基于網絡藥理學和分子對接探討枇杷葉防治Ⅱ型糖尿病的作用機制

孔紅銘 葉嘉昕 趙雅婷 趙楠星 夏旭東 戚向陽 陳秋平

(浙江萬里學院生物與環境學院，浙江 寧波 315100)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一組以高血糖為特征的代謝性疾病，通常分為Ⅰ型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)和Ⅱ型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)，臨床上絕大多數患者屬于T2DM。根據國際糖尿病聯合會(International Diabetes Federation, IDF)數據顯示，截止2021年12月，我國糖尿病患者人數已達到1.4億，是全球糖尿病患病人數最多的國家，到2030年，成人糖尿病年發病率預計將增加69%[1]。有效控制血糖水平是預防或逆轉T1DM和T2DM及其并發癥，提高生活質量的關鍵。天然α-葡萄糖苷酶(α-Glucosidase)抑制劑因副作用小，能夠有效控制糖尿病患者餐后血糖上升，是輔助治療T2DM的首選藥物。但目前市面上的α-葡萄糖苷酶抑制劑大多為人工合成，會引起腹脹[2]、腹瀉[3]、腹痛[4]等不良反應。已有研究表明，從植物提取物中分析鑒定糖苷酶和脂肪酶抑制劑，能夠快速篩選潛在的降糖活性成分。如陳海君等[5]運用親和超濾技術從毛菊苣種子提取物中篩選并鑒定出4種α-葡萄糖苷酶抑制劑；Chen等[6]通過沉淀交聯法將豬胰脂肪酶固定在金屬有機骨架上，篩選了夏枯草中的脂肪酶抑制劑，獲得13種可抑制脂肪酶的小分子化合物。

枇杷葉為薔薇科植物枇杷(Eriobotryajaponica)的干燥葉，作為傳統中藥，其性微寒、味苦，有清肺止咳、和胃利尿之功效[7]，主要化學成分為三萜酸類、黃酮類、多酚類等物質。近年來，枇杷葉提取物在抗炎[8]、抗氧化[9-10]、降血糖[11]等方面的作用逐漸受到關注。由于中藥發揮療效時具有多成分多靶點的特點，因此，枇杷葉抗糖尿病的作用機制也十分復雜，現階段缺乏對枇杷葉抗糖尿病的藥效成分及作用機制的整體認識。

網絡藥理學是一門基于系統生物學理論的新學科，主要內容為生物系統的網絡分析，可以從整體水平考察“藥物-靶點-疾病”之間的復雜網絡關系[12]，為表達及解釋傳統中藥多成分、多靶點、多調控通路的協同關系提供技術支撐。已有研究者采用網絡藥理學方法，對天然產物與疾病之間的作用關系進行多通路分析，如吳丹等[13]運用網絡藥理學技術對柴胡抗抑郁機制進行了預測，發現柴胡主要通過調節蛋白磷脂酰肌醇激酶-蛋白激酶B (phosphatidylinositol 3 kinase protein kinase B，PI3K-AKT)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)、腎素血管緊張素系統(renin angiotensin system，Ras)和骨骼肌叉頭框轉錄因子O (forkhead transcription factor O，FoxO)等信號通路來發揮抗抑郁作用。本研究以枇杷葉為研究對象，采用網絡藥理學方法探究枇杷葉多途徑、多層次、多靶點間復雜的相互作用關系，旨在從天然產物中尋找藥效溫和、毒副作用小的α-葡萄糖苷酶抑制劑，以解決糖尿病人的實際需求。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

α-葡萄糖苷酶(50～120 kDa)，西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；阿卡波糖、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；槲皮素、鞣花酸、β-谷甾醇、山奈酚、異鼠李素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate, EGCG)、科羅索酸對照品，均購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

TU-1810可控溫紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 構建枇杷葉活性成分潛在作用靶標庫、相互作用網絡圖 登錄中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php)，設置類別為“Herb name”，使用“pipaye”作為檢索關鍵詞，以化合物口服藥物生物利用度(oral bioavailability，OB)和類藥性(drug-like，DL)為依據[14]，分別將二者參數設置為OB≥30%和DL≥0.18[15]進行初篩，獲得活性成分及靶點。其中活性成分科羅索酸OB值為15.86，未能通過初篩，但宋星等[11]、許舒雯[16]研究表明該物質具有降血糖作用，因此將其列入其中。借助Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/)對靶點名稱標準化處理。將活性成分及靶點信息導入至Cytoscape 3.7.0，生成“活性成分-作用基因”相互關系網絡圖。

