miR-338靶向CaMKⅡγ調控大鼠神經病理性疼痛的作用機制研究

馬真 宋海亮 謝然尖措 趙吉彪

神經病理性疼痛是中樞神經系統發生損傷或疾病引起的一種慢性疾病，影響30%至50%的世界人口，是患者、社會和醫療領域的重要負擔[1,2]。神經病理性疼痛發病機制復雜，有發病率高、現有治療方案不足、臨床干預效率較低等特點，是一件非常棘手的問題，因此需要進一步研究以確定和驗證潛在的靶點[2,3]。多項研究表明神經病理性疼痛與炎性反應密切相關，機體炎性因子的大量釋放嚴重損害神經細胞及非神經細胞的生長，影響神經系統功能的恢復，最終引起機體的痛覺異常[4,5]，因此從降低機體炎性反應、緩解疼痛等方面尋找相關的治療靶點是有效的。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類內源性非編碼單鏈RNA，長度約為22個核苷酸，參與調節神經系統中相關基因的表達，在維持神經系統功能等方面發揮重要作用，可通過調節神經炎癥來影響神經病理性疼痛的發生發展過程[6]。miR-338-3p是miRNA家族成員之一，參與炎性反應等多種生物學進程的調控。鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱα(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱα，CaMKⅡα)是細胞內傳遞Ca2+信號的關鍵分子，具有α、β、γ和δ四種異構體。Zhang等[7]研究發現miR-338-3p通過阻止炎癥信號通路的異常激活而抑制促炎性細胞因子的表達，并認為可能是miR-338-3p的直接靶點，但關于miR-338-3p與CaMKⅡγ之間的研究較少，因此本研究通過構建神經病理性疼痛大鼠模型，探究miR-338-3p調控神經病理性疼痛的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物與細胞 55只SD雄性大鼠購于上海吉輝實驗動物飼養有限公司，均為SPF級，體重約為240 g，生產許可證號：SCXK(滬)2017-0012。大鼠均在本院動物房內飼養，動物房通風、光照條件良好，溫度約25℃，實驗期間自由進食進水，每周清潔1次鼠籠并更換新鮮墊料，每天清潔1次飲水瓶。大鼠背根神經元細胞(貨號：CP-R126)購于武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 主要試劑與儀器 總RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、干擾素γ(interferon γ，IFN-γ)、白介素1β(interleukin 1β，IL-1β)ELISA試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(貨號：R1200、RP1105、SEKR-0009、SEKR-0008、SEKR-0002、D0010)購于北京索萊寶科技有限公司；miR-388-3p類似物(mimic)及其陰性對照物(mimic NC)均油廣州銳博生物科技有限公司合成；CaMKⅡγ抗體、GAPDH抗體、羊抗兔IgG(貨號：ab262701、ab181602、ab6721)購自美國Abcam；EnVision多功能酶標儀購于PerkinElmer公司；I-U-004爪觸覺測試儀、38450電子觸覺測量儀購于意大利UGO BASILE公司等。

1.3 方法

1.3.1 動物模型制備及分組處理：參考文獻[8]制備神經病理性疼痛大鼠模型，將55只大鼠按照隨機數字法分為假手術組(10只)和造模組(45只)。將大鼠麻醉后進行表皮常規消毒，縱向切開大鼠腰部5～6間隙后逐層分開，使L5白色椎板暴露，用針頭刺破髂棘(L5～L6棘突間隙)部位，將PE-10導管從刺破處置入約2 cm，再將導管外端經皮下移至頸部并固定，大鼠出現甩尾、抖動反射、有清亮腦脊液流出等現象表明置管成功，置管成功后3 d剔除癱瘓、狀態不佳或運動障礙的大鼠；再次將大鼠麻醉，于大鼠背部正中做切口，暴露L5和L6脊神經，分離并采用4-0縫線結扎L5、L6脊神經，當出現小腿肌肉輕度顫動時表明結扎強度適宜，隨后縫合大鼠肌肉及皮膚，假手術組僅分離L5和L6脊神經，不做結扎處理。造模過程中觀察并記錄大鼠一般情況，當大鼠出現舔舐后爪、后爪收縮、跛行、足趾并攏等現象表明神經病理性疼痛模型構建成功。造模過程中，造模組出現3只大鼠置管后狀態不佳，2只死亡，共造模成功40只。

