鐵皮石斛楓斗加工前后差異成分比較

劉鵬飛 范 蓓 劉湘丹 楊 洋 盧 聰 佟立濤 孫 晶，* 王鳳忠,*

(1 湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙 410208；2 中國農業科學院農產品加工研究所/農業農村部農產品加工質量安全風險評估實驗室/農業農村部農產品質量安全收貯運管控重點實驗室，北京 100193)

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimaura et Migo)是我國的名貴中藥材之一，主要分布在安徽、浙江、云南、湖南、福建、廣西、四川等地[1]，具有滋陰養津、增強體質、補益脾胃、延年益壽等功效[2-3]，是“中華九大仙草”之魁首。鐵皮石斛中含有多種營養成分，如多糖[4]、酚類[5]、核苷類、苯丙素類、甾類、氨基酸、礦質元素和生物堿[6]、聯芐類[7]等。現代藥理學研究表明，鐵皮石斛在抗氧化[8]、抗腫瘤[9-10]、降血糖[11]、降血壓[12]、抗胃黏膜損傷[13]等方面均具有較好的活性，其中在降血糖方面的作用尤其突出，產生了“治消止渴湯”、“石斛湯”等經典名方治療消渴癥。

鐵皮石斛鮮條由于易腐等特性，常加工成楓斗出售。“楓斗”即鐵皮石斛鮮條除去雜質，剪去部分須根，邊加熱邊扭成螺旋形或彈簧狀，烘干后的加工品。中國農業科學院農產品加工研究所食物營養與功能性食品創新團隊研究發現，鐵皮石斛加工成楓斗后，不但口感、耐儲性得到極大優化，而且對α-葡萄糖苷酶的抑制率增強19.55%(樣品濃度為5 mg·mL-1時，鐵皮石斛楓斗和鮮條的抑制率分別為68.55%和49.00%)(未發表)。因此，鐵皮石斛楓斗加工前后抑制α-葡萄糖苷酶活性的相關成分亟需進一步研究。

楓斗制作過程中，經過了干燥、加箍、烘烤、晾曬等多道工序[14-16]。有學者研究發現，隨著干燥溫度的升高和時間的延長，鐵皮石斛的成分會發生變化，多糖、游離氨基酸和總氨基酸的保留率總體呈現下降趨勢，甘露糖和鼠李糖含量減少，核糖和半乳糖含量增加[17]。除了多糖、單糖等糖類成分之外，鐵皮石斛中聯芐、黃酮等小分子次級代謝產物的作用也不容忽視，而這些成分在楓斗加工過程中的變化規律仍鮮見研究。

本研究采用超高效液相色譜-四級桿串聯飛行時間質譜(ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS)技術，測定鐵皮石斛鮮條和楓斗中的主要小分子代謝產物，結合化學計量學方法，挖掘二者的差異性成分并進行規律性分析，以期明確鐵皮石斛楓斗的加工意義，為闡明鐵皮石斛降血糖物質基礎提供數據支撐，為促進我國鐵皮石斛精深加工和產業發展作出貢獻。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

對照品柚皮素、石斛酚、芫花素、山藥素Ⅲ，質量分數≥ 98%，上海源葉生物科技有限公司；乙腈、甲酸(色譜純)，德國Merck公司；甲醇(色譜純)，江蘇漢邦科技有限公司。

鐵皮石斛鮮條采自云南省龍陵縣，經北京大學藥學院屠鵬飛教授鑒定為鐵皮石斛(D.officinaleKimura et Migo)。

1.2 儀器與設備

Waters ACQUITY UPLC/Xevo G2 QTOF MS超高效液相色譜串聯質譜儀(二元高壓泵、自動進樣器、柱溫箱)，美國Waters公司；Mili-Q 超純水儀，美國Millipore公司；BO-500S2高速多功能中藥粉碎機，永康市鉑歐五金制品有限公司；5430R小型離心機，德國Eppendorf公司；YQ-ZJ-107電子天平，廣州廣電計量檢測股份有限公司；RE-52AA 旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 鐵皮石斛鮮條和楓斗粉末的制備

1.3.1.1 鐵皮石斛鮮條粉末的制備 取適量新鮮的鐵皮石斛，隨機分成6份，切成厚度3～5 mm的斜片，-18℃ 預凍10 h后，置于真空冷凍干燥機中干燥，用高速粉碎機打碎，過65目篩，即得鐵皮石斛鮮條粉末。

