江蘇省麥田豬殃殃對苯磺隆的抗性水平及靶標抗性機理研究

王紅春 陳俊敏 谷 濤 王 可 陶 園 婁遠來

(江蘇省農業科學院植物保護研究所，江蘇 南京 210014)

豬殃殃為一年生或越年生茜草科雜草，是江蘇、河南、山東、河北等地麥田主要的闊葉雜草[1-2]。磺酰脲類乙酰乳酸合酶(acetyllactate synthase，ALS)抑制劑型除草劑苯磺隆是麥田防除闊葉雜草的主導除草劑品種，在我國已連續使用苯磺隆30年以上[3-5]。目前，我國河南[6-9]、山東[6]、江蘇[6-7,10]、安徽[6-7]等地均已發現抗苯磺隆的豬殃殃種群。2008年，彭學崗等[6]發現采自江蘇徐州的豬殃殃種群對苯磺隆存在一定的抗藥性。2016年，崔海蘭等[7]發現苯磺隆或雙氟磺草胺防效差的7個豬殃殃江蘇種群均對苯磺隆產生了抗藥性。2017年，王紅春等[10]發現采自江蘇省的20個豬殃殃種群中有12個種群對苯磺隆產生了明顯的抗藥性，10個種群對芐嘧磺隆有交互抗性，4個種群對二甲四氯鈉敏感性明顯下降，所有種群對氯氟吡氧乙酸和唑草酮敏感。近年來，豬殃殃在江蘇省麥田蔓延危害逐年加重的趨勢明顯，蔓延危害加重與其對主導除草劑的敏感性下降相關性及其具體原因仍有待系統研究，且缺乏針對性的豬殃殃治理措施。為此，本試驗測定2020年采集于江蘇省不同地區小麥田的豬殃殃種群對苯磺隆、芐嘧磺隆及氯氟吡氧乙酸、2甲4氯鈉、唑草酮的敏感性，分析代表性種群ALS酶離體活性及其基因序列，旨在為制定江蘇省麥田豬殃殃精準區域防控策略提供理論依據和技術指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試劑

2020年5月，于江蘇省不同地區小麥田隨機采集自然成熟的豬殃殃種子。田間采集時標記采集地點，裝入牛皮紙袋，帶回江蘇省農業科學院植物保護研究所農田草害防控實驗室，自然晾干后置于種子儲存柜室溫儲藏。種群編號、采集地點等信息見表1。供試除草劑及其生產廠家如表2所示。

表1 豬殃殃種群采集地點信息Table 1 The collecting sites of Galium aparine seeds

表2 供試除草劑及其生產廠家Table 2 The herbicides and its production factories

苯磺隆劑量設計為11.25、22.5、45、90、180 g a.i.·hm-2。 其余除草劑處理劑量為其田間推薦有效成分用量的上限，即芐嘧磺隆75 g a.i.·hm-2、2甲4氯鈉 1 147.5 g a.i.·hm-2、 氯氟吡氧乙酸210 g a.i.·hm-2、唑草酮36 g a.i.·hm-2。2甲4氯鈉用蒸餾水溶解、稀釋，唑草酮用甲苯溶解，苯磺隆、芐嘧磺隆和氯氟吡氧乙酸用丙酮溶解，用體積分數為0.1%的吐溫80水溶液稀釋。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗材料培養 供試土壤為馬肝土，pH值6.7，有機質含量1.6%，風干過篩后備用。將長寬均為7 cm、高9 cm的白色塑料盆缽(底部具孔)裝約3/4的風干細土，置于塑料周轉箱內，底部加水使土壤水分飽和。分別播種經4℃低溫蒸餾水浸泡7 d解除休眠的豬殃殃種子，每缽播種16粒種子，覆蓋約0.5 cm厚度的細土，置于日光溫室中培養(溫度：白天20±5℃/晚上15±5℃，光照周期約12 h/12 h)。待雜草出苗整齊后，定苗至10株/缽。

