PPARδ調控自噬在GLP-1受體激動劑艾塞那肽改善胰島β細胞功能中的作用*

蘇燕娜， 林倍思， 陳亞蘭， 劉子瑜， 甘 露， 徐 芬， 許 雯

（中山大學附屬第三醫院內分泌與代謝病學科，廣東省糖尿病防治重點實驗室，廣東 廣州 510630）

胰島β 細胞數量下降及功能受損是2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）發生發展的重要病理生理過程［1］，相關機制研究一直受到人們關注。近年來有證據提示細胞自噬受損可能在胰島功能衰退的進展中發揮重要作用［2］。細胞自噬是細胞維持穩態的一種重要機制，可通過清除功能異常的細胞成分及產物來維持細胞能量水平、成分和代謝物平衡，減少細胞損傷。在T2DM 患者中，自噬受損導致線粒體質量下降，損傷的線粒體堆積，加重高血糖的惡化；而通過誘導自噬清除損傷的線粒體后，患者胰島功能明顯改善，血糖可得到進一步控制［3］，以上結果提示細胞自噬與胰島功能間存在聯系。

過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs）是調節目標基因表達的核內受體轉錄因子超家族，包括PPARα、PPARγ及PPARδ，在代謝疾病，如高脂血癥及糖尿病中 發揮 重 要作 用［4］。相 對 于 PPARα 及 PPARγ，PPARδ 在體內表達更為廣泛，同時涉及脂肪酸代謝及糖代謝［5］。已有研究發現PPARδ 在胰島素瘤細胞及大鼠胰腺組織中表達水平最高［6］。PPARδ 不僅在改善糖脂代謝作用中扮演著重要角色，也有研究提示其可能在自噬通路中起著重要的正向調控的作用［7］。

胰高血糖素樣肽1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）受體激動劑艾塞那肽（exenatide/exendin-4，Exe）是一種重要的降糖藥物，可通過多種作用機制降低血糖［8］。而除了降糖以外，GLP-1 受體激動劑Exe 還可改善胰島功能，但具體機制尚未完全闡明。近年來有研究提示，GLP-1 受體激動劑可以減少RINm5F 大鼠胰島β 細胞因高糖高脂所致自噬受損［9］。而另一項研究發現GLP-1 受體激動劑可以促進 PPARδ 表達，改善心肌纖維化［10］。但在胰島 β 細胞中，GLP-1 受體激動劑是否能通過PPARδ 改變自噬過程進而改善胰島功能，尚未有相關研究探索。因此，本研究擬利用高脂誘導構建的T2DM 小鼠模型、原代胰島及小鼠胰島素瘤細胞株NIT-1，在動物及細胞層面探討自噬在GLP-1 受體激動劑艾塞那肽對胰島功能影響中的作用，并初步探索PPARδ 是否介導這一作用。

材料和方法

1 材料

1.2 主要儀器 熒光倒置顯微鏡及體視顯微鏡（Leica）；雙色紅外成像系統（奧德賽）；全自動酶標儀（Thermo）；血糖儀及血糖試紙（強生穩豪）。

2 方法

2.1 動物實驗分組造模及干預方法 4 周齡C57BL/6J 雄性小鼠購于南京動物模式研究所［生產許可證號：SCXK（蘇）2015-0001］，適應性喂養1 周后，根據空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）和體重隨機分為正常飲食對照（normal diet control，NC）組和高脂飲食（high-fat diet，HFD）組，分別給予普通飼料（脂肪13%、蛋白質28%、碳水化合物59%）和高脂飼料（脂肪60%、蛋白質20%），飼養12周。HFD組小鼠FPG≥11.1 mmol/L 且糖耐量受損提示T2DM 小鼠模型成功構建。T2DM 小鼠隨機分為2 組：HFD+Exe 組及HFD+生理鹽水（saline）組，2 組小鼠分別予腹腔內注射 Exe（24 nmol·kg-1·d-1）和生理鹽水 8 周，NC 組小鼠腹腔內注射等量生理鹽水作為對照，每組10 只。每周稱量小鼠體重，每4 周測FPG。在高脂12周時和藥物干預結束時進行糖耐量實驗。干預結束后，麻醉后頸椎脫臼處死小鼠，每組3 只小鼠留取胰腺組織，置于4%多聚甲醛中固定后包埋，行石蠟組織切片，其余小鼠胰腺組織用于提取原代胰島。以上動物實驗已通過中山大學實驗動物委員會批準，批文號為：SYSU-IACUC-2018-000234。