1.3.2 通過共同靶點構建成分-疾病相互關系網絡 登錄人類孟德爾遺傳數據庫(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，https://omim.org/)、人類基因數據庫(Genecards，https://www.genecards.org/)，以“type 2 diabetes mellitus”為關鍵詞進行檢索，由此得到Ⅱ型糖尿病基因。將疾病靶點與成分靶點導入Venny 2.1數據庫(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)繪制韋恩圖，交集靶點即為枇杷葉潛在治療Ⅱ型糖尿病作用靶點。將交集靶點與對應活性成分導入Cytoscape 3.7.0,建立“成分-疾病靶點”相互作用網絡圖，從而進一步探討枇杷葉活性成分協同防治T2DM的藥理作用。

1.3.3 蛋白-蛋白相互作用網絡的構建 將交集靶點上傳至STRING數據庫平臺(Search tool for recurring instances of neighbouring genes，https://string-db.org/cgi/input.pl)，設定物種為“Homo sapiens”，獲取蛋白-蛋白相互作用網絡(protein to protein interaction, PPI)，以“TSV”格式導出，使用Cytoscape 3.7.0 “Network Analyzer”分析插件獲取自由度、中心度數、介數，三者同時大于平均值的交集靶點即為枇杷葉防治T2DM的關鍵靶點。

1.3.4 關鍵靶點的GO分析及KEGG通路分析 將共同靶點上傳至Metascape分析平臺(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)，構建可視化網絡。選擇物種為“Homo sapiens”，進行基因本體論(Gene Ontology，GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路分析，并規定P<0.01，篩選符合條件的條目進行數據可視化分析。

1.3.5 分子對接 將篩選得到的自由度值較高的關鍵化合物與α-葡萄糖苷酶(PDB ID：3A4A)進行分子對接，首先借助Chem3D軟件將化合物進行能量最小化處理，在PDB數據庫(https://www.rcsb.org/)檢索3A4A，保存為pdb格式，使用Pymol 2.5.0軟件對蛋白結構刪除水分子、去除修飾配體，再使用AutoDock Tools 1.5.6將枇杷葉關鍵活性成分和3A4A轉換為pdbqt格式，并通過AutoDock Vina 1.1.2進行分子對接，最后運用Pymol 2.5.0將分子對接能量較小且構象穩定的化合物與3A4A進行可視化處理[17]。棍狀結構為配體分子，細線狀結構為距離活性分子5?范圍內的氨基酸殘基，黃色虛線表明配體分子與氨基酸殘基之間具有氫鍵相互作用。

1.3.6 活性抑制試驗驗證 用0.1 mmol·L-1磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS，pH值6.8)將α-葡萄糖苷酶配制成1.5 U·mL-1的溶液，用于酶活性分析。

測定樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制活性：比色皿中加入1.8 mL PBS緩沖液，于37℃預熱5 min，待其溫度穩定后，加入5 mmol·L-14-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷溶液(4-nitrobenzene-α-D-glucopyranoside，PNPG)100 μL，再加入不同體積梯度(10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μL)的樣品溶液(0.03 mg·mL-1)，然后迅速加入20 μL 1.5 U·mL-1酶液，搖勻，于405 nm處監測其2 min內吸光度值的變化，計算酶活性(enzymatic activity，EA)[18-19]；測定陽性對照阿卡波糖的酶活性同理，僅需將樣品溶液替換為阿卡波糖溶液(5 mmol·L-1)即可；測定空白酶活時，無需添加任何抑制劑，其余步驟同上。抑制率計算公式如下：

其中，EA為酶活力系數，U·mL-1。

2 結果與分析

2.1 活性化合物篩選結果

通過TCMSP數據庫篩選符合OB、DL值的化合物，得到19種結果，匯總見表1。

表1 枇杷葉19種活性成分信息表Table 1 Information table of 19 active ingredients of Loquat leaf

2.2 化合物、疾病靶點篩選結果

收集19種活性成分各自對應的靶點基因，得到294種結果，并構建有效成分靶標庫。通過OMIM、Genecards數據庫檢索T2DM相關基因，收集相關度大于40以上的基因信息，刪除重復基因后共獲得731條結果，匯總為疾病數據庫。

