結核分枝桿菌的檢測及分子生物學技術應用研究

杜磊

（河口縣人民醫院檢驗科，云南 河州 661300）

當前我國針對肺結核疾病的治療原則是盡早診斷，及時隔離、積極治療控制，在基本政策下，雖然患病數量總體呈現下降趨勢、治愈率不斷提高，但是肺結核疾病在我國公共衛生體系中始終不容忽視，因為肺結核疾病傳染渠道簡單，可通過空氣完成傳播，免疫系統能力差的群體極易感染，加上近年來我國老年人群數量不斷上升，結核病疾病發病率始終十分嚴峻[1-2]。過往常見的分歧桿菌診斷辦法通暢以快速培養計數檢查作為重要手段，方法主要依靠結合分歧桿菌極短的生長周期，將痰液進行分離后進行培養，該實驗組理論簡單，但實際過程較為繁瑣，在多個過程中可能會出現外界感染的情況，從而影響了最終結果。隨著檢測技術的發展，當前我國針對結合分歧桿菌的診斷方式多樣，包括細菌學檢測方法、免疫學檢測方法、噬菌體生物擴增法、分子生物學檢測方法等[3]。在諸多檢測方法中，PCR是應用較為廣泛且準確性極高的一種診斷方法，相較于細菌學檢測中圖片與染色檢查等方法，PCR技術操作更為方便，時至今日，分子生物學技術在肺結核診斷中的應用已經不可缺少[4]。本文以PCR檢測技術為例，與圖片染色檢查法進行對比，評價分子生物學技術的應用效果與價值，內容如下。

1 資料與方法

2.1 一般資料

綜合研究標準與排除標準從2020年6月至2021年6月時間段內在我院接受檢查治療的疑似肺結核患者中選取220例為研究對象，入選研究對象男女比116/104，患者年齡28 ～81（45.6±12.9）歲。所有患者均出現不同程度的結核病疑似癥狀，患者知曉本次研究的兩種檢查方法，事先進行健康知識宣教，患者知悉且同意研究，研究經倫理會通過。

2.2 方法

對照組數據來源于常規痰涂片檢測，檢測方法概述如下：集中收集患者痰液樣本，按照操作規定進行檢測，接種環挑取適量痰液樣本，制作厚膜涂片，規格為15 mm*20 mm。等待涂片自然干燥，隨后采用火焰進行固定。染色材料選用石碳酸復紅染液，應用鹽酸溶液（3%）脫色處理。滴加染色后采用呂氏美藍液再次進行染色操作，持續時間30 s，涂片予以復染色2 min，確定樣本可用后按照抗酸染色鏡檢結果進行分級觀察，確定涂片陰陽性。

實驗組數據來源于PCRDNA檢查辦法，檢測方法概述如下：收集痰液樣本，在痰液樣本中適量加入等體積液化液，充分震蕩混合，在37℃條件下持續液化，持續時間為30 min，最終獲得液化樣本。隨后抽取液化樣本約1 mL，置于離心管。設置離心數據：離心速度為12000r/min，離心時間為5 min，確定離心效果。去除上清液后，繼續添加1 mL生理鹽水到離心管中，持續震蕩，再次進行離心處理，設置離心數據：離心速度為12000 r/min，離心時間為5 min，再次清除上清液。次予以清除上清液。提取階段:離心管內加人60μL和旋提取液,充分渦旋振蕩并混合后,轉人至核酸提取試管內，開啟核酸快速提取設備,充分振蕩5 min,準備95℃的水,核酸提取管水浴5 min,取出后離心處理60 s,獲取核酸,抽樣2μL予以擴增實驗并記錄。置ABI7000熒光定量PCR儀上運行PCR程序。PCR擴增參數：反應管在93C保溫2 min,先按93℃45 s→55℃60 s循環10次，再按93℃30 s→55℃45 s循環30次，熒光檢測在第2次循環55℃45 s時完成。根據說明書的結果判斷標準進行結果分析。

1.3 觀察指標

（1）陽性率：參照各檢查方法診斷依據進行陽性率判斷；（2）準確率：參照細菌培養結果確定準確率。

1.4 統計學方法

將數據納入SPSS 23.0軟件中分析，計量資料比較采用t檢驗，并以（±s）表示，率計數資料采用χ2檢驗，并以率（%）表示，（P＜0.05）為差異顯著，有統計學意義。

2 結果

2.1 陽性率

患者在經過兩種不同方法檢查后，根據數據可知PCR檢查方法檢出陽性率顯著更高，對比常規圖片檢查方法有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 陽性率[n（%）]