1.3.1.2 鐵皮石斛楓斗粉末的制備 取適量鐵皮石斛鮮品，隨機分成6份，切成8～10 cm長條，文火加熱，待石斛軟化后，邊加熱邊用手搓去薄膜狀葉鞘使其成螺旋形或彈簧狀，再進行高溫烘干，即得鐵皮石斛楓斗。將其用高速粉碎機打碎，過65目篩，即得鐵皮石斛楓斗粉末。

1.3.2 溶液的制備

1.3.2.1 對照品溶液的制備 分別取柚皮素、石斛酚、芫花素、山藥素Ⅲ對照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成各成分質量濃度為5 mg·mL-1的對照品溶液。

1.3.2.2 供試品溶液的制備 稱取鐵皮石斛鮮條粉末或楓斗粉末約1.0 g，置于50 mL離心管中，加入30 mL無水甲醇，密塞后搖勻，稱定重量。超聲(功率500 W，頻率40 kHz)提取30 min，放冷，稱定重量。用甲醇補足失重，搖勻，4 000 r·min-1離心20 min，取上清液，濃縮至干，用甲醇復溶至2 mg·mL-1，用 0.22 μm微孔濾膜濾過，即得鐵皮石斛鮮條供試品溶液和鐵皮石斛楓斗供試品溶液。分別從鐵皮石斛鮮條供試品溶液和鐵皮石斛楓斗供試品溶液中取等量溶液，混勻作為質量控制(quality control，QC)樣品，平行6次。

1.3.3 檢測條件

1.3.3.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3 柱子(2.1 mm × 100 mm，1.8 μm)；柱溫35℃；流動相為0.1% 甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～15 min，95%～10% A；15～18 min，10%～0% A；18～23 min，0% A；23～23.01 min，0%～95% A；23.01～28 min，95% A)；流速0.3 mL·min-1；進樣量5 μL。

1.3.3.2 質譜條件 電噴霧離子源(electron spray ionization，ESI)，電源電壓和噴霧電壓為2.23 kV，鞘氣體(氮氣)流速28 arb，輔助氣體流速8 arb，正離子一級全掃描模式，分子量范圍為m/z50～1 200。另將混合對照品溶液和混合供試品溶液做二級質譜分析，有利于色譜峰的鑒定。

1.4 石斛屬植物化學成分數據庫的數據收集與處理

基于數據庫收集文獻中石斛化學成分的結構式與理化信息等。在中國知網數據庫中以“鐵皮石斛”、“流蘇石斛”、“鼓槌石斛”、“金釵石斛”、“紫皮石斛”、“疊鞘石斛”、“霍山石斛”為檢索詞；在PubMed數據庫中以“Dendrobium officinale”、“Dendrobium fimbriatum”、“Dendrobium chrysotoxum”、“Dendrobium nobile”、“Dendrobium devonianum”、 “Dendrobium denneanum ”、“Dendrobium huoshanense”為檢索詞，檢索石斛有關文獻，經過篩選得到石斛的化學成分。將整理得到的化學成分數據以Mysql5.7作為數據庫，使用Druid作為數據庫連接池，部署在阿里云ECS服務器，可在線搜索和分析石斛中的化合物。

1.5 數據處理與分析

本研究通過UPLC-QTOF-MS采用正離子模式進行分析，按1.3.3項條件檢測供試品溶液和混合對照品溶液。將原始數據導入Progenesis QI 2.3軟件進行峰對齊、歸一化等處理，搜索前期建立的石斛屬植物化學成分數據庫(http://39.106.37.83/shihudb/#/homePage)、天然產物數據庫(https://bioinfapplied.charite.de/supernatural_new/)、HMDB數據庫(https://hmdb.ca/)，根據一級和二級質譜碎片，探究裂解規律，結合對照品比對，鑒定化合物的結構。將得到的峰值數據集輸出并導入SIMCA軟件，進行無監督的主成分分析(principal component analysis， PCA)和有監督的正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLS-DA)。選取變量權重值(variable influence on projection， VIP)>1，P<0.05的物質作為差異化合物。

2 結果與分析

2.1 化合物數據庫的建立

查閱7種常見石斛如鐵皮石斛、流蘇石斛、鼓槌石斛、金釵石斛、霍山石斛、紫皮石斛、疊鞘石斛的相關文獻，整理并建立化合物信息數據庫。包括化合物中文名稱、英文名稱、來源植物、分子式、精確相對分子質量、化合物結構等信息，共收集了443個化合物[18]。

