及果實不同時期的表達與纖維素、木質素含量的相關性，初步明確MYB轉錄因子在黃秋葵老化過程中的作用，以期為黃秋葵的生產、分子育種等提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植物材料為種植于福建省農業科學院蔬菜研究室的綠色黃秋葵品種臺灣五福。取健康果實[花后2、4、6、8、10 d果實，分別記為花后2、4、6、8、10 d，以及商品果(花后6 d果實)在常溫下貯藏0、1、2、3、4 d，記為采后0、1、2、3、4 d]，每個處理隨機取3個果實混合取樣，3次重復，液氮處理后，-80℃條件下保存備用。

1.2 黃秋葵果實細胞組織的形態結構觀察

將1.1中試驗材料于保存前去芯去籽，迅速放入甲醛-乙酸-乙醇(formalin-aceto-alcohol, FAA)固定液中固定24 h，然后用植物軟化液(G1115，武漢塞維爾公司)軟化14 d。參照改良的石蠟包埋法[22]制作石蠟切片。將脫蠟的切片用蒸餾水清洗，再將切片放入5%鹽酸間苯三酚染色液中染色2～5 min，之后進行蒸餾水沖洗、透明封固。1×51光學顯微鏡(Olympus，日本)下觀察、拍照。木質化的細胞壁呈紫紅色，纖維素細胞組織呈藍綠色。

1.3 纖維素和木質素提取和測定

采用硫酸蒽酮比色法測定纖維素含量[23]、滴定法測木質素含量[24]。差異顯著性分析采用SPSS 19軟件。

1.4 轉錄組測序

將1.1中的10個處理樣品置于干冰中，寄往廣州基迪奧生物科技有限公司，采用Illumina HiSeqTM 2500 PE125系統進行RNA-seq轉錄組測序，經Trinity序列組裝，過濾獲得49.6 G的有效數據。

1.5 基因的生物信息學分析軟件

用primer premier 5.0軟件設計引物序列，ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/0)分析基因蛋白的結構與理化性質；在線軟件線分析工具ProtComp 9.0(http://linux1.softberry.com)預測分析黃秋葵MYB蛋白亞細胞定位；在線軟件Smart預測蛋白序列保守結構域；使用NetPhos2.0Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)軟件預測磷酸化位點；MEGA 5.0軟件構建進化樹。

1.6 實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)分析

依據獲得的黃秋葵MYB全長序列和黃秋葵Actin(GenBank: MG792 349.1)，應用primer premier 5.0軟件設計熒光定量PCR特異引物(表1)。使用Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(ABI，美國)，進行實時熒光定量PCR反應。反應體系為25 μL：PCR Master Mix 12.5 μL，cDNA 1 μL，10 μmol·L-1正反向引物各0.5 μL，加蒸餾水至總體積25 μL。反應程序：95℃預變性45 s；95℃變性5 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，40個循環。每個反應設3重復，應用ABI 7500軟件中的ΔΔCT法分析處理數據并得出目的基因的表達情況。

表1 黃秋葵MYB基因驗證與表達的引物

2 結果與分析

2.1 黃秋葵果實細胞組織的形態結構觀察

觀察鹽酸間苯三酚染色的石蠟切片，纖維素細胞組織呈綠色，木質素為紫紅色。由圖1可知，隨黃秋葵果實的生長發育，維管束中細胞的細胞壁呈階梯式增厚，花后2～6 d有增厚但不明顯，花后8 d有明顯的增厚，花后10 d增厚更加明顯；薄壁細胞在花后2～6 d變化不大，花后8～10 d細胞壁中有一定程度增厚。維管束中細胞的細胞壁在采后0～1 d細胞壁增厚不明顯，2～4 d細胞壁增厚明顯。

注：鹽酸間苯三酚染色200倍視野；G2：花后2 d；G4：花后4 d；G6：花后6 d；G8：花后8 d；G10：花后10 d；T0：采后 0 d；T1：采后1 d；T2：采后2 d；T3：采后3 d；T4：采后4 d；標尺為100 px。

2.2 黃秋葵果實纖維素含量測定

隨著黃秋葵果實生長發育，果實中的纖維素含量呈增加趨勢，但在花后4～6 d，每相鄰2 d的纖維素含量雖有增加，但差異不顯著，花后6、8和10 d，果實的纖維素含量增加顯著。黃秋葵果實采后處理中，果實采后0～4 d中，纖維素的含量持續顯著增加，木質素則在采后2～3 d后增加顯著(表2)。