2.3 “活性成分-作用基因”網絡圖的構建及分析

將2.1中收集到的活性成分及其對應的靶點信息錄入Cytoscape 3.7.0生成“活性成分-作用基因”網絡圖，結果見圖1。圖中共有309個節點、484條邊，節點間的連線表明二者之間存在相互作用關系，連線越密集表示二者之間的關聯度越高。其中，MOL00098(槲皮素)匹配到的靶標數最多，為142個，MOL006821(EGCG)、MOL000422(山奈酚)、MOL005508(科羅索酸)、MOL000354(異鼠李素)和MOL000358(β-谷甾醇)對應的靶標數量較多，依次為52、44、40、34和32個，因此，以上活性成分可能在諸如糖尿病、高血脂、高血糖等疾病的治療或輔助治療中發揮不同的作用。此外，由于TCMSP數據庫未收錄MOL001663(3-表齊墩果酸)、MOL012556(23-反式-p-香豆酸)、MOL012593、MOL012617(圓酵母烯素)化合物的相關靶點，因此將其刪去。

圖1 枇杷葉“活性成分-作用基因”網絡圖Fig.1 “Component-action gene” network of loquat leaf

2.4 交集基因獲得結果

將294個活性成分靶點與731個T2DM靶點通過Venny 2.1繪制維恩圖(圖2)，二者重合區域即為交集基因，得到95個結果。

圖2 枇杷葉與Ⅱ型糖尿病靶點基因維恩圖Fig.2 Venn diagram of the targets of Loquat leaf and type 2 diabetes mellitus

2.5 “活性成分-疾病靶點”網絡圖的構建及分析

將韋恩圖繪制得到的交集靶點依照2.3同法制作得到“活性成分-疾病靶點”網絡圖(圖3)，網絡共包含100個節點與164條邊。其中，MOL00098(槲皮素)匹配到的靶標數仍然最多，為59個，其次為MOL006821(EGCG)，匹配到41個靶標，MOL000422(山奈酚)、MOL000354(異鼠李素)和MOL005508(科羅索酸)對應的靶標數量依次為14、11和7個，說明枇杷葉提取物用于防治Ⅱ型糖尿病時，主要通過以上活性成分作用于相同或不同的靶標，進而調節不同的代謝通路，從而發揮療效。

圖3 枇杷葉“活性成分-疾病靶點”網絡圖Fig.3 “Component-disease target” network of Loquat leaf

2.6 “活性成分-疾病靶點”網絡圖的構建及分析

將篩選得到的95個成分-疾病交集靶點上傳至STRING在線蛋白互作關系分析平臺，得到PPI網絡圖，如圖4所示。

圖4 枇杷葉與Ⅱ型糖尿病蛋白-蛋白互作網絡圖Fig.4 The protein-protein interaction network of Loquat leaf and type 2 diabetes mellitus

PPI網絡中各個蛋白節點的平均自由度為 20.347 4， 平均介數為0.002 6，平均中心度數為0.691 5，三者同時大于平均值的靶點有15個，匯總見表2，由此判斷這些靶點極有可能是枇杷葉活性成分用于防治T2DM的關鍵靶點。

表2 枇杷葉防治T2DM關鍵基因基本信息表Table 2 Basic information table of key genes in prevention of T2DM with loquat leaf

2.7 GO分析結果

GO富集分析結果表明(圖5)，生物過程(biological process，BP)主要涉及對脂多糖的反應、上皮細胞增殖、氧化應激反應、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的調節、凋亡信號通路的調控等方面；分子功能(molecular function，MF)主要涉及DNA-結合轉錄因子結合、泛素-類蛋白連接酶結合、生長因子結合等方面；細胞組成(cellular component，CC)主要涉及膜筏、膜微區、質膜外側、細胞-襯底結、早期內體等。

圖5 GO功能富集分析圖Fig.5 GO functional enrichment analysis diagram

2.8 KEGG分析結果

如圖6所示，富集程度較高的代謝通路主要包括脂質與動脈粥樣硬化、晚期糖基化產物-晚期糖基化終末產物受體(advanced glycosylation end products-receptor of AGE, AGE-RAGE)信號通路、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)信號通路、低氧誘導因子1(hypoxia inducible factor-1, HIF-1)信號通路等，表明枇杷葉活性成分通過以上多條代謝通路發揮防治T2DM的作用。