2.2 鐵皮石斛鮮條和楓斗的化學計量學分析

鐵皮石斛鮮條和楓斗的總離子流圖如圖1所示。結果表明，出峰時間大多集中在7～20 min，鐵皮石斛楓斗大部分的峰面積值比鐵皮石斛鮮條高，表明鐵皮石斛楓斗的化學成分含量高于鐵皮石斛鮮條的化學成分含量。主成分分析得分圖(圖2-A)顯示，鐵皮石斛鮮條和楓斗分布離散，R2=0.804，Q2=0.671，PCA模型可靠，說明二者化學成分存在一定差異。

注：1：水蘇堿；2：L-苯丙氨酸；3：草質素；4：尼泊金異丁酯；5：柚皮素；6：4,4′-二羥基-3,5-二甲基聯芐；7：諾比林A；8：石斛酚；9：對羥基肉桂酸乙酯；10：Fimbriadimerbibenzyl D isomer；11：4,9-二甲氧基菲-2, 5-二醇；12：鼓槌聯芐；13：芫花素；14：山藥素-Ⅲ；15：Dendronophenol B；16：α-亞麻酸。Note: 1: Stachydrine. 2: L-phenylalanine. 3: Herbacetin. 4: Butylparaben. 5: Naringenin. 6: 4,4′-dihydroxy-3,5-dimethyldibenzyl.7: Norbilin A. 8: Gigantol. 9: P-hydroxyl ethyl cinnamate. 10: Fimbriadimerbibenzyl D isomer. 11: 4,9-dimethoxyphenanthrene-2,5-diol. 12: Chrysotobibenzyl. 13: Genkwanin. 14: Batatasin Ⅲ. 15: Dendronophenol B. 16: α-linolenic acid.圖1 鐵皮石斛楓斗和鮮條樣品的總離子流圖Fig.1 Totalion flow diagram of fresh strips and fengdou of D.officinale

為充分提取2組樣本間的差異信息，本試驗采用OPLS-DA方法對數據進行分析，其結果如圖2-B所示。經分析，R2=0.985，Q2=0.976，說明建立的OPLS-DA模型穩健可靠。200次循環置換檢驗(Permutation)結果如圖2-C所示，R2(0.0，0.44)和Q2(0.0，-0.559)，Q2的回歸直線與y軸的交點在負半軸，說明建立的OPLS-DA模型擬合了較多的變量信息，且該模型具有良好的預測能力。

圖2 主成分分析得分圖(A)、OPLS-DA分析得分圖(B)、200次循環置換檢驗結果(C)Fig.2 Principal component analysis score (A), OPLS-DA analysis score chart (B), 200-cycle replacement test result (C)

2.3 差異成分鑒定

本研究篩選VIP>1，P<0.05的物質作為差異化合物，最終篩選到16種差異化合物，包括8種聯芐類成分和3種黃酮類成分(表1)。其中，12個成分在楓斗中含量較高，4個成分在鮮條中含量較高。

圖3 聯芐類化合物的質譜裂解途徑Fig.3 Mass spectrometric cleavage pathway of dibenzyl compounds

2.3.1 聯芐類成分鑒定 聯芐類成分是石斛屬植物中普遍存在的一類成分，2個苯環通過乙基連接，具有抗腫瘤[19]、抗炎[20]、抑制血管新生[21]等活性。此類化合物常在兩個苯環間的乙基處發生斷裂，生成小分子苯酚類化合物。以化合物8為例，正離子模式下可見準分子離子峰m/z275.128 [M+H]+，推測其分子式為 C16H18O4， 8個不飽和度。該化合物的二級質譜圖中m/z151.1的信號中性丟失CH2·，得到m/z137.0；碎片離子峰m/z139.0再中性丟失CH3·得到m/z122.0的碎片。由此推斷，該化合物具有聯芐的母核，可能A、B環各含有一個羥基和一個甲氧基，結合文獻[22]報道信息，推斷該化合物為石斛酚，與對照品比對，確定為石斛酚，其可能的質譜裂解途徑見圖3。同理，鑒定色譜峰 6、7、12、14、15均為聯芐類化合物，分別為4,4′-二羥基-3,5-二甲基聯芐、諾比林A、鼓槌聯芐、山藥素-Ⅲ 和dendronophenol B。色譜10準分子離子峰為m/z533.217 [M+H]+，推測其分子式為C31H32O8，16個不飽和度。二級質譜圖可見m/z393.2、285.1、239.1的信號，該化合物可能為聯芐二聚體，分別丟失C7H7O3、C7H8O、CH2O2基團，進一步與數據庫比對，鑒定其為Fimbriadimerbibenzyl D 的同分異構體。