1.2.2 豬殃殃種群對苯磺隆及其他除草劑的敏感性水平測定 于雜草2～3輪葉期，按照藥劑設計劑量進行噴霧處理。噴霧采用3WPSH-500 D型生測噴霧塔(農業農村部南京農業機械化研究所)，圓盤直徑50 cm，主軸轉動速度6 r·min-1，噴頭孔徑0.3 mm，噴霧壓力0.3 MPa，霧滴直徑100 μm，噴頭流量90 mL·min-1。 每個種群均設置不用藥的空白對照，每處理4次重復。用水量為450 L·hm-2。處理后21 d，測定豬殃殃植株地上部分鮮重，計算鮮重抑制率，DPS統計分析軟件通過線性回歸方程(y=a+bx)計算豬殃殃植株地上部分鮮重被抑制50%時的除草劑劑量(GR50值)。式中，y為概率單位，a為截距，b為回歸系數，x為以10為底的除草劑劑量對數值。相對抗性倍數(relative resistance index，RI)=抗性種群GR50/敏感種群GR50。

1.2.3 豬殃殃種群ALS離體活性測定 參考Ray[11]和鄧維[12]的方法，剪取2～3輪葉期的豬殃殃地上部分5 g，經提取、純化、脫鹽后制備酶液，每處理重復3次。在1.5 mL離心管中加入不同濃度的苯磺隆溶液100 μL、酶液100 μL，渦旋混勻在37℃水浴鍋中暗反應30 min后，加入20 μL 3 mol·L-1H2SO4終止反應，并將離心管轉移到60℃水浴鍋中保溫15 min進行脫羧，再依次加入190 μL 0.5%肌酸和190 μL 5% 1-萘酚，60℃水浴保溫15 min顯色，4 000 r·min-1離心3 min，取200 μL上清液加至96孔酶標板中，測定530 nm處的吸光值。純化的乙偶姻經梯度稀釋后，制作以乙偶姻各稀釋濃度為橫坐標，OD530值為縱坐標的標準曲線，將最終測得的反應液OD530值代入方程求出反應液中乙偶姻含量。乙酰乳酸合酶對苯磺隆敏感性通過Sigmaplot 12.0軟件非線性回歸方程y=C+(D-C)/[1+(x/I50)b]計算ALS活性被抑制50%時的苯磺隆濃度(I50值)。式中，x表示除草劑的濃度，y表示每個處理的乙酰乳酸合酶催化活性，C代表最低值，D代表最大值，b表示在I50處的斜率。相對抗性系數(relative resistance index，RI)=抗性種群I50/敏感種群I50。

1.2.4 豬殃殃種群ALS基因突變分析 根據豬殃殃ALS基因序列(GU377313)設計引物(表3)，擴增片段包含目前已報道所有抗性相關位點。參照1.2.1的方法和1.2.2的結果，剪取供試豬殃殃植株的單株葉片，利用TRIzol試劑[貨號10296010，賽默飛世爾科技(中國)有限公司]提取總RNA，具體提取方法參照產品說明書；采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒[RR047A，寶生物工程 (大連) 有限公司生產]反轉錄cDNA，反轉錄方法參照試劑盒相關流程進行。每種群各10株提取樣本，每個樣本挑取8個經過PCR法確認的陽性克隆，交由上海生工生物工程公司進行測序。測序獲得的序列與擬南芥敏感生物型的ALS基因序列用DNAMAN軟件比對分析。

表3 引物序列Table 3 Primers and sequences for PCR amplification

2 結果與分析

2.1 豬殃殃種群對苯磺隆的抗性水平

28個豬殃殃種群中，23個種群對苯磺隆產生了2.18～17.10倍的相對抗性(表4)。將江蘇省的長江以南地區定為蘇南地區，長江至蘇北灌溉總渠地區為蘇中地區，蘇北灌溉總渠以北為蘇北地區。江蘇省不同地理種群的抗性分布結果表明，蘇南地區10個豬殃殃種群中有8個種群對豬殃殃產生了5.84～14.96倍抗性，抗性種群比例為80%；蘇中地區11個種群中有9個種群對苯磺隆產生了2.18～17.10倍抗性，抗性種群比例為82%；蘇北地區7個種群中有6個種群對苯磺隆產生了抗性，相對抗性倍數為2.48～7.10倍，抗性種群比例為86%。

表4 不同地區豬殃殃種群對苯磺隆的敏感性Table 4 The sensitivity of different populations of G. aparine to tribenuron-methyl