注：氣泡大小與顏色表示代謝通路富集程度，氣泡越大，顏色越深表明富集程度越高。Note: The bubble size and color in the figure indicate the enrichment degree of metabolic pathway. The larger the bubble,the deeper the color, and the higher the enrichment degree.圖6 KEGG通路富集分析氣泡圖Fig.6 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis

2.9 分子對接結果

由表3可知，EGCG與3A4A結合能小于-10.0 kcal·mol-1，其次金雞納素 1a、原飛燕草素 B6、β-谷甾醇與3A4A的結合能均小于-9.0 kcal·mol-1，具有非常強烈的結合活性[20-21]。運用Pymol 2.5.0進行可視化處理，結果如圖7所示。以槲皮素為例，它能夠順利與3A4A蛋白的活性口袋進行結合，通過與活性口袋的ASN317、ASN415、GLY161、LYS156、ASP233、ASN235、GLU429氨基酸形成分子間氫鍵，從而維持配體與蛋白活性口袋的穩定。

表3 枇杷葉關鍵成分與3A4A對接結果Table 3 Docking results of key components of loquat leaf with 3A4A

圖7 枇杷葉關鍵活性成分與3A4A對接可視化三維圖Fig.7 3D visualization of the docking of key active components of loquat leaf with 3A4A

2.10 體外酶活性抑制驗證

根據分子對接結果，選擇EGCG、β-谷甾醇、科羅索酸、槲皮素、異鼠李素、鞣花酸、山奈酚進行體外酶活性抑制試驗，結果見圖8。考慮到臨床上常用阿卡波糖作為α-葡萄糖苷酶抑制劑，因此設置阿卡波糖為陽性對照組，測得其半抑制濃度(50% inhibitory concentration，IC50)值為126.98 μmol·L-1。

圖8 活性成分對α-葡萄糖苷酶抑制作用Fig.8 Inhibition effect of active ingredient on α-glucosidase

體外酶抑制結果表明，枇杷葉中主要活性成分的IC50值依次為EGCG(1.11 μmol·L-1)<科羅索酸(4.43 μmol·L-1)<槲皮素(6.39 μmol·L-1)<山奈酚(17.77 μmol·L-1)<β-谷甾醇(21.05 μmol·L-1)<鞣花酸(36.35 μmol·L-1)<異鼠李素(80.04 μmol·L-1) <阿卡波糖(126.98 μmol·L-1)，IC50值越低，表明對α-葡萄糖苷酶的抑制效果越好。EGCG的抑制活性最強(IC50值為1.11 μmol·L-1)，這與分子對接結果吻合，其余有效成分與酶的結合力十分強烈，說明核心有效成分能夠與酶自發且穩定地結合，因此，以上活性成分可作為高效α-葡萄糖苷酶抑制劑。

3 討論

我國是中藥大國，獨特的傳統藥學理論讓中藥在糖尿病及其并發癥的治療方面有著良好的效果和廣闊的前景。網絡藥理學作為一門新學科，與枇杷葉這一味傳統中藥相結合，能夠從靶點通路的角度分析枇杷葉用于防治Ⅱ型糖尿病的機理。因此本研究采用網絡藥理學和分子對接技術對枇杷葉防治Ⅱ型糖尿病的機制進行探討。

通過構建“活性成分-作用基因”、“活性成分-疾病”網絡圖發現，槲皮素在二圖中均為關鍵節點，經分子對接驗證了其與α-葡萄糖苷酶有較強的結合活性。研究證實，槲皮素具有降血糖[22-23]、降血脂[24-25]、抗炎[26-27]、抗氧化[28]等多種藥理作用。翟云鵬等[29]通過誘導高血脂癥大鼠模型發現，槲皮素能夠降低其血糖、血脂并有效改善高血糖導致的腎功能損傷。

