LncRNA HAND2-AS1靶向調控miR-106b-5p對IL-1β誘導軟骨細胞損傷的影響

徐立 張旭然 張淼

骨關節炎是以關節軟骨發生退行性病變為主要病理特征的關節疾病[1]。IL-6等炎性因子的異常分泌可引起炎性反應[2]。軟骨細胞凋亡等還可造成細胞損傷進而促進骨關節炎進展，白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)可影響軟骨細胞凋亡、關節軟骨細胞基質合成，參與骨關節炎進展過程，并可用于建立骨關節炎體外細胞損傷模型[3]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)在骨關節炎中表達異常，且富含微小RNA(miRNA)反應元件，并可通過調節miRNA表達而參與骨關節炎發生及發展過程[4]。LncRNA HAND2-AS1在類風濕性關節炎中表達下調，并可抑制類風濕性關節炎成纖維細胞樣滑膜細胞增殖[5]。但HAND2-AS1在骨關節炎發生發展過程中的作用機制尚未可知。LncBase Predicted v.2預測到miR-106b-5p與HAND2-AS1與存在互補片段。miR-106b-5p在骨關節炎中表達上調，抑制其表達可減緩骨關節炎進展[6]。因此，本研究以IL-1β誘導人正常軟骨細胞C28/I2模擬骨關節炎細胞損傷過程，探討HAND2-AS1是否可通過靶向調控miR-106b-5p的表達從而影響IL-1β誘導的軟骨細胞損傷。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2020年2～6月本院收治的17例骨關節炎患者為骨關節組，男9例，女8例；年齡52～70歲，平均年齡(61.12±5.11)歲；所有患者符合骨關節炎診斷標準。同時選取交叉韌帶損傷患者17例為對照組，男10例，女7例；年齡53～70歲，平均年齡(62.35±3.16)歲。2組性別比、年齡差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 材料與試劑 人正常軟骨細胞C28/I2購自美國ATCC；IL-1β購自美國Sigma；DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶、MTT、細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物；Trizol試劑與Lipofectamine 3000 Transfection Reagent購自美國Invitrogen；pcDNA、pcDNA-HAND2-AS1、miR-NC、miR-106b-5p mimic、anti-miR-NC、miR-106b-5p Inhibitor購自廣州銳博生物；IL-6、TNF-α檢測試劑盒購自上海酶聯生物；反轉錄與SYBR Green試劑盒購自北京天根生化。

1.3 方法

1.3.1 采集血液樣本：采集對照組、骨關節炎組患者空腹肘靜脈血3 ml，將其置于乙二胺四乙酸抗凝管內，經3 000 r/min轉速離心10 min，分離血漿后置于-80℃冰箱內保存。

1.3.2 實驗處理及分組：取1×104個C28/I2細胞接種于6孔板，加入含有10 ng/ml IL-1β的培養基孵育24 h[7]，記為IL-1β組。同時將正常培養的C28/I2細胞記為對照組。細胞轉染：用不含胎牛血清的細胞培養液分別稀釋pcDNA、pcDNA-HAND2-AS1、anti-miR-NC、miR-106b-5p Inhibitor、pcDNA-HAND2-AS1+miR-NC、pcDNA-HAND2-AS1+miR-106b-5p mimic，用不含胎牛血清的細胞培養液稀釋Lipofectamine 3 000 Transfection Reagent，轉染物與轉染試劑稀釋液充分混勻后室溫孵育20 min，然后將混合液按照每孔400 μl加入6孔板中，6 h后棄上清液，更換正常培養液后繼續培養48 h。實驗分組：按照上述脂質體轉染法將pcDNA、pcDNA-HAND2-AS1、anti-miR-NC、miR-106b-5p Inhibitor、pcDNA-HAND2-AS1+miR-NC、pcDNA-HAND2-AS1+miR-106b-5p mimic分別轉染至C28/I2細胞，轉染成功后加入含有濃度為10 ng/ml IL-1β的培養基培養24 h，分別記為IL-1β+pcDNA組、IL-1β+pcDNA-HAND2-AS1組、IL-1β+anti-miR-NC組、IL-1β+miR-106b-5p Inhibitor組、IL-1β+pcDNA-HAND2-AS1+miR-NC組、IL-1β+pcDNA-HAND2-AS1+miR-106b-5p mimic組。

