蘆薈苷通過調控JAK1/STAT1和TLR4/NF-κB信號通路改善大鼠腦缺血再灌注損傷

蔡亮，張炳東

（廣西醫科大學第一附屬醫院麻醉科，廣西 南寧 530021）

0 引言

腦卒中已經成為威脅人類生命健康的第二大疾病，每年約有1500萬新發病例[1,2]。病理學將腦卒中分為兩大類：缺血性腦卒中（Cerebral Ischemic Stroke，CIS）和出血性腦卒中，其中約85%腦卒中病例屬于缺血性腦卒中。CIS誘因是大腦供血的主要血管栓塞或則體循環功能障礙導致腦組織供血不足。CIS損傷機制為缺血缺氧導致細胞外微環境改變和小膠質等免疫細胞在缺血區被激活釋放炎癥因子[3,4]。與此同時，無氧代謝促使活性氮（Reactive nitrogen species，RNS）、活性氧（Reactive oxygen species，ROS）等自由基水平升高[5]。目前，急性缺血性腦卒中的首選治療方式是通過靜脈注射重組組織型纖溶酶原激活劑（Recombinant tissue plasminogen activator，rt-PA）重建血運。雖然恢復缺血器官的血流對防止組織出現不可逆損傷至關重要，但再灌注本身也可能會導致器官損傷。CIRI并不單獨發生于缺血性腦卒中術后，首先顱內腫瘤和血腫會壓迫病變區域的血管和增加顱內壓，上訴原因會導致局部腦組織出現缺血、缺氧、水腫、壞死等諸多病理改變[5-7]；其次失血性休克和術中心律失常、心臟驟停都會導致體循環功能障礙、血容量不足和血流動力學障礙從而引起腦組織缺血缺氧[8,9]；最后我們發現心肺轉流術（Cardiopulmonary bypass，CPB）治療過程中的持續性低血壓或手術操作也會導致CIRI[10,11]。 JAK1/STAT1信號通路作為一種重要的細胞內信號轉導途徑。研究發現JAK/STAT信號通路不僅與造血、炎癥和免疫相關疾病有著密切聯系，還與細胞生長、增殖和分化有關[12,13]。TLR4/NF-κB信號通路在免疫中起著關鍵作用。研究發現TLR4/NF-κB信號通路激活后不僅能促進星形膠質細胞、小膠質細胞活化并釋放炎癥介質，還會激活金屬蛋白途徑損傷血腦屏障[14-16]。現發現TLR4/NF-κB與JAK/STAT信號通路之間存在串擾，且JAK1/STAT1信號通路參與調控TLR4信號通路轉導的炎癥反應[17-19]。

越來越多的天然植物提取物如姜黃素、兒茶素被應用于醫療領域，從天然植物中獲得外源性抗氧化劑已經被作為減輕疾病氧化損傷的重要新策略。蘆薈苷作為蘆薈的天然提取物，屬于天然酪氨酸酶抑制劑，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、等多種生物活性[20,21]。蘆薈苷的腦保護作用已有一定前期研究，基礎研究發現蘆薈苷具有減輕神經系統疾病腦水腫、血腦屏障破壞、神經炎癥、神經元凋亡、氧化應激和改善認知功能障礙的作用[22,23]。鑒此，本實驗擬從信號通路、細胞凋亡、炎癥方面探索蘆薈苷改善腦缺血再灌注損傷中的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藥品和試劑

蘆薈苷（selleck公司），白介素10(IL-10)ELISA試劑盒（武漢華美公司），腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA試劑盒（武漢華美公司），蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒（索萊寶公司），TaKaRaMiniBEST Universal RNA Extraction Kit（TaKara公司），PrimeScript? RT Master Mix（TaKara公司），TB Green? Premix Ex Taq? II Tli RNaseH Plus（TaKara公司）, JAK1抗體（abcam公司），STAT1抗體（CST公司），p-STAT1抗體（abcam公司），TLR4抗體（abcam公司）, NF-kB抗體（abcam公司），p-NF-kB抗體（abcam公司），Caspase-3抗體（abcam公司），Bcl-2抗體（abcam公司），GAPDH抗體（abcam公司），β-actin抗體（BIOSS公司）。