1.3.2 將造模成功的40只大鼠按照隨機數字法分為模型組、陰性對照組、miR-338-3p組、miR-338-3p+CaMKⅡγ組，每組10只。參考文獻[9]，miR-338-3p組在造模第3、5、7天鞘內注射4 mg/kg的miR-338-3p mimic，miR-338-3p+CaMKⅡγ組共注射miR-338-3p mimic、CaMKⅡγ mimic，陰性對照組鞘內注射等量mimic NC，模型組及假手術組注射等量0.9%氯化鈉溶液。

1.4 大鼠行為學測定 分別在造模第0、2、6、10、14天測定大鼠機械痛覺閾值(mechnical withdrawal threshold，MWT)及熱縮足潛伏期(thermal withdrawal latency，TWL)。提前將大鼠放入爪觸覺測試儀中30 min，待其適應環境后用電子觸覺測量針刺激大鼠的足底部，在大鼠縮足時記錄儀器中電子觸覺測量針刺激力度，即為大鼠MWT值。將大鼠置于足底熱刺激儀透明塑料籠中適應30 min，用熱輻射刺激儀透過玻璃板照射大鼠足底部，記錄大鼠從照射開始到其縮足的時間，即為大鼠TWL值，為防止燙傷大鼠，將時間上限設置為30 s，每只大鼠重復測量5次，每次間隔5 min[10]。

1.5 大鼠背根神經節標本采集 行為學測定結束后，將大鼠麻醉，用含有多聚甲醛及戊二醛的磷酸緩沖液進行心臟灌注，灌注至大鼠四肢僵硬，無菌環境下取出大鼠L5～L6背根神經節，低溫保存，用于后續實驗測定。

1.6 大鼠背根神經節中miR-338-3p、CaMKⅡγ mRNA表達情況 取1.5中大鼠部分背根神經節組織，用總RNA提取試劑盒提取其中的總RNA，取1.5 μl背根神經節組織RNA提取液，用反轉錄試劑盒獲得cDNA，對miR-338-3p、CaMKⅡγ進行擴增，用實時熒光定量PCR測定，反應體系共20 μl：10 μl 2×SYBR Mix，8 μl H2O，上下游引物各0.5 μl，1 μl 10×cDNA模板；反應條件：95℃(5 min)、95℃(1 min)、62℃(1 min)、72℃(2 min)，40個循環。以U6為內參，根據2-ΔΔCT算法分析miR-338-3p、CaMKⅡγ的表達水平，U6：上游引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；miR-338-3p：上游引物5’-UUUGCGGAAUUUUAA AUGCUGGA-3’，下游引物5’-GUUGUUUUAGUGACUACGACCU-3’；CaMKⅡγ：上游引物5’-ATGGCCACCACCGCCACCT-3’，下游引物5’-CTGCAGCGGTGCGGCAGGG-3’。

1.7 大鼠背根神經節中CaMKⅡγ蛋白表達情況 取1.5中大鼠部分背根神經節組織，用RIPA裂解液提取其中的總蛋白，用BCA試劑盒對提取的總蛋白進行定量。取30 μg蛋白沸水浴變性后，上樣經10%SDS-PAGE電泳后電轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入CaMKⅡγ抗體(1∶1 500)、GAPDH抗體(1∶1 500)并4℃孵育過夜，加入二抗羊抗兔IgG(1∶2 000)于室溫下孵育1 h，化學發光法顯色顯影，掃描圖像，分析條帶灰度值，計算CaMKⅡγ蛋白與GAPDH蛋白的灰度值比值。

1.8 大鼠背根神經節中炎性因子表達水平測定 取1.5中大鼠部分背根神經節組織，加入適量生理鹽水，研磨成10%的組織勻漿，離心取上清液，根據腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ(IFN-γ)、白介素1β(IL-1β)相關試劑盒的操作步驟進行背根神經節組織中TNF-α、IFN-γ、IL-1β表達水平的檢測。

1.9 熒光素酶報告實驗檢測 在TargetScan數據庫中分析預測miR-338-3p與CaMKⅡγ的靶向作用位點。構建突變型(MUT)和野生型(WT)基因靶點CaMKⅡγ的3’-UTR熒光素酶表達載體，將購買的大鼠背根神經元細胞快速融化，經過消化、傳代后在37℃、5%CO2培養箱中進行培養，采集處于對數生長期的細胞，將CaMKⅡγ-MUT、CaMKⅡγ-WT重組載體分別與miR-338-3p mimic及mimic NC共轉染至大鼠背根神經元細胞中，轉染24 h后收集細胞，測定熒光素酶活性，實驗重復3次。