2.3.2 黃酮類成分鑒定 黃酮類化合物的質譜裂解規律已有多篇文獻報道[23-24]，通常會中性丟失CO，發生逆狄爾斯-阿德爾反應(retro Diels-Alder reaction, RDA )裂解產生[1,3A]+和[1,3A]-。以色譜峰13為例，正離子模式下可見準分子離子峰m/z285.1 [M+H]+，該化合物的二級質譜圖中出現了m/z270.0 [M+H-CH3·]+、257.1 [M+H-CO]+和m/z167.1 [1,3B]+的碎片，結合對照品比對和文獻報道[25]，推斷其為芫花素。同理，鑒定色譜峰 3、5 也為黃酮類化合物，分別為草質素和柚皮素[26-27]。

2.3.3 其他類成分鑒定 除上述聯芐和黃酮兩大類成分外，其余差異成分主要為生物堿(水蘇堿，1)菲類(4,9-二甲氧基菲-2,5-二醇，11)、酯類(尼泊金異丁酯，4；對羥基肉桂酸乙酯，9)、氨基酸(苯丙氨酸，2)、脂肪酸(α-亞麻酸，16)，具體質譜信息見表1。16 個差異化合物的豐度比較見圖 4。

圖4 鐵皮石斛楓斗和鮮條差異性成分相對含量比較Fig.4 Comparison of the content of different components between fengdou of D. officinale and its fresh

表1 鐵皮石斛楓斗與鮮條差異成分鑒定結果Table 1 Identification results of differential components between fengdou of D. officinale and fresh strips

3 討論

酚類物質在石斛中含量較低，因此本研究利用UPLC-QTOF-MS技術測定樣品，采取提取液濃縮至干再復溶的方式，可增加色譜峰的響應值。通過比較正、負離子模式下的總離子流圖發現，正離子模式下的色譜峰響應程度高于負離子模式，因此采用正離子模式分析。

本研究采用化學計量學方法進行數據分析，通過分析，鐵皮石斛加工和非加工樣品在 PCA 得分圖上可以得到明顯的區分。同時，比較了鐵皮石斛楓斗和鮮條的成分差異，以VIP>1、P<0.05 為條件，篩選和鑒定了16種具有顯著差異性的化合物，包括聯芐、黃酮、酯類等成分。黃酮是石斛中主要的生物活性成分之一，不僅有很強的抗氧化性[28]，還可以降血糖[29]。本研究比較發現芫花素、柚皮素、草質素等黃酮類成分在楓斗中明顯上調積累，可能是由以柚皮素、草質素為苷元而形成的糖苷在加工過程中遇熱斷裂糖苷鍵，變成游離黃酮所致。聯芐類成分是石斛的特征性成分，已被證實具有降血糖[30]、抗腫瘤等[31]藥理作用。不同的溫度可能會導致聯芐類成分羥基化程度不同，從而影響聯芐類成分的含量，鐵皮石斛楓斗中石斛酚、4,4’-二羥基-3,5-二甲基聯芐、鼓槌聯芐等相對含量明顯高于鮮條，活性成分含量累積更多，藥用效果更佳。有研究表明高濃度石斛酚抑制高糖誘導的視網膜血管內皮細胞凋亡的能力更強[32]。同時，本研究發現α-亞麻酸、L-苯丙氨酸、尼泊金異丁酯等脂肪酸、氨基酸成分在鮮條中相對含量較高，而在楓斗加工過程中含量降低，其原因可能是氨基酸類和脂肪酸類成分在加工過程中受熱不穩定，遇熱易分解和揮發。

此外，多項研究表明植物中黃酮類[33]、酚類[34]成分與抑制α-葡萄糖苷酶的活性密切相關。本研究發現的鐵皮石斛鮮條和鐵皮石斛楓斗之間的差異成分，很可能與鐵皮石斛降血糖功效具有一定相關性，需要在后續研究中證實。

4 結論

本研究以鐵皮石斛為材料，利用UPLC-QTOF-MS技術結合化學計量學方法鑒定出鐵皮石斛楓斗和鮮條的16種差異成分，并針對16種差異成分進行分類和相對含量分析。結果表明，鐵皮石斛鮮條加工成楓斗后，黃酮、聯芐類化合物相對含量升高，脂肪酸、氨基酸類化合物相對含量降低。本研究揭示了鐵皮石斛楓斗和鮮條的差異性，有助于闡明其加工的意義，為鐵皮石斛的功能性產品開發提供了理論支撐。