1.1.2 實驗動物

健康雄性SD大鼠75只，體重250g～280g，SPF級，購自于廣西醫科大學實驗動物中心。動物合格證號：SCXK（桂）2014-0002，實驗動物使用許可證號：SCXK（桂）2014-0003。本實驗符合廣西醫科大學動物實驗倫理要求。

1.2 方法

1.2.1 動物的分組及處理

75只SD雄性大鼠隨機分為對照組（C組，n=25）、模型組（M組，n=25）和治療組（A組，n=25）。A組和M組參照楊麗[24]等人實驗采用線栓法構建大鼠腦缺血再灌注損傷（Middle cerebral artery occlusion and reperfusion，MCAO/R）模型，C組只結扎對應的血管，A組再灌注時腹腔注射50mg/Kg蘆薈苷進行治療。大鼠腦缺血再灌注24小時后及時取材并保存。

1.2.2 longa神經功能評分

參照zea-longa神經行為學評分標準對再灌注24h大鼠進行評分。具體標準為無神經功能缺損為0分；患側前爪不能完全伸展為1分；行走時向患側轉圈為2分；行走時身體向患側傾倒為3分；不能自發行走并喪失意識為4分。

1.2.3 腦梗死面積測定

缺血再灌注24h后取出整個腦組織置于負20℃冰箱冷凍20分鐘，然后將腦組織切分為5-6片，厚度為2mm。將切好的大鼠腦片放入1% TTC溶液中，37 ℃避光染色30分鐘，染色結束后觀察并拍照記錄，采用image J軟件測算梗死面積。

1.2.4 蘇木素-伊紅染色

對缺血再灌注24h的大鼠腦組織進行灌注固定，將灌注固定好的腦組織進行包埋切片，取石蠟切片進行二甲苯脫蠟、梯度酒精水化（100%→95%→90%→80%→70%→50%）后進行蘇木素和伊紅染色，脫水透明處理后封片觀察。

1.2.5 腦組織炎癥檢測

采用大鼠酶聯免疫吸附測定試劑盒檢測缺血再灌注24h各組腦組織IL-10和TNF-α的變化。

1.2.6 qPCR檢測JAK1、STAT1、TLR4和NF-κB轉錄水平

采用TaKaRaMiniBEST Universal RNA Extraction Kit（9767）提取總RNA后再使用PrimeScript? RT Master Mix（036A）進行逆轉錄得到cDNA，最后使用PrimeScript? RT Master Mix（820A）進行PCR擴增實驗。最后以GAPDH基因作為內參基因并根據2-ΔΔCt公式計算目的基因相對表達量。本實驗引物序列如下：

表1 引物序列

1.2.7 采用Western blot實驗檢測信號通路及凋亡相關蛋白表達

使用預冷PBS緩沖液洗去海馬組織血漬，并使用蛋白裂解工作液（RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、蛋白磷酸酶抑制劑，100∶1∶1）裂解海馬組織獲得蛋白上清液。向上清液中加入5×上樣緩沖液后100℃水浴變性。SDS-PAGE電泳使蛋白分離。200 mA 90-120 min（根據分子量大小）將蛋白轉移到PVDF膜上，5%BSA封閉2h，封閉后的條帶放入一抗工作液4℃過夜，TBST緩沖液洗去多余一抗后放入熒光二抗工作液避光孵育2h后顯影，最后采用image J軟件對蛋白條帶進行灰度值分析。

1.2.8 統計學方法

采用SPSS 26.0統計軟件對數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 longa神經功能評分

根據longa神經行為學評分標準評定三組大鼠腦缺血再灌注24h后的神經功能。C組未見神經功能障礙；與C組比較，M組和A組大鼠神經功能受損嚴重（P＜0.01）；與M組比較，A組大鼠神經功能受損減輕（P＜0.01）。