2.2 豬殃殃抗性種群的交互抗性和多抗性

經磺酰脲類ALS抑制劑型除草劑芐嘧磺隆 75 g a.i.·hm-2處理，WJQ-3、LYM-1、TXS-1、YC-1、YC-2、HA-5、DHX-1、DHX-2種群地上部分鮮重抑制率均在96%以上，JYS-1、JYS-2、JYS-3等18個種群的鮮重抑制率均低于80%(表5)。經芐嘧磺隆75 g a.i.·hm-2處理，豬殃殃鮮重抑制率低于50%的13個種群中，蘇北地區種群有4個(占蘇北種群總數的57%)，蘇中地區有5個(占蘇中種群總數的45%)，蘇南地區有4個(占蘇南種群總數的40%)。

表5 不同除草劑處理后豬殃殃種群的地上部分鮮重抑制率Table 5 The fresh weight inhibition of different populations of G. aparine by different herbicides treatment /%

經苯氧乙酸類激素型除草劑2甲4氯鈉1 147.5 g a.i.·hm-2、 吡啶氧羧酸類激素型除草劑氯氟吡氧乙酸210 g a.i.·hm-2、三唑啉酮類原卟啉原氧化酶抑制劑類除草劑唑草酮36 g a.i.·hm-2處理，采自江蘇省的28個豬殃殃種群的鮮重抑制率均高于97%。

2.3 豬殃殃抗性種群的ALS酶活性和基因突變分析

選取LHQ-2(相對抗性系數17.10)、JYS-1(相對抗性系數14.96)、WJQ-2(相對抗性系數10.39)、RGS-1(相對抗性系數8.82)、RGS-3(相對抗性系數5.00)、DHX-2(相對敏感種群，相對抗性系數1.00)為代表性種群，測定其ALS酶對苯磺隆的離體活性。苯磺隆對敏感種群DHX-2 ALS酶的I50值為0.033 3 μmol·L-1，相對抗性種群LHQ-2、JYS-1、WJQ-2、RGS-1、RGS-3的I50值分別為9.034 0、8.457 1、1.380 3、0.508 5、0.051 7 μmol·L-1。其中，LHQ-2、JYS-1的相對抗性倍數均高于250倍(表6)。

表6 不同豬殃殃種群ALS活性及苯磺隆的I50值Table 6 Determination of the ALS activity and I50 values inhibited by tribenuron-methyl of different populations of G. aparine

對比擬南芥基因序列及敏感豬殃殃種群的ALS基因序列，LHQ-2和JYS-1種群在第197位由脯氨酸(CCC)突變為蘇氨酸(ACC)，WJQ-2種群在第376位由天冬氨酸(GAT)突變為甘氨酸(GAA)，RGS-1種群在第574位由色氨酸(TGG)突變為亮氨酸(TTG)，而RGS-3、DHX-2種群未發現基因突變(表7)。

表7 不同豬殃殃種群ALS基因突變位點情況Table 7 The mutation sites of ALS gene in different populations of G. aparine

3 討論

近年來，我國多地麥田豬殃殃種群對ALS抑制劑類除草劑苯磺隆產生了明顯的抗藥性。自2008年彭學崗等[6]發現采自江蘇徐州的豬殃殃種群對苯磺隆產生抗藥性以來，河南、安徽、山東、江蘇等省陸續發現了抗苯磺隆的豬殃殃種群[7-9]。2016年采集于江蘇省的20個豬殃殃種群中有12個種群對苯磺隆具有抗藥性，10個種群對芐嘧磺隆有明顯的交互抗性，4個高抗種群對2甲4氯鈉敏感性下降，所有種群對氯氟吡氧乙酸和唑草酮敏感[10]。本研究發現，2020年的28個豬殃殃種群中，23個種群對苯磺隆產生了2.18～17.10倍的抗性，18個種群對芐嘧磺隆的敏感性明顯下降，所有種群對2甲4氯鈉、氯氟吡氧乙酸、唑草酮均敏感。2016年江蘇省抗苯磺隆的豬殃殃比例為60%[10]，2020年抗性豬殃殃種群比例提高至85%，抗性比例增加了25個百分點，這可能與磺酰脲類除草劑在麥田中持續高強度使用有關。抗苯磺隆的豬殃殃種群比例呈現從蘇南到蘇北逐漸增加的趨勢，可能由于蘇北地區使用苯磺隆和芐嘧磺隆的頻度高，而蘇南地區使用的頻度低有關，該趨勢與2016年的研究結果相似。