表2 黃秋葵果實發育過程、果實采后處理的纖維素和木質素含量

2.3 黃秋葵MYB基因鑒定

從黃秋葵果實轉錄組測序數據庫中篩選得到10條功能注釋為MYB基因的Unigene序列，分別為MYB4(Unigene0000800)、MYB6(Unigene0002945)、MYB26(Unigene0037799)、MYB28(Unigene0024424)、MYB44(Unigene0007347)、MYB46(Unigene0036406)、MYB59(Unigene0043914)、MYB86(Unigene0064389)、MYB108(Unigene0040179)、MYB113(Unigene0031002)。如圖2所示，上述10個MYB基因在10個不同處理中均呈現表達差異模式，其中MYB59和MYB113在果實發育進程中呈現下調表達模式，MYB4、MYB6、MYB26、MYB28、MYB44、MYB46、MYB86、MYB108基因表達呈現上調模式；MYB46、MYB59、MYB108在采后常溫貯藏1～4 d的果實中的表達量呈上調模式，MYB4、MYB6、MYB26、MYB28、MYB44、MYB86、MYB113則表現為下調。(圖2)

圖2 MYB基因在黃秋葵果實RNA-seq數據庫的表達分析

2.4 目的基因克隆及序列分析

從黃秋葵果實轉錄組測序數據庫中篩選得到MYB4、MYB6、MYB26、MYB28、MYB44、MYB46、MYB59、MYB86、MYB108、MYB113基因序列，設計引物進行驗證。經回收、連結、轉化、測序，結果表明，MYB4(登錄號：MW363898)、MYB6(登錄號：MW363900)、MYB26(登錄號：MW363897)、MYB28(登錄號：MW363910)、MYB44(登錄號：MW363896)、MYB46(登錄號：MW674793)、MYB59(登錄號：MW363901)、MYB86(登錄號：MW363904)、MYB108(登錄號：MW363905)、MYB113(登錄號：MW363907)基因的全長分別為837、864、909、1 434、1 242、990、627、1 223、861、717 bp，上述基因編碼的蛋白分別為278、287、302、477、413、329、208、440、286、238 AA。

2.5 基因的生物信息學分析

2.5.1 編碼蛋白的理化性質分析 如表3所示，經克隆驗證獲得10條黃秋葵MYB的基因全長序列，編碼的蛋白208～477 AA，分子量在27 460.13～53 726.88 Da 之間，脂肪族氨基酸指數為56.68～78.48，均為親水性蛋白，不穩定系數在43.86～67.38之間。HeMYB6、HeMYB26、HeMYB86為堿性，其余7個MYB為弱酸性。10個MYB的蛋白都定位于質膜上。

表3 黃秋葵MYB基因家族蛋白理化性質

2.5.2 蛋白磷酸化位點和保守結構域分析 蛋白質磷酸化是生物體內調節和控制蛋白質活力和功能的最基礎、最重要的蛋白活性調節機制，在細胞信號轉導中起著至關重要的作用[25]。使用NetPhos 2.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)軟件預測10個HeMYB轉錄因子的磷酸化位點(圖3)，絲氨酸(Ser，S)磷酸化位點最多為39個，蘇氨酸(Thr，T)磷酸化位點最多為18個，酪氨酸(Tyr，Y)磷酸化位點最多為7個。說明HeMYB 轉錄因子的磷酸化以絲氨酸磷酸化為優勢，同時兼有蘇氨酸和酪氨酸磷酸化。

圖3 MYB 轉錄因子的磷酸化位點數量

利用Smart進行保守結構域分析，結果顯示除HeMYB59蛋白N末端均含有1個SANT結構域，其余9個HeMYB均含串聯的2個R2R3-MYB型轉錄因子的典型SANT結構域；HeMYB4、HeMYB6、HeMYB28、HeMYB44含有1個ZnF結構域；HeMYB6、HeMYB86、HeMYB108含有1個CARD結構域；HeMYB4、HeMYB46、HeMYB59含有1個FA結構域；HeMYB46含1個KNOX2結構域，KNOX2是同源二聚化所必需的，參與次生細胞壁的合成。

2.5.3 進化分析 將黃秋葵的10個MYB蛋白序列與擬南芥、亞洲棉(Gossypiumhirsutum)、火炬松、毛果楊、蘋果桉等49個MYB蛋白序列進行進化分析(圖4)。49個MYB蛋白形成5個分支，Group I 包含HeMYB6、HeMYB46、HeMYB86、HeMYB26、HeMYB59、HeMYB108等35個MYB蛋白；GroupⅡ包含HeMYB113、亞洲棉MYB113等4個MYB蛋白；GroupⅢ含HeMYB59、AtMYB59、亞洲棉MYB59等3個MYB蛋白；GroupⅣ包含HeMYB44、AtMYB44、亞洲棉MYB44等6個MYB蛋白；GroupⅤ包含HeMYB28。除亞洲棉MYB4、MYB28外，黃秋葵的MYB蛋白與擬南芥、亞洲棉的相應MYB蛋白均在同一分支，且與亞洲棉的MYB蛋白的同源性更高。