圖1 三組大鼠Longa評分的比較（n=25）

2.2 各組大鼠腦梗死面積比較

M組與A組大鼠腦缺血再灌注24h后出現不同面積的梗死灶，C組未見梗死灶。使用image j軟件測定三組腦組織梗死面積并計算梗死面積百分比。我們發現與C組比較，M組與A組腦組織梗死面積百分比明顯增大（P＜0.05）；而與M組比較，A組腦組織梗死面積百分比顯著減少（P＜0.05）。

圖2 三組大鼠腦組織TTC染色結果（n=5）

圖3 三組大鼠腦組織梗死面積百分比的比較

2.3 各組腦組織病理損傷情況比較

病理顯微鏡觀察各組大鼠海馬組織損傷情況，如下圖所示C組海馬組織細胞排列有序、層次分明，結構清晰完整，核仁明顯和基質清晰均勻；與C組比較，M組海馬神經元數量減少且排列不規整，并出現細胞核固縮、染色加深和彌漫空泡樣變性。通過觀察A組海馬組織，我們發現注射蘆薈苷藥液能改善海馬組織損傷情況。

圖4 各組大鼠海馬組織病理學改變（n=5，放大倍數40×，100×）

2.4 各組腦組織IL-10、TNF-α含量比較

通過酶聯免疫吸附反應檢測大鼠海馬組織中的IL-10、TNF-α變化。我們發現與C組對比，M組和A組海馬組織中的IL-10抗炎因子明顯降低（P＜0.05），與M組相比，A組海馬組織中的IL-10明顯升高（P＜0.05）；與C組對比，M組和A組大鼠海馬組織中的TNF-α炎癥因子明顯增加（P＜0.05），與M組相比，A組大鼠海馬組織中的TNF-α明顯降低（P＜0.05）。

圖5 各組大鼠腦組織TNF-α和IL-10表達水平比較（n=5）

2.5 TLR4、NF-κB、JAK1和STAT1 mRNA在各組腦組織中的表達比較

使用RT-qPCR方法檢測TLR4、NF-Kβ、JAK1和STAT1的轉錄水平。我們發現與C組比較，M組的TLR4、NF-Kβ、JAK1和STAT1的轉錄明顯增加（P＜0.01）；同時與M組相比， A組的TLR4、NFKβ、JAK1和STAT1的轉錄顯著降低（P＜0.05）。

2.6 TLR4/NF-Kβ、JAK1/STAT1信號通路相關蛋白及凋亡蛋白在腦組織中的表達比較

使用image J軟件檢測各組目的蛋白、內參蛋白或總蛋白的灰度值，目的蛋白在海馬組織中相對表達量即為目的蛋白與內參蛋白的灰度值比值或目的蛋白與總蛋白的灰度值比值。如圖6.1所示Caspase3蛋白在M組和A組中表達較C組明顯增加（P＜0.05）；與M組對比，A組Caspase3蛋白的表達明顯降低（P＜0.05）。與此同時，M組Bcl-2蛋白表達較C組明顯被抑制（P＜0.05），而A組Bcl-2蛋白表達較M組顯著增加（P＜0.01）。

圖6 各組大鼠海馬組織TLR4、NF-κB、JAK1、STAT1的mRNA表達水平比較（n=5）

圖6.1 Bcl-2、Caspase3蛋白在三組大鼠海馬組織中的表達比較（n=5）

觀察JAK1/STAT1信號通路相關蛋白在大鼠海馬組織中的表達水平，如圖6.2所示M組JAK1蛋白表達較C組明顯升高（P＜0.05）；與M組相比，A組海馬組織JAK1蛋白水平明顯下降（P＜0.05）。同樣M組海馬組織STAT1蛋白磷酸化水平較C組明顯增高（P＜0.05）；而A組海馬組織STAT1蛋白磷酸化水平較M組明顯降低（P＜0.05）。結果顯示M組海馬組織TLR4蛋白表達水平較C組明顯增高（P＜0.05），而TLR4蛋白在A組海馬組織中的表達水平較M組明顯被抑制（P＜0.05）。同樣，NF-κB蛋白在M組海馬組織中的磷酸化水平較C組顯著增加（P＜0.05）；與M組相比，A組海馬組織NF-κB磷酸化水平明顯下調（P＜0.05）。

