南極菲爾德斯半島潮間帶沉積物細菌的多樣性及分離菌產酶測定

王玉璟, 李勝男, 袁嘉琳, 王 龍, 劉 杰

南極菲爾德斯半島潮間帶沉積物細菌的多樣性及分離菌產酶測定

王玉璟, 李勝男, 袁嘉琳, 王 龍, 劉 杰

(青島科技大學 海洋科學與生物工程學院, 山東 青島 266042)

南極菲爾德斯半島具有多種不同特征的生態地理微環境, 如長城科考站、企鵝島、生物灣與黃金灣流域、半島南部、碧玉灘等。這些區域因水文地質、動植物分布、人類活動程度等不同而具有明顯的生態地理差異。本研究從這些微環境海岸潮間帶采集了7份代表性沉積物樣品, 采用16S rRNA基因高通量測序方法, 對其細菌類群的多樣性以及環境理化因子的影響進行了比較分析; 同時采用常規可培養鑒定方法, 對樣品的分離菌株產酶狀況進行了初步測定。結果表明: 整體上看, 所有樣品的細菌類群主要分布在45門、104綱、442屬當中, 表現出比較高的多樣性。其中, 優勢菌門Proteobacteria主要分布在半島南部、碧玉灘和生物灣潮間帶沉積物中, 優勢菌門Bacteroidetes主要分布在企鵝島兩側和黃金灣潮間帶沉積物, 長城站潮間帶沉積物的優勢門為Firmicutes。相似生態微環境的潮間帶沉積物具有不同的優勢菌門和綱; 而不同生態微環境潮間帶沉積物卻具相同的優勢菌門和綱。有機氮(TON)、銨態氮(NH4+-N)、硝態氮(NO3–-N)、磷酸鹽(PO43–-P)、亞硝態氮(NO2–-N)含量與企鵝島、生物灣、黃金灣潮間帶沉積物的菌群多樣性具有相關性, 其中TON對生物灣樣品的影響最大, 而有機碳(TOC)對所有樣品的影響均較小。分離菌株的產酶實驗表明: 在企鵝島、生物灣、黃金灣等動物頻繁出沒的潮間帶樣品中, 蘊藏著一批產淀粉酶、酪蛋白酶、脂肪酶、七葉苷酶、過氧化氫酶能力較強菌株, 這為今后進一步的應用開發提供了寶貴的低溫產酶菌株來源。

菲爾德斯半島; 潮間帶沉積物; 細菌類群多樣性; 產酶菌株

兩相地帶中以陸、海交匯的潮間帶最為典型, 因受潮漲、潮落影響, 其沉積物的微生物類群也具有不同于陸地與海洋的特征, 并引起國內外廣泛關注。近些年, 研究人員對各類潮間帶沉積物微生物的多樣性[1-5]、抗性[6-7]、產酶[8-9]、污染指示等[10-11]方面進行了研究, 所采用的方法也多種多樣。南極菲爾德斯半島海岸線綿長, 溪流縱橫, 具有南極無冰區典型的生態地理特征, 動植物資源豐富、人類干擾少, 微小特征生境眾多。

本研究針對前期從菲爾德斯半島的企鵝島、生物灣、黃金灣、半島南部碧玉灘、長城站等不同生態地理微環境采集的潮間帶沉積物樣品, 采用16S rRNA基因可變區高通量多樣性測序法對所獲得的細菌群落多樣性組成、樣品理化因子影響等結果、以及通過可培養法獲得的分離菌株產酶情況進行全面比較分析[12]。以期比較全面地了解菲爾德斯半島各種特征微生態環境潮間帶沉積物的細菌多樣性差異, 篩選產酶功能菌株, 為后續研究和應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

沉積物樣品于2017年2月(中國第33次南極科學考察期間)采自菲爾德斯半島(62°8.48′S～62°14.2′S, 58°53.40′W～59°1.50′W)周邊沿海不同區域的潮間帶(表1)。每個采樣點相隔約10 m采集3份深度約5 cm的沉積物(去粗土壤)并均勻混合, 裝入無菌袋中密封帶回長城站實驗室立即用2216E平板進行細菌分離、純化; 同時用試劑盒提取樣品總DNA保存于–80 ℃, 并與分離菌株、沉積物樣品備份一起低溫運回國內。