將枇杷葉"活性成分-疾病靶點"網絡圖進行靶點間相互作用分析，通過自由度值篩選發現IL6、TNF、AKT1、TP53、MAPK3、PTGS2是枇杷葉防治T2DM的關鍵靶點。IL6、TNF和AKT1能夠激活下游蛋白，促進細胞內能量代謝，增加葡萄糖消耗，抑制脂質的合成，從而調控葡萄糖和脂質代謝[30-32]。相關研究表明，TP53可能通過誘導骨骼肌中的氧化應激反應對胰島素信號通路進行調節，從而調控胰島素抵抗的發展[33]。MAPK3在糖尿病、腎病的發病過程中，可能參與腎小球系膜細胞表型轉化，導致腎小球細胞外基質堆積，造成腎小球硬化[34]。PTGS2可能對Ⅱ型糖尿病發揮調節作用，PTGS2產生前列腺素，前列腺素負向調控葡萄糖刺激的胰島素分泌[35]。因此，枇杷葉活性成分可能作用于以上靶點，進而發揮防治Ⅱ型糖尿病的作用。

通過GO和KEGG富集分析發現，AGE-RAGE、HIF-1、PI3K-Akt、TNF、叉頭轉錄因子O(forkhead box O, FoxO)、IL-17信號通路是枇杷葉防治Ⅱ型糖尿病的主要通路，槲皮素、山奈酚、異鼠李素等化合物正是通過以上信號通路影響了T2DM的發展進程。Fox O在胰島素調節肝臟糖異生的信號通路中起重要作用，Fox O的高表達能夠引起糖脂代謝異常，通過抑制Fox O的蛋白表達，并促進Fox O磷酸化表達，達到改善肝臟胰島素抵抗的效果[36]。磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase, PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)信號通路是肝臟中胰島素發揮作用的主要信號通路[37]。PI3K-Akt活化后能夠激活下游蛋白，促進細胞內能量代謝，增加體內葡萄糖消耗，從而抑制體內脂質的合成，槲皮素、山奈酚作為常見的膳食類黃酮，具有抗炎、抗氧化、抑制AGE在血管內蓄積等生物學功能，其機制與PI3K-Akt通路、AGE-RAGE通路密不可分。科羅索酸能夠激活Akt磷酸化，下調Fox O等糖異生相關基因的表達，改善胰島素抵抗。AGE-RAGE信號通路可促進炎癥因子的表達和釋放，誘導細胞凋亡和促進血管新生，降低AGE-RAGE水平可有效延緩腎臟纖維化病理改變[38-39]。異鼠李素是常見的黃酮類化合物之一，具有抗氧化、抗糖尿病、抗腫瘤等生物學活性，可通過AGE-RAGE、HIF通路降低血糖含量。HIF-1信號通路是機體低氧應激反應時的主要靶點[40]，研究表明，抑制糖尿病小鼠HIF-1α的表達，能抑制Ras同源基因家族成員A(Ras homolog gene family, member A, Rho A)/Rho蛋白激酶(Rho protein kinase, ROCK)信號轉導通路，從而降低糖尿病小鼠的血糖水平[41]。

由于人體內的α-葡萄糖苷酶是臨床上用于降血糖的關鍵靶點，因此將篩選得到的活性成分與α-葡萄糖苷酶進行計算機輔助分子對接模擬。結果表明，α-葡萄糖苷酶與枇杷葉10種主要活性成分的結合能均≤-8.0 kcal·mol-1， 結合活性較強，與EGCG的結合能低至-10.2 kcal·mol-1， 親和力十分強烈。體外酶活性抑制驗證發現，隨著作用濃度提高，活性成分抑制率也逐漸提高，呈現出一定的濃度依賴性，且各成分IC50值均小于阿卡波糖，因此，枇杷葉活性成分可作為高效α-葡萄糖苷酶抑制劑。

在對枇杷葉活性成分進行初篩時，已獲得4種金雞納素同分異構體，經過網絡藥理學復篩，保留其中2種同分異構體(金雞納素1a和金雞納素1c)，且分子對接結果表明，二者與α-葡萄糖苷酶的親和力總體而言十分優異，可對二者進行體外酶抑制驗證。Patel等[42]研究發現，金雞納素lb能夠用作胰島素促進劑，增加大鼠胰島素分泌。由于金雞納素lc目前在國內無供貨商，因此暫時無法對其進行體外試驗，具體抑制效果有待進一步深入研究。

4 結論

本研究發現，枇杷葉主要通過槲皮素、山奈酚、鞣花酸、科羅索酸等活性成分來調節氧化應激反應、絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、對脂多糖的反應和上皮細胞增殖等，進而調控AGE-RAGE、HIF-1和PI3K-Akt等信號通路，從而對Ⅱ型糖尿病發揮調節作用。研究結果為枇杷葉用于防治Ⅱ型糖尿病的作用機制提供了理論指導。