圖6.2 JAK1/STAT1和TLR4/NF-κB通路相關蛋白在三組大鼠海馬組織中的表達（n=5）

圖6.3 各組JAK1/STAT1和TLR4/NF-κB通路相關蛋白在海馬組織中的表達比較

3 討論

CIRI涉及腦水腫、神經元凋亡、血腦屏障破壞等病理現象[5]。CIRI不僅存在于缺血性腦卒中的治療過程，也存在于頸部手術術后、術中低血壓以及體外循環過程[8-11]。自由基損傷在CIRI中起著核心作用，大腦是全身耗氧量最高的器官，這種高耗氧量決定了大腦較其他器官更容易產生自由基[5]。現有研究發現引入外源性抗氧化劑有利于減輕腦缺血再灌注所帶來的損傷。蘆薈苷是從蘆薈中提取的主要蒽醌苷，屬于酪氨酸酶抑制劑，具有有抗炎、抗病毒、抗氧化等多種生物活性。

現發現多種藥物改善腦缺血再灌注損傷的機制與JAK1/STAT1和TLR4/NF-κB信號通路有關，同時有研究證明二者之間存在串擾關系[17-19]。神經炎癥是導致CIRI最重要的機制之一，首先TNF-α在CIRI中起著重要作用，它可以增加血管內皮細胞通透性和細胞粘附分子表達，也能促進白細胞浸潤和神經元凋亡的進程[25]；其次NF-κB是調節免疫反應和細胞存活的重要轉錄因子，它主要由缺血再灌注損傷過程中產生的ROS激活，NF-κB可以促進各類炎癥細胞激活并釋放炎癥因子；同時在阿爾茨海默癥中發現NF-κB與Tau蛋白、β樣淀粉蛋白的代謝密切相關，我們認為NF-κB可能與腦缺血再灌注損傷愈后認知功能障礙密切相關[14,15,26,27]。

神經功能評分和腦組織梗死面積能直接反應腦組織損傷情況及蘆薈苷治療效果。本研究結果顯示M組大鼠神經功能受到嚴重損傷，而注射蘆薈苷藥液后能夠明顯改善CIRI引起的大鼠神經功能障礙；TTC檢測CIRI能引起腦組織梗死，而注射蘆薈苷藥液后能夠有效減少大鼠腦組織梗死面積。蘇木精-伊紅染色是最適合觀察組織損傷情況的實驗技術，鏡下發現CIRI引起大鼠腦組織及海馬組織出現大量病理樣改變，而注射蘆薈苷能夠有效改善缺血再灌注誘導的大鼠腦組織損傷。炎癥貫穿CIRI的整個病理過程，并與預后及其他病理機制密切相關；通過分析腦組織中的NF-κB磷酸化和TNF-α、IL-10水平，我們發現蘆薈苷能夠有效抑制CIRI中的神經炎癥。我們使用RT-qPCR和免疫蛋白印記法檢測發現蘆薈苷不僅可以抑制腦缺血再灌注引起的TLR4、NF-κB、JAK1、STAT1 mRNA轉錄，還會抑制TLR4、JAK1蛋白表達水平與NF-κB、STAT1蛋白磷酸化水平。Caspase3蛋白是細胞凋亡信號傳導級聯反應中重要的一環，而Bcl-2蛋白是細胞內重要的抗凋亡蛋白；根據免疫蛋白印記結果我們發現蘆薈苷能夠抑制腦缺血再灌注中的Bcl-2蛋白降低和 Caspase3蛋白升高。

綜上所述，本研究表明蘆薈苷能夠改善腦缺血再灌注損傷，其機制可能JAK1/STAT1和TLR4/NF-κB信號通路有關。