表1 樣品采集信息

1.2 樣品理化性質測定

樣品理化性質測定包括有機碳(TOC)、有機氮(TON)、銨態氮(NH4+-N)、硝態氮(NO3–-N)、亞硝態氮(NO2–-N)、磷酸鹽(PO43–-P)。樣品去雜凍干處理后研成粉末。其中, TOC、TON取0.2 g, 加入5 mL 10%的HCl, 充分振蕩過夜; 加入3 mL 10% 鹽酸, 放置3 h后, 用超純水清洗7次, 55 ℃烘干, 然后用EA3000元素分析儀(Euro Vector SpA)測定。其他4種營養鹽的測定為: 稱取處理樣品2 g, 加入20 mL超純水振蕩1 min, 48 h內每隔4 h振蕩1 min; 10 000 r/min離心10 min, 上清液0.4 μm膜過濾, 用微流分析儀(QuAAtro, SEAAnalytical GmbH)分析。

1.3 菌株分離及產酶菌株檢測

樣品的菌株分離培養, 采用2216E、R2A、M1海水培養基固體平板15 ℃培養, 劃線分離[2]。

分離菌株的產酶檢測, 采用在含相應底物的固體培養基上點接分離菌, 然后15 ℃培養7～15 d, 觀察是否產水解透明圈或暈圈大小、顯色深淺或產氣泡多少等。其中產酪蛋白水解酶、幾丁質水解酶、淀粉水解酶、纖維素水解酶、黃原膠水解酶、卡拉膠水解酶以菌落周圍是否產生透明圈及大小來判斷, 脂肪酶以產不透明暈圈來判斷, 明膠酶以菌落周圍是否出現液化圈來判斷, 七葉苷酶以菌落周圍有無黑褐色素產生來判斷, 氧化酶以在菌落上滴加1%二甲基對苯二胺鹽酸鹽溶液顯色法判斷, 過氧化氫酶采用菌落覆蓋5% H2O2是否產氣泡判斷[12]。

1.4 樣品總DNA提取和16S rRNA基因高通量測序

沉積物樣品總DNA提取使用土壤DNA提取試劑盒(E.Z.N.A產品), PCR擴增16S rRNA基因的V4-V5可變區。擴增引物為通用515F和907R。高通量測序由專業公司在IlluminaHiSeq2500(PE250)測序平臺完成。

1.5 高通量多樣性測序數據分析

PCR擴增序列去除Barcode及引物序列后拼接, 然后過濾低質量序列和嵌合體序列(最小得分25)[13-14], 得到有效序列用于后續分析。

以97%相似度進行有效序列的聚類及創建OTUs集, 選取每個OTU集中頻數最高的代表序列進行比對和物種注釋獲得分類學信息。

采用Qiime計算α多樣性指數, UPGMA分析β多樣性, 蒙特卡洛、主坐標PCoA、冗余RDA等方法分析樣品理化因子與細菌群落的相關性并繪制分析圖。

2 結果與分析

2.1 測序結果及物種分析

本實驗7份樣品共鑒定出552 355個細菌序列, 其中每個樣品有效序列平均為69 537條。按97%相似度聚類共得到5 494個OUTs集, 平均每個樣品785個OUTs集[12]。

根據OTUs注釋結果, 選取在門、綱水平相對豐富度排名前10、屬水平排名前30的物種類群, 繪制物種相對豐度柱狀圖(圖1、2、3)。

圖1、2、3及其相關數據表明, 7個潮間帶樣品的細菌類群經注釋主要分布在45個門、104個綱、442個屬當中。

在門水平上(圖1), 7個樣品中均存在的門有Bac-teroidetes、Proteobacteria、Planctomycetes和Actino-bac-teria, 且占比較大。其中02、05、07號樣品的優勢門為Bacteroidetes(分別占比42.5%、56.3%、40.1%), 01、04、06號樣品的優勢門為Proteobacteria(分別占比44.9%、51.1%、41.1%), 03號樣品的優勢門為Firmi-cutes (占比48.3%), 但在其他樣品中較少; 另外, Planctomy-cetes在02號樣品中的占比較高(14.2%), Actinobacteria以及Cyanobateria在06號樣品中含量也較多。