2 結果

2.1 大鼠一般情況觀察 假手術組大鼠健康狀況良好，行為學觀察無明顯變化；與假手術組比較，模型組大鼠出現甩足、舔足、足趾并攏等現象；與假手術組比較，miR-338-3p組大鼠行為學得到一定改善。

2.2 miR-338-3p與CaMKⅡγ靶向關系預測及驗證 TargetScan數據庫結果顯示，miR-338-3p在CaMKⅡγ mRNA 3’UTR存在相應的結合位點；熒光素酶報告實驗結果顯示，與CaMKⅡγ WT+mimic NC組比較，CaMKⅡγ WT+miR-338-3p mimic組大鼠背根神經元細胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，CaMKⅡγ MUT+mimic NC組、CaMKⅡγ MUT+miR-338-3p mimic組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 熒光素酶報告實驗檢測miR-338-3p與CaMKⅡγ的靶向作用關系

2.3 5組大鼠MWT、TWL值比較 假手術組大鼠手術前后MWT、TWL值無明顯變化，其余組大鼠造模后MWT、TWL值明顯降低，之后隨著時間的推移逐漸升高。造模第0天，5組大鼠MWT、TWL值比較差異無統計學意義(P>0.05)。造模第2天，與假手術組比較，模型組、陰性對照組、miR-338-3p組、miR-338-3p+CaMKⅡγ組大鼠MWT、TWL值均顯著降低(P<0.05)。造模第6、10、14天，與假手術組比較，模型組大鼠MWT、TWL值均顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，陰性對照組差異無統計學意義(P>0.05)，miR-338-3p組及miR-338-3p+CaMKⅡγ組大鼠MWT、TWL值均顯著升高(P<0.05)；與miR-338-3p組比較，miR-338-3p+CaMKⅡγ組大鼠MWT、TWL值均顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 5組大鼠MWT、TWL值比較

2.4 5組大鼠背根神經節組織中miR-338-3p、CaMKⅡγ mRNA及蛋白表達情況比較 與假手術組比較，模型組大鼠背根神經節組織中miR-338-3p表達水平顯著降低(P<0.05)，CaMKⅡγ mRNA及蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，陰性對照組差異無統計學意義(P>0.05)，miR-338-3p組及miR-338-3p+CaMKⅡγ組大鼠背根神經節組織中miR-338-3p表達水平顯著升高(P<0.05)，CaMKⅡγ mRNA及蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；與miR-338-3p組比較，miR-338-3p+CaMKⅡγ組大鼠背根神經節組織中CaMKⅡγ mRNA及蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。見圖1，表3。

圖1 大鼠背根神經節組織中CaMKⅡγ表達情況

表3 5組大鼠背根神經節組織中miR-338-3p、CaMKⅡγ mRNA及蛋白表達情況比較

2.5 5組大鼠背根神經節組織中炎性因子表達水平比較 與假手術組比較，模型組大鼠背根神經節組織中TNF-α、IL-1β、IFN-γ表達水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，陰性對照組差異無統計學意義(P>0.05)，miR-338-3p組及miR-338-3p+CaMKⅡγ組大鼠背根神經節組織中TNF-α、IL-1β、IFN-γ表達水平顯著降低(P<0.05)；與miR-338-3p組比較，miR-338-3p+CaMKⅡγ組大鼠背根神經節組織中TNF-α、IL-1β、IFN-γ表達水平顯著升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 5組大鼠背根神經節組織中TNF-α、IFN-γ、IL-1β表達水平比較

3 討論

神經病理性疼痛是以中樞神經系統或周圍神經系統病變或疾病引起的，有痛覺過敏、感受異常、自發性疼痛、異常疼痛等臨床特征，自身免疫性疾病、物理性機械損傷、神經毒性藥物等均是其常見誘因，由于神經病理性疼痛發病機制復雜，導致其臨床治療效果不佳，因此，找出神經病理性疼痛發病機制的具體分子機制對于治療這種慢性疾病具有重要意義[11,12]。研究中常用脊神經結扎等方式構建神經病理性疼痛模型，王裕生等[13]通過此方法構建的神經病理性疼痛模型大鼠出現明顯的痛覺過敏現象，且能更好的模擬神經病理性疼痛的發生發展過程。本研究顯示，與假手術組比較，模型組大鼠出現甩足、舔足、足趾并攏等行為學異?，F象，MWT、TWL值顯著升高，提示神經病理性疼痛大鼠模型構建成功。