2.2 腹腔注射葡萄糖耐量實驗（intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT） 小鼠隔夜禁食，腹腔內注射葡萄糖（2 g/kg），于注射前（0 min）及注射后15、30、60、90和120 min時測定血糖水平，并計算曲線下面積（area under curve，AUC）。

2.3 腹腔注射胰島素耐量實驗（intraperitoneal insulin tolerance test，IPITT） 小鼠禁食6 h，腹腔內注射胰島素（0.65 U/kg），于注射前（0 min）及注射后15、30、60、90和120 min時測定血糖水平，并計算AUC。

2.4 小鼠原代胰島的提取 小鼠麻醉取血后處死。打開腹腔，充分暴露十二指腸大乳頭和膽總管。在靠近肝臟處夾閉膽總管后，于十二指腸大乳頭處穿刺，注入膠原酶（0.5 g/L，2 mL）后取出胰腺，于37 ℃水浴，消化至細沙狀。用含10%FBS的HBSS緩沖液終止消化后4 ℃、1 000 r/min 離心1 min，棄上清。加入HBSS 緩沖液10 mL 重懸后離心，棄上清。加入梯度離心液5 mL，充分吹打后緩慢加入HBSS 緩沖液5 mL，4 ℃、1 500 r/min 梯度離心 20 min 后，再收集上清，離心沉淀胰島。于體式顯微鏡下挑取包膜完整的胰島，用于提取胰島總蛋白。

2.5 胰腺組織免疫熒光 石蠟切片脫蠟后，抗原修復及封閉，滴加Ⅰ抗于濕盒內4 ℃孵育過夜。用磷酸鹽緩沖液清洗3 遍后滴加Ⅱ抗室溫孵育1 h，清洗3遍后滴加DAPI 染液室溫孵育10 min 染核，再次清洗3 遍后，于熒光倒置顯微鏡下觀察并采集圖像，使用Image-Pro Plus 6.0軟件分析熒光強度。

2.6 細胞培養與干預方法 NIT-1 細胞株購于美國模式培養物集存庫（American Type Culture Collection，ATCC）。（1）NIT-1 細胞培養于含10%FBS 和 1%雙抗的F-12K 培養基中；（2）細胞實驗分為兩部分，一部分將 NIT-1 細胞分為 BSA（10%）組、PA（400 μmol/L）組、PA+Exe（20 nmol/L）組和PA+GW501516（10 μmol/L）組，另一部分將NIT-1 細胞分為BSA 組、PA 組、PA+Exe 組、PA+GSK0660（1 μmol/L）組和 PA+Exe+GSK0660 組，共干預24 h；（3）利用CRISPR/Cas9基因編輯技術，使用插入sgRNA 片段的lentiCRISPRv2 載體在 NIT-1 細胞中靶向敲除PPARδ基因，以空白lentiCRISPRv2 載體作為陰性對照，并使用嘌呤霉素（2 mg/L）篩選穩定敲除PPARδ基因的細胞（PPARδknockout，PPARδ-KO）和對照細胞（PPARδwild type，PPARδ-WT），分別采用BSA、PA及PA+Exe干預PPARδ-KO和PPARδ-WT細胞24 h。

2.7 葡萄糖刺激胰島素釋放實驗（glucose-stimulated insulin secretion，GSIS） 干預結束后，將細胞分別在 含 2.8 mmol/L 和 16.7 mmol/L 葡 萄 糖 的 KRBH 緩沖液中，37 ℃各孵育1 h 后收集上清，按照小鼠胰島素ELISA 試劑盒說明書檢測上清液中胰島素含量。收集細胞，測量細胞總蛋白濃度作為數據校正。

2.8 蛋白提取及Western blot 用RIPA 裂解提取各組蛋白，用BCA 試劑盒進行蛋白濃度測定后配平。電泳后轉于PVDF 膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，按1∶1 000稀釋加入Ⅰ抗（PPARδ、LC3B、P62和β-actin 抗體）4 ℃孵育過夜，用Ⅱ抗（1∶10 000）室溫避光孵育1 h后，雙色紅外成像系統掃描。

安裝成功后，首先要進行項目參數設置，如圖5所示；其次是確定審核范圍，以便正確的讀取需要審核的圖層信息，然后分別進行框架梁、柱的施工圖信息讀取并按照步驟分別進行審查。

3 統計學處理

采用SPSS 20.0 軟件進行分析，并采用Graph-Pad Prism 8 繪圖。所有數據均進行正態性及方差齊性檢驗，正態分布的連續變量以均數±標準誤（mean±SEM）表示。兩組間比較用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，并用LSD-t檢驗進行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 Exe 降低T2DM 小鼠體重和FPG，并改善胰島功能