在綱水平上(圖2), 7個樣品主要分布在104個綱中。其中01、02、04號樣品的優勢綱為Gamma-proteobacteria(分別占比23.4%、21.5%、25.5%), 05、07號樣品的優勢綱為Flavobacteriia(占比42.1%、27.7%), 06號樣品的優勢綱為Betaproteo-bacte-ria (26.9%)。另外, Bacteroidia只在03樣品中占比較大(約為20%), 而在其他樣品中占比較少(少于3.2%), 且在01號樣品中沒有檢測到; 同時, Bacilli在03、06號樣品中有一定含量(18%、3.9%), 而在其他樣品中的含量均低于0.06%。

在屬水平上的聚類比較復雜(圖3), 共聚類出442個屬。其中01號樣品的優勢屬為(11.84%), 02、07號樣品的優勢屬為(8.9%和6.5%); 03號的優勢屬為(17.28%),和在該樣品中的占比也較高(9.26%、3.53%), 而為該樣品的特有屬; 04樣品的優勢屬為(4.1%), 而為該樣品所特有屬(2.66%); 05號的優勢屬為(5.98%); 06號的優勢屬為(14.69%), 同時屬在該樣品中占比也較高(12.11%), 而該屬在其他樣品中低于0.13%。另外, 7個樣品中均有少量屬。

2.2 樣品內與樣品間物種群落多樣性分析

多樣性分析結果表明(表2), 07號樣品的香農指數(Shannon)和辛普森指數(Simpson)較高, 說明物種多樣性及相對豐度比較高, 而01號樣品相對較低。

表2 α多樣性指數

從多樣性分析看出(圖4), 02、07號樣品的相似度最高(非加權Unifrac距離小于0.1), 其次為樣品05樣品; 而03、06號樣品與其他樣品的相似性均較低, 尤其是03號最低。反映出不同樣本間微生物群落構成及其占比的差異。

基于樣品間物種組成結構相似度的PCoA主坐標分析也表明(圖5, 第一主坐標PC1), 02、05、07樣品的距離十分接近(在同一個象限里), 尤其是02和07號, 說明它們之間的物種組成尤為相似; 雖然01和04號處在另一個象限, 但二者距離相對較遠; 而03和06號樣品分別位于兩個不同的象限里, 且與其他5個樣品相距均很遠, 表明就細菌物種組成結構而言, 此兩個樣品特殊性非常明顯。

2.3 樣品理化因子與物種群落組成相關性分析

本研究對7份潮間帶樣品進行了包括有機碳(TOC)、有機氮(TON)、銨態氮、硝態氮、亞硝態氮磷酸鹽等6項理化因子的測定(表3), 同時結合上述細菌群落數據進行了RDA冗余分析(圖6), 以了解樣品理化因子對造成樣品細菌群落組成差異的影響關系。

表3 樣品的理化性質

注: 表中數據為三次重復測試的平均值。

從表3的7個樣品理化因子看到, 有機碳含量在0.06%～0.4%, 其中04樣品含量最高(0.399%), 01樣品含量最低(0.056%); 有機氮含量均較低且相差不大(0.02%～0.03%); 銨態氮相差比較大(0.5～9.1 μg/g), 其中05號樣品(9.139 μg/g)遠高于其他樣品, 而03號含量最低(0.557 μg/g); 硝態氮相差也比較大(0.6～ 5.5 μg/g), 02號最高(5.486 μg/g), 05號最低(0.694 μg/g); 7個樣品中亞硝態氮含量均不高(0.03～0.5 μg/g), 且相差不大; 而磷酸鹽含量在7個樣品中均較高(2.9～ 7.3 μg/g), 其中05號最高(7.286 μg/g), 03號最低(2.952 μg/g)。

從基于反映環境因子、樣本、菌群之間關系的RDA冗余分析中可以看到(圖6), 樣品02、04、05、07主要分布在第一主成分的負方向上, 同時除TOC外的5種理化因子(TON、NH4+-N、NO3–-N、PO43–-P、NO2–-N)兩兩之間的夾角以及各個理化因子與第一主成分之間的夾角均為銳角, 表明這5種理化因子之間以及與這4個樣品物種組成的相關性比較強。其中02、05、07這3個樣品最為相似, 且與NH4+-N含量的相關性最強, 與TOC的相關性最小; 而04號樣品則受TON含量的影響最大。另外從圖6中還可以看到, 01、06、03號樣品分散在第一主成分的正方向上, 相互之間相距較遠, 且與上述6種理化因子含量之間沒有明顯的相關性。