圖4 黃秋葵與擬南芥、亞洲棉等MYB家族系統進化樹

2.6 基因表達分析

2.6.1 黃秋葵HeMYB基因家族在果實發育中的表達HeMYB46、HeMYB86、HeMYB44、HeMYB28和，HeMYB26 5個基因在黃秋葵果實發育過程中表達量先上升后下降；HeMYB59的表達量在花后2～8 d基本一致，花后10 d表達量下降，HeMYB86表達量的峰值出現在花后6 d，HeMYB44、HeMYB46、HeMYB26、HeMYB28表達量的峰值出現在花后8 d(圖5-A)。HeMYB4、HeMYB6、HeMYB108在花后表達持續上升，HeMYB4花后8 d表達急劇增強，花后10 d保持高水平表達，HeMYB6在花后6 d表達量迅速增強，花后8～10 d保持平穩表達，HeMYB108則在花后6 d表達量持續增加，尤其在花后8～10 d表達量迅速增加(圖5-B)，HeMYB113在果實發育過程中表達量持續降低。

注：同基因不同小寫字母表示不同花后天數間差異顯著(P<0.05)。下同。

2.6.2 黃秋葵HeMYB基因家族在采后果實中的表達HeMYB46、HeMYB59的表達在采后0～4 d持續增強；HeMYB6、HeMYB44、HeMYB108、HeMYB113果實采后表達量先上升后下降；HeMYB4、HeMYB26、HeMYB28、HeMYB86果實采后0～1 d表達量快速下降，隨后表達量平穩下降(圖6)。

圖6 黃秋葵果實采后MYB的表達

2.7 相關性分析

2.7.1 黃秋葵HeMYB基因家族RNA-seq數據庫的表達與qRT-PCR表達的相關性分析 通過相關性分析發現，黃秋葵HeMYB基因家族RNA-seq數據庫的表達與qRT-PCR表達相關性較好，相關系數R2為0.854 2(圖7)。說明轉錄組RNA-seq測得HeMYB基因的表達量與應用qRT-PCR得到的表達值的變化趨勢基本一致。

圖7 黃秋葵HeMYB基因家族RNA-seq數據庫的表達與qRT-PCR表達的相關性分析

2.7.2 黃秋葵HeMYB基因qRT-PCR表達與纖維素、木質素含量變化的相關性分析 相關性分析發現(表4)，黃秋葵果實發育時期HeMYB46、HeMYB59、HeMYB86、HeMYB108與纖維素含量呈顯著或極顯著正相關，10個基因除HeMYB4、HeMYB28、HeMYB86外均與木質素含量呈顯著或極顯著相關；黃秋葵果實采后處理過程除HeMYB6、HeMYB26外，其余8個基因均與纖維素含量呈顯著或極顯著相關，HeMYB26、HeMYB108外其余8個基因均與木質素含量呈顯著或極顯著相關；HeMYB46、HeMYB86、HeMYB108表達量與纖維素含量呈極顯著正相關，HeMYB46、HeMYB59均與木質素含量呈極顯著相關，HeMYB4、HeMYB113與纖維素、木質素含量呈顯著負相關。