1.3.3 qRT-PCR檢測HAND2-AS1、miR-106b-5p的表達水平：采用Trizol試劑分別提取對照組血漿、骨關節炎組血漿與各組C28/I2細胞總RNA，反轉錄合成cDNA，再按照正向引物0.4 μl，反向引物0.4 μl，cDNA 2 μl，SYBR Green Master Mix 10 μl，ddH2O 7.2 μl 制備PCR擴增體系。采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

1.3.4 MTT檢測細胞增殖：每組3×103個C28/I2細胞接種于96孔板，各孔內添加MTT溶液20 μl，孵育4 h，棄上清，各孔內添加150 μl DMSO，避光振蕩孵育5 min，應用酶標儀讀取各孔吸光度值(A490 nm)，計算細胞增殖抑制率[(對照組A-實驗組A)/(對照組A-空白組A)×100%]。

1.3.5 流式細胞術檢測細胞凋亡率：用胰蛋白酶消化各組C28/I2細胞(5×105個/ml)，預冷PBS洗滌，加入500 μl結合緩沖液重新懸浮細胞，加入5 μl Annexin V-FITC與5 μl PI室溫避光染色15 min，于1 h內上流式細胞儀分析細胞凋亡率。

1.3.6 ELISA法檢測IL-6、TNF-α的水平：采用ELISA試劑盒檢測各組C28/I2細胞液上清中IL-6、TNF-α的水平。

1.3.7 雙熒光素酶報告實驗檢測HAND2-AS1與miR-106b-5p的靶向關系：采用分子克隆的方法分別將HAND2-AS1與miR-106b-5p的結合位點克隆至pGL3質粒中構建野生型載體WT-HAND2-AS1，同時將含有突變位點的HAND2-AS1片段克隆至pGL3質粒中構建突變型載體MUT-HAND2-AS1，采用脂質體轉染法將WT-HAND2-AS1、MUT-HAND2-AS1分別與miR-NC或miR-106b-5p mimic共轉染至C28/I2細胞，于培養箱內培養48 h后檢測細胞相對熒光素酶活性。

2 結果

2.1 骨關節炎患者血漿中HAND2-AS1和miR-106b-5p的表達 骨關節炎組患者血漿中HAND2-AS1的表達量低于對照組(P<0.05)，miR-106b-5p的表達量高于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 骨關節炎患者血漿中HAND2-AS1和miR-106b-5p表達的檢測

2.2 HAND2-AS1靶向調控miR-106b-5p HAND2-AS1與miR-106b-5p存在結合位點。過表達miR-106b-5p可降低WT-HAND2-AS1的熒光素酶活性(P<0.05)。表明HAND2-AS1與miR-106b-5p存在靶向調控作用。pcDNA-HAND2-AS1組miR-106b-5p表達量低于pcDNA組(P<0.05)。見圖1，表2、3。

圖1 HAND2-AS1和miR-106b-5p的互補序列

表2 雙熒光素酶報告實驗

表3 HAND2-AS1調控miR-106b-5p的表達

2.3 HAND2-AS1對IL-1β處理的軟骨細胞損傷及炎性因子的影響 與con組比較，IL-1β組細胞IL-6、TNF-α的水平升高(P<0.05)，細胞增殖抑制率和凋亡率升高(P<0.05)；與IL-1β組、IL-1β+pcDNA組比較，IL-1β+pcDNA-HAND2-AS1組細胞IL-6、TNF-α的水平降低(P<0.05)，細胞增殖抑制率和凋亡率降低(P<0.05)。見圖2，表4。