2.4 可培養法與高通量法優勢菌群的比較

為獲得對菲爾德斯半島潮間帶沉積物細菌物種類群多樣性更全面的了解, 我們在高通量多樣性法測序分析的同時, 還采用常規可培養法對7個潮間帶樣品的細菌進行了分離純化, 并進行了基于16S rDNA序列測定的系統發育鑒定分析[15], 然后就門、綱、屬水平上的結果與高通量測序分析結果進行了優勢菌群類別的比較(數據略)。整體上看, 兩種分析方法結果中的優勢菌群在門、綱水平上的重疊性較大; 而在屬水平上卻差異較大, 尤其是兩種方法在優勢屬上的結果沒有交叉重疊現象。

2.5 分離菌株的產酶情況

在可培養實驗中, 我們針對從7個樣品所分離的45株代表菌進行了淀粉酶、酪蛋白酶、脂肪酶、七葉苷酶、幾丁質酶、明膠酶、纖維素酶、氧化酶、過氧化氫酶等9種酶的產生情況初步測試。

從表4中看到, 45株測試菌株中有6株產淀粉酶能力較強, 2株產酪蛋白酶較強, 14株產脂肪酶較強, 3株產七葉苷酶較強, 5株產過氧化氫酶較強, 但沒發現產幾丁質酶的菌株。這些低溫下產酶能力較強的菌株主要集中在企鵝島、生物灣、黃金灣等企鵝、海豹、鳥類頻繁出沒區域, 這為今后進一步的開發應用提供了難得的菌株來源。

表4 分離菌株產酶情況

注: “–”為無產酶活性, “+”為有產酶活性, “++”為產酶活性較強

3 討論

特殊生境是獲取功能微生物的良好環境。本研究樣品主要來自南極菲爾德斯半島周邊特征微環境的潮間帶沉積物。從高通量多樣性測序結果看, 整體樣品的細菌類群多樣性程度較高(主要分布在45門、104綱、442屬)。其中Proteobacteria、Bacteroidetes為多個微環境的優勢菌門(如半島南部、碧玉灘、生物灣、黃金灣、企鵝島兩側等潮間帶); 而長城站科考站潮間帶的優勢菌門為Firmicutes, 比較單一, 可能與人類和動物的頻繁活動有關。從生態地理上看, 相似生態地理微環境的潮間帶沉積物具有不同優勢菌門、綱或屬(例如: 人和動物稀少的半島南部與碧玉灘, 半島西側的生物灣與黃金灣); 而企鵝島兩側的生態地理環境差異較大, 尤其是企鵝、鳥類數量和陽光照射時長具有明顯差異, 但它們卻有相似的優勢菌門、綱, 這種情況也得到了可培養法鑒定結果的印證。總之, 對于整個菲爾德斯半島潮間帶而言, 其細菌類群組成具有比較高的多樣性, 但其中也表現出一些超乎我們預測的現象, 值得進一步綜合研究。

土壤的理化性質可直接影響土壤細菌群落結構[16-19]。近年來, 對南、北極土壤細菌多樣性主控理化因素影響的研究也較多[20-22]。本研究表明, 從沉積物樣品理化因子與菌群組成關系看, 生態地理環境相似的潮間帶沉積物菌群組成(例如半島南部與碧玉灘, 生物灣與黃金灣等)與有機氮、銨態氮、硝態氮、亞硝態氮、磷酸鹽的相關性均比較強(其中生物灣樣品的菌群組成受有機氮的影響最大)。另外, 有機碳對所有樣品菌群組成的影響均較小。上述樣品間菌群多樣性的差異是否是由此所引起的, 還有待進一步深入探討。