表4 黃秋葵轉錄因子MYB基因家族qRT-PCR表達量與纖維素含量變化的相關性分析

3 討論

許多果實的老化由木質化和纖維化引起，其中木質素和纖維素的產生及調控與果實老化息息相關。黃秋葵果實花后8 d或采后常溫貯存3 d就無法食用，此時果實纖維素和木質素均大量積累，細胞壁增厚明顯[6]。植物MYB轉錄因子參與木質素和纖維素生物合成與沉積，在次生細胞壁形成中具有重要的調控作用。Yang等[26]研究發現，擬南芥AtMYB26基因可以調控花藥內皮層次生細胞壁合成；過量表達AtMYB26基因，可以誘導次生壁合成相關基因的表達，導致次生壁異位沉積。AtMYB46/83、PtrMYB003和PtrMYB020可以激活纖維素、半纖維素和木質素的生物合成導致植株細胞次生壁異位沉積。AtMYB58與AtMYB63是木質素合成的特異調控基因，在次生壁加厚的纖維和導管中發現有上述基因的特異性表達，抑制其表達則會導致次生壁缺陷、木質素含量降低，而過量表達兩者則會激活木質素合成基因的表達且伴隨木質素異位沉積[27]。本研究表明，與次生壁形成相關的MYB轉錄因子具有較高的同源性，在不同物種間的結構和生物學功能較為保守。Du等[28]分析玉米、擬南芥等的MYB序列進化、結構及功能，發現有4個亞組的MYB與木質素合成以及次生壁增厚相關。Zhao等[29]對擬南芥、水稻、玉米、楊樹以及柳枝稷MYB轉錄因子進行功能分組，得到一致的結論。MYB類轉錄因子成員之間同源性越高，其功能的相似程度越大，因此可以通過擬南芥中MYB類轉錄因子家族成員已有的功能研究，預測同一分支上其他MYB類轉錄因子家族成員的功能特性。本研究從黃秋葵果實中獲得HeMYB4、HeMYB6、HeMYB26、HeMYB28、HeMYB44、HeMYB46、HeMYB59、HeMYB86、HeMY108、HeMYB113等10個MYB家族基因，10個MYB基因均定位于質膜上，進化分析發現與擬南芥等物種中參與纖維素和木質素合成的MYB蛋白親緣關系較近，其中，黃秋葵中HeMYB46、HeMYB59、HeMYB86、HeMYB108與次生壁增厚相關的AtMYB58、AtMYB46、AtMYB63、AtMYB85、AtMYB26、PtrMYB020等基因同源性高，黃秋葵中HeMYB4、HeMYB113分別與負調控次生壁合成的AtMYB75、AtMYB68基因同源性高，暗示HeMYB46、HeMYB59、HeMYB86、HeMYB108在黃秋葵次生壁增厚及果實老化過程中起著重要作用。

MYB類轉錄因子基因家族，是一個多基因家族，不同的MYB家族成員在木質素和纖維素生物合成調控及果實老化中的作用可能不同。AtMYB4、AtMYB32、AtMYB58、AtMYB75負調控次生壁合成相關基因的表達，AtMYB32過量表達會造成花藥的扭曲，影響花藥細胞壁的形成[15]，AtMYB75缺失，木質纖維和束間纖維的次生壁加厚增強，纖維素、木聚糖和木質素增加[30]。棉花(GossypiumherbaceumL.)GhMYB1和GhMYB25參與了毛狀體的分化與發育，在煙草中過量表達的GhMYB25葉表皮毛分支增加，相關試驗也證明GhMYB25在有纖維起始細胞中富集表達[31]。煙草中過量表達火炬松PtMYB4和蘋果桉EgMYB2基因，使次生細胞壁加厚顯著并且木質素異位沉積[16,19]。玉米(Zeamays)ZmMYB31通過增強CAD基因的表達，ZmMYB4則下調C4H和CAD的表達，進而影響木質素的積累，玉米ZmMYB31和ZmMYB4過量表達木質素含量降低[32]；柳枝稷(Panicumvirgatum)PvMYB4基因與參與木質素生物合成途徑的基因中AC元素結合，進而影響木質素的合成，過量表達的柳枝稷木質素含量顯著下降[33]。本研究從黃秋葵果實中獲得HeMYB4、HeMYB6、HeMYB26、HeMYB28、HeMYB44、HeMYB46、HeMYB59、HeMYB86、HeMY108、HeMYB113等10個MYB家族基因，利用實時熒光定量PCR分析黃秋葵MYB基因家族10個基因在果實發育過程、采后常溫貯藏的表達，不同黃秋葵MYB基因家族呈現出不同的表達模式。對黃秋葵MYB基因家族表達與纖維素及木質素含量的相關性分析發現，HeMYB46、HeMYB86、HeMY108的表達量與纖維素含量呈極顯著正相關，推測上述基因在黃秋葵果實衰老過程纖維素合成中起重要作用，HeMYB46、HeMYB59的表達量與木質素含量呈極顯著正相關，推測其在木質素合成中起到重要調控作用。本研究初步明確黃秋葵MYB轉錄因子在黃秋葵老化過程中的作用，為黃秋葵的生產、分子育種等提供理論基礎。

4 結論

本研究通過顯微鏡觀察黃秋葵果實發育過程和采后貯藏期間細胞纖維素組織結構變化及纖維素含量變化，發現纖維素和木質素大量積累是黃秋葵果實老化的主要因素。通過對10個HeMYB基因的生物信息及qRT-PCR表達分析，推測在黃秋葵果實老化過程中，HeMYB46、HeMYB86、HeMYB108對纖維素合成起重要作用，HeMYB46、HeMYB59對木質素合成起重要調控作用；HeMYB46、HeMYB59、HeMYB86、HeMYB108在黃秋葵果實老化中起重要調控作用。