圖2 HAND2-AS1抑制IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡

表4 HAND2-AS1對IL-1β作用的軟骨細胞損傷及炎性因子的檢測

2.4 抑制miR-106b-5p對IL-1β作用的軟骨細胞損傷及炎性因子的影響 與IL-1β+anti-miR-NC組比較，IL-1β+miR-106b-5p Inhibitor組細胞增殖抑制率和細胞凋亡率降低(P<0.05)，miR-1066-5p、IL-6、TNF-α的水平降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖3，表5。

圖3 抑制miR-106b-5p抑制IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡

表5 抑制miR-106b-5p對IL-1β作用的軟骨細胞損傷及炎性因子的檢測

2.5 miR-106b-5p對HAND2-AS1處理的IL-1β作用的軟骨細胞損傷及炎性因子的影響 與IL-1β+pcDNA-HAND2-AS1+miR-NC組比較，IL-1β+pcDNA-HAND2-AS1 +miR-106b-5p mimic組細胞增殖抑制率和細胞凋亡率升高(P<0.05)，IL-6、TNF-α的水平升高(P<0.05)。見表6，圖4。

表6 miR-106b-5p可減弱HAND2-AS1對IL-1β作用的軟骨細胞損傷及炎性因子的作用

圖4 miR-106b-5p可減弱HAND2-AS1對IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡的抑制作用

3 討論

LncRNA在骨關節炎中表達異常，并可調控miRNA/mRNA分子軸而參與IL-1β誘導的軟骨細胞損傷過程，還可能作為骨關節炎治療的潛在靶點[8-10]。HAND2-AS1在骨關節炎中表達下調，并可促進軟骨細胞炎性反應的發生[11]。HAND2-AS1在糖尿病腎病中表達水平降低，上調其表達可減緩該疾病發展進程[12]。本研究結果顯示，IL-1β誘導的軟骨細胞增殖抑制率和細胞凋亡率升高，與相關文獻報道結果[13]相似，提示成功誘導軟骨細胞損傷模型。本研究分析顯示，骨關節炎患者血漿中HAND2-AS1的表達量降低，提示HAND2-AS1過表達可促進IL-1β誘導的軟骨細胞增殖及抑制細胞凋亡從而減輕細胞損傷。本研究結果顯示，IL-1β誘導的軟骨細胞IL-6、TNF-α的水平升高，與相關文獻報道結果[14]相似，本研究顯示HAND2-AS1過表達則降低IL-6、TNF-α的水平，提示HAND2-AS1過表達可抑制IL-1β誘導的軟骨細胞炎性反應從而減輕細胞損傷。

miR-106b-5p在脂多糖(LPS)誘導的腎小管上皮細胞中表達上調，并可抑制細胞增殖[15]。miR-106b-5p在顳葉癲癇中表達上調，敲低其表達可促進神經細胞增殖及抑制細胞凋亡從而減輕細胞損傷[16]。miR-106b-5p在氧-葡萄糖剝奪和再灌注誘導的神經細胞中表達水平升高，抑制miR-106b-5p其表達可促進神經細胞增殖，抑制細胞凋亡，從而氧-葡萄糖剝奪和再灌注誘導的損傷[17]。本研究結果顯示，骨關節炎患者血漿中miR-106b-5p的表達量升高，抑制其表達可提高軟骨細胞增殖能力，抑制IL-1β誘導的細胞凋亡和炎性反應，然而上調miR-106b-5p表達可減弱HAND2-AS1過表達對IL-1β誘導軟骨細胞損傷的保護作用。提示HAND2-AS1可通過靶向調控miR-106b-5p的表達而促進IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡、炎性反應從而加重細胞損傷進而參與骨關節炎發生及發展過程。

綜上所述，骨關節炎患者血漿中HAND2-AS1的表達量降低，miR-106b-5p的表達量升高，HAND2-AS1過表達可通過靶向抑制miR-106b-5p的表達而促進IL-1β誘導的軟骨細胞增殖及抑制細胞凋亡、炎性反應從而減輕細胞損傷，HAND2-AS1/miR-106b-5p分子軸在骨關節炎發生及發展過程中可發揮重要調控作用，并可能作為骨關節炎治療的潛在靶點。