本研究還對可培養分離菌進行過16S rDNA系統發育鑒定分析(數據略)。但從鑒定結果看, 與上述高通量測序分析相比, 優勢菌群在門、綱水平上具有較大重疊; 而在屬水平上卻差異很大, 基本沒有交叉重疊。出現這種現象的原因很多, 首先是2種方法對物種比對注釋的靈敏度和精度范圍不同[23]。高通量測序法是采用16S短序列引物針對整個宏基因組進行的物種多樣性注釋分析, 而可培養分離菌的16S rDNA序列測定則是采用16S長序列引物對單個菌株的序列測定和比對分析。因此前者在門、綱水平上信息量更大, 而在屬水平上的精度要遠低于后者。其次是可培養分離方法的限制。盡管本實驗采用了2216E、R2A、M1三種高、寡營養培養基進行菌株分離, 但分離效果與實際情況還是相差甚遠, 這也是令環境微生物學者十分頭疼癥結所在。但無論怎樣, 可培養分離鑒定是研究、應用實體微生物基本途徑, 將傳統可培養法與現代高通量測序法結合起來, 將會對環境微生物的多樣性做出更加客觀全面的注釋。

另外, 本研究在可培養實驗中, 從企鵝島、生物灣、黃金灣等動物頻繁出沒的微環境潮間帶沉積物中發現了一批產淀粉酶、酪蛋白酶、脂肪酶、過氧化氫酶能力較強的菌株, 這些菌株均為低溫培養菌(15 ℃培養), 其所產上述酶是否為低溫酶、以及產酶條件和酶學性質尚需進一步研究, 但無疑它們極具應用開發價值。

本研究可為全面了解菲爾德斯半島或其他類似極端環境的細菌多樣性及產酶功能菌提供有價值的參考。

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Bacterial diversity and enzyme production by the bacteria isolated from the intertidal regions of the Fildes Peninsula, Antarctica

Wang Yu-jing, Li Sheng-nan, Yuan Jia-lin, Wang Long, Liu Jie

(College of Marine Sciences and Biological Engineering, Qingdao University of Science and Technology, Qingdao 266042, China)

The Fildes Peninsula in Antarctica has diverse ecogeographical microenvironments possessing different characteristics, such as Great Wall Station, Penguin Island, Bio-bay, Golden Bay, south of the peninsula, and Biyu Beach. These regions have certain ecological and geographical differences owing to their distinct hydrogeology, flora and fauna distributions, and human activities. In this study, seven representative sediment samples were collected from coastal intertidal zones of these microenvironments, and the diversity of bacterial communities and the effects of environmental physicochemical factors were analyzed using the 16S rRNA gene high throughput sequencing method. Furthermore, the enzyme production status of culturable isolated strains was preliminarily determined. The results revealed that the bacterial groups in all samples were distributed throughout 45 phyla, 104 classes, and 442 genera, indicating high bacterial diversity. Proteobacteria were primarily distributed in the southern region of the Peninsula, Biyu Beach, and Bio-bay intertidal zones, while Bacteroidetes were mainly distributed in the intertidal zones of Penguin Island and Golden Bay; Firmicutes was the dominant phylum in the intertidal regions of the Great Wall Station. Remarkably, intertidal regions with similar ecological microenvironments had different dominant phyla and classes. However, the intertidal regions from dissimilar ecological microenvironments had the same dominant phyla and classes. The organic nitrogen (TON), NH4+-N, NO3–-N, PO43–-P, and NO2–-N contents were correlated with the bacterial group diversities at the Penguin Island, Biota Bay, and Golden Bay intertidalites. TON had the greatest impact on the Bio-bay intertidalite samples, while organic carbon had little effect on any of the samples. The enzyme producing analysis of the culturable isolated strains revealed a number of strains with a strong ability to produce amylase, casease, lipase, aesculin hydrolase, and catalase in the sediment samples of Penguin Island, Bio-bay, and Golden Bay. Thus, these isolates are valuable sources of low temperature, enzyme producing strains for further research.

Fields peninsula; intertidalite; bacterial group diversity; enzyme producing strains

Jan. 27, 2022

Q346

A

1000-3096(2022)09-0046-09

10.11759/hykx20220127001

2021-01-27;

2022-02-20

國家公共科研院所基本科學基金項目(GY0219Q10)

[Basic Science Fund project of National Public Research Institutes, No. GY0219Q10]

王玉璟(1995—), 男, 漢族, 山東省煙臺市萊陽人, 碩士生, 研究方向: 極端環境微生物資源與應用, E-mail: wangyjdy123@163.com; 劉杰(1963—),通信作者, 碩士生導師, 研究方向: 環境微生物資源、分類與應用, E-mail: jieliu1301@sina.com.cn

(本文編輯: 趙衛紅)