高新菊等[9]研究發現，對苯磺隆具有53.92倍及以上抗性倍數的河南省麥田豬殃殃種群ALS基因氨基酸發生了突變。本研究發現，相對抗性倍數達到8倍以上的LHQ-2、JYS-1、WJQ-2和RGS-1豬殃殃種群的ALS氨基酸也發生了突變。其中，LHQ-2和JYS-1種群在第197位由脯氨酸突變為蘇氨酸，該突變與抗雙氟磺草胺的播娘蒿ALS突變情況相同[13-14]，而抗苯磺隆的牛繁縷、新疆白芥第197位由脯氨酸突變為丙氨酸[4,15]、抗苯磺隆的播娘蒿和抗芐嘧磺隆的丁香蓼和異型莎草第197位由脯氨酸突變為絲氨酸[5,16-17]；WJQ-2種群在第376位由天冬氨酸(GAT)突變為甘氨酸(GAA)，與抗苯磺隆的新疆白芥和抗ALS抑制劑的野慈姑突變情況相同[15,18]。第574位色氨酸突變為亮氨酸導致RGS-1種群產生了抗藥性，該突變與抗苯磺隆的光果豬殃殃希臘北部種群的突變情況相同[19]，且與抗雙氟磺草胺、苯磺隆的播娘蒿[5,13-14]及抗ALS抑制劑的麥家公[20]和蘿卜[21]、抗芐嘧磺隆的異型莎草[17]ALS突變情況也相同，而孫健等[22]發現山東濟寧市的豬殃殃種群第574位色氨酸突變為甘氨酸。本研究發現，江蘇省麥田豬殃殃抗性種群ALS氨基酸有3個位點發生了突變，該發現與抗ALS抑制劑的新疆白芥[15]、播娘蒿[23]、長芒莧[24]、皺果薺[25]、Persicariapensylvanica(L.) M. Gomez[26]相似，均在一種雜草中發現了多種抗性突變類型。江蘇省發現ALS基因不同位點氨基酸發生突變的豬殃殃種群，給抗性豬殃殃的治理和預防提出了新的挑戰。

靶標酶基因突變是雜草抗藥性產生的關鍵因素。交替使用作用機理不同的除草劑品種是延緩和治理雜草抗藥性的主要方法[27-30]。本研究發現江蘇省多地豬殃殃種群對磺酰脲類ALS抑制劑型除草劑苯磺隆和芐嘧磺隆產生了明顯抗性，但所有種群對苯氧乙酸類激素型除草劑2甲4氯鈉、吡啶氧羧酸類激素型除草劑氯氟吡氧乙酸和三唑啉酮類原卟啉原氧化酶抑制劑類除草劑唑草酮敏感。基于本研究結果，在防除江蘇省麥田豬殃殃時，應盡量不用或少用苯磺隆和芐嘧磺隆，合理輪換使用2甲4氯鈉、氯氟吡氧乙酸或唑草酮，以便控制抗性豬殃殃種群的產生和蔓延。

4 結論

采集于江蘇省的28個豬殃殃種群中，23個種群對苯磺隆產生了2.18～17.10倍的抗性，18個種群對芐嘧磺隆的敏感性明顯下降，所有種群對2甲4氯鈉、氯氟吡氧乙酸、唑草酮敏感。LHQ-2、JYS-1、WJQ-2、RGS-1種群對苯磺隆的相對抗性達8倍以上，其ALS酶離體活性是敏感種群DHX-2的15倍以上，LHQ-2、JYS-1種群ALS酶第197位由脯氨酸突變為蘇氨酸，WJQ-2種群的ALS酶第376位由天冬氨酸突變為甘氨酸，RGS-1種群的ALS酶第574位由色氨酸突變為亮氨酸。靶標酶活性提升和基因突變介導的靶標抗性是豬殃殃抗苯磺隆的關鍵因素。