2.2 準確率

參照細菌培養結果，實驗組數據準確率明顯更高，對比對照組數據有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 準確率[n（%）]

3 討論

結核分歧桿菌能夠直接引起的人類疾病為結核病，該疾病具有顯著傳染性，目前已經是我國衛生系統重點防治的疾病之一，疾病傳染性具有全年齡段、多器官入侵的特點，其中以肺部感染最為顯著。目前臨床研究表明，最直接的傳播途徑為呼吸道傳染，目前我國城市人口密度不斷增加，結核分歧桿菌的傳染率相較于以往更高，對于醫療系統而言有效診斷并且阻斷其傳播對于疾病防控有重要意義[5]。雖然我國當前醫療衛生條件不斷發展，居民健康知識水平不斷提高，結核病仍然是我國形勢嚴峻的公共衛生問題，有數據顯示，2020年中國肺結核發病數為670538人，同比下降13.6%，2020年中國肺結核死亡數為1919人，同比下降35.8%[6-7]。雖然結核病疾病防治整體效果顯著，但由于結核病傳播渠道簡單，疾病的診斷與控制始終是不可松懈的環節。

目前認為，針對結核病疾病的防治應當分為診斷+防治結構建設兩個步驟，我國應用的“三位一體服務模式”在結核病的防治中效果理想，通過定點醫院實施三位一體服務模式是我國定點醫院最重要的執行基礎[8]。作為定點醫院，應當有明確的管理組織，選取分管院長為管理人員，同時應當納入公共衛生科相關成員共同組成管理協調小組，首先明確院內工作，建立起聯合放射科、門診、公共衛生科等部門的聯合工作制度，落實工作職責，明確醫院內部的等級、轉診程序以及報告工作流程，在聯合部門中落實結核病患者登記本工作，明確負責結核病治療科室，實現院內發現，院內轉診的一體化防止工作制度[9]。同時院內有效建立結核病的監督機制，定期考核相關科室的結核病報告、轉診情況，定期進行系統通報。而在疾病的診斷中，早期開展有效篩查并實施治療是保證患者康復、降低疾病傳染率的重要前提，在常規檢測中，細菌檢測法十分常見，涂片檢查法是操作簡便，價格低廉，性價比高，是肺結核篩查的重要方法，但是在大量應用中，我們發現該辦法的陽性檢出率逐漸不能滿足臨床的診斷治療要求，更有效的檢查方法亟待應用[10-11]。

在過去，快速培養試驗、X-pert診斷等方法較為常見。快速培養試驗主要是利用24 h痰液進行培養后應用分析儀得出診斷結果，該實驗雖然簡單直接，但是過程相對比較繁瑣，同時容易受到其他細菌污染，影響了實驗結果。X-pert診斷則是半巢式實時熒光定量PCR體外診斷技術系統，將灌洗液和試劑按照2：1的比例進行混合，通過試劑盒之后放入Gene-pert檢測系統中，對樣品進行洗滌與過濾，通過超聲將樣品的核酸進行稀釋，當核酸DNA和PCR試劑充分混合之后再進行擴增，隨后呈現出相關的結果[12]。隨著分子生物學技術發展分子生物學技術是今年各大實驗室常用的一種檢查方法，該類技術包括核酸擴增檢測（NAAT）、PCR技術、DNA指紋圖譜技術、基因芯片技術、LAMP技術等[13]。PCR技術是1989年Hance等人首先將PCR用于結核分枝桿菌的檢測,原理是用各種分枝桿菌特異核苷酸對標本DNA進行擴增,根據擴增產物的特異片段進行鑒定。PCR技術是其他分子生物技術的基礎。同時PCR技術該類技術中應用最成熟、靈敏度相對較高、檢測較快、特異性較強的檢測技術，該技術利用一段DNA為模板，在DNA聚合酶和核苷酸底物共同參與下，將該段DNA擴增至足夠數量，以便進行結構和功能分析[14-15]。PCR檢測方法在臨床上快速診斷細菌性傳染病等方面具有極為重要的意義。在本研究中，不同方法檢查下，研究組數據來源方法陽性率顯著高于對照組數據來源方法，同時對比細菌培養結果確定213例（96.82%）為結核分歧桿菌攜帶患者，研究組檢查方法準確率顯著高于對照組檢查方法,差異有統計學意義（P＜0.05）。

綜上所述，在結核分歧桿菌的檢查中，相較于常規痰涂片檢查方法，應用PCR分子生物學檢查技術能夠進一步提高結核病菌的檢出率，該方法的應用在臨床結核病患者的診斷中起到重要作用，對于各地區的結核疾病控制有著重要意義，值得臨床推廣使用。