多項研究表明，神經病理性疼痛與機體炎性反應聯系密切，當脊神經受到損害后，損害部位、背根神經節、脊髓等迅速產生較多的促炎因子，從而導致大量炎性因子的產生，參與多種傷害性信息的傳遞，神經生長因子、促炎性細胞因子等均可作用于神經元細胞，從而增強神經元興奮性、進一步放大神經炎性反應[14,15]。Ghasemzadeh等[16]研究發現，神經病理性疼痛大鼠體內TNF-α等炎性因子水平顯著升高，而迷迭香的抗炎作用能有效減輕模型大鼠的痛覺過敏現象，因此靶向神經炎性反應可能是神經病理性疼痛治療的新方向。近年來的研究表明miRNA參與調控神經病理性疼痛的炎性反應，Bao等[17]研究發現miR-28-5p過表達能顯著抑制神經病理性疼痛大鼠體內IL-1β、IL-6等炎性因子表達水平并緩解大鼠痛覺異常等不良表現。Lu等[18]研究發現，miRNA-146a-5p可通過抑制星形膠質細胞中的TNF受體相關因子6(TRAF6)的表達來減輕炎性反應，進而減輕脊神經結扎誘導的神經病理性疼痛。miR-338-3p是miRNA的一員，與機體炎性反應調節密切相關[19]研究發現低表達的miR-338-3p能激活內皮細胞炎癥信號通路，而過表達miR-338-3p能顯著抑制相關炎癥通路的激活，可能與神經病理性疼痛疾病聯系密切[20,21]。

本研究結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠背根神經節組織中TNF-α、IL-1β、IFN-γ表達水平顯著升高，提示神經病理性疼痛與神經炎性反應密切相關；與模型組比較，miR-338-3p組大鼠背根神經節組織中炎性因子表達水平、MWT、TWL值均顯著降低，提示過表達miR-338-3p能顯著降低神經病理性疼痛引起的神經炎性反應，并具有一定的緩解神經病理性疼痛的作用。

采用TargetScan數據庫結果對miR-338-3p靶基因進行預測，結果顯示miR-338-3p在CaMKⅡγ mRNA 3’UTR存在相應的結合位點，CaMKⅡγ是CaMKⅡ家族成員之一，與神經元損傷、中樞神經痛覺過敏等方面聯系密切[22,23]，Pan等[24]研究發現完全弗氏佐劑誘導的慢性炎癥痛小鼠脊髓中CaMKⅡγ表達水平顯著升高，miR-219過表達可顯著降低CaMKⅡγ的表達，并顯著減輕小鼠的痛反應異常等行為。本研究結果顯示，與模型組比較，miR-338-3p組及miR-338-3p+CaMKⅡγ組大鼠CaMKⅡγ mRNA及蛋白表達水平、背根神經節組織中TNF-α、IL-1β、IFN-γ表達水平均顯著降低，熒光素酶實驗結果顯示miR-338-3p過表達能顯著下調野生型CaMKⅡγ-3’UTR熒光素酶活性，表明在脊根神經節中miR-338-3p可直接作用于CaMKⅡγ的3’UTR區，進而調控CaMKⅡγ的基因表達。與miR-338-3p組比較，miR-338-3p+CaMKⅡγ組大鼠CaMKⅡγ mRNA及蛋白表達水平、背根神經節組織中TNF-α、IL-1β、IFN-γ表達水平均顯著升高，表明miR-338-3p可能通過靶向抑制CaMKⅡγ表達，進而降低神經病理性疼痛引起的神經炎性反應。

綜上所述，miR-338-3p可能通過抑制CaMKⅡγ的表達緩解神經病理性疼痛大鼠的痛覺過敏及神經炎性反應，這可能為臨床治療神經病理性疼痛提供新思路，但本研究并未采用CaMKⅡγ相關干擾技術進行對比實驗，因此仍需深入研究。