HFD12周時，HFD組小鼠的體重和FPG與NC組相比明顯升高（P＜0.05）。HFD 組小鼠 FPG≥11.1 mmol/L，葡萄糖及胰島素耐量結果提示HFD 后小鼠胰島功能受損（P＜0.05），見圖1。結果提示，HFD12周時T2DM小鼠模型構建成功。

Figure 1. Comparison of body weight（A），FPG（B），IPGTT（C）and IPITT（D）between NC group and HFD group at 12 weeks of HFD. Mean±SEM. n=10.*P＜0.05 vs NC group.圖1 高脂飲食12周時NC組與HFD組小鼠體重、FPG、IPGTT和IPITT的比較

由圖2 可見，與HFD+saline 組相比，在給予Exe治療后的小鼠體重和FPG 明顯下降，葡萄糖耐量受損情況有明顯改善（P＜0.05）。結果提示，Exe 可以降低T2DM小鼠體重和FPG，改善糖耐量受損情況。

2 Exe 對 T2DM 小鼠胰島細胞自噬和 PPARδ 表達的影響

Figure 2. Changes of body weight（A），FPG（B），IPGTT（C）and IPITT（D）of mice in each group after exenatide（Exe）intervention for 8 weeks. Mean±SEM. n=10.*P＜0.05 vs NC group；#P＜0.05 vs HFD+saline group.圖2 艾塞那肽干預8周時各組小鼠體重、FPG、IPGTT和IPITT的變化

由圖3 免疫熒光結果可見，與NC 組相比，HFD+saline 組小鼠胰島LC3B 表達明顯下降（P＜0.05）；與HFD+saline 組相比，在 Exe 治療后小鼠胰島 LC3B 表達升高（P＜0.05）。為了進一步探索Exe 對胰島細胞自噬水平和PPARδ 表達的影響，我們提取了藥物干預后小鼠原代胰島細胞的總蛋白，Western blot 檢測蛋白也得到了一致的結果：與NC 組對比，HFD+saline 組小鼠胰島細胞LC3B-II 蛋白表達降低、P62 蛋白表達升高、PPARδ 蛋白表達降低；而Exe 治療后可以明顯升高LC3B-II 蛋白的表達量，降低P62 蛋白的表達量，同時可顯著上調PPARδ 蛋白的表達量（P＜0.05），見圖4。以上結果提示，T2DM 小鼠胰島細胞自噬受損、PPARδ 蛋白表達量下降，而GLP-1 受體激動劑Exe可促進胰島自噬及PPARδ蛋白的表達。

3 Exe及GW501516對NIT-1細胞功能的影響

GSIS 結果顯示，NIT-1 細胞在低糖（2.8 mmol/L）環境下，BSA 組、PA 組、PA+Exe 組和 PA+GW501516組各組間基礎胰島素分泌量無統計學差異。在高濃度葡萄糖（16.7 mmol/L）刺激下，與BSA 組對比，PA干預后NIT-1 細胞胰島素分泌量明顯減少（P＜0.05）；與 PA 組 相 比 ，Exe 和 PPARδ 激 動 劑GW501516 干預組NIT-1 細胞在高糖刺激下胰島素的分泌量顯著增加（P＜0.05），見圖5A。說明GLP-1受體激動劑 Exe 和 PPARδ 激動劑 GW501516 均有助于改善高脂環境下損傷的胰島β細胞功能。

Figure 3. LC3B immunofluorescence staining and quantitative analysis in pancreatic tissues. Mean±SEM. n=5.*P＜0.05 vs NC group；#P＜0.05 vs HFD+saline group.圖3 胰腺組織LC3B免疫熒光染色及定量分析

Figure 4. Effect of Exe on the protein expression of PPARδ，LC3B-II and P62 in islet. Mean±SEM. n=3.*P＜0.05 vs NC group；#P＜0.05 vs HFD+saline group.圖4 艾塞那肽對胰島細胞PPARδ、LC3B-II和P62蛋白表達的影響

4 Exe及GW501516對NIT-1細胞自噬的影響

與 BSA 組相比，PA 干預后 NIT-1 細胞 PPARδ 和LC3B-II 蛋白表達降低、P62 蛋白表達升高；與 PA 組相比，Exe 及GW501516 干預后可以明顯升高PPARδ和LC3B-II 蛋白表達，降低P62 蛋白表達（P＜0.05），見圖5B。以上結果提示GLP-1 受體激動劑Exe 和PPARδ 激動劑 GW501516 均可以減輕 NIT-1 細胞因高脂所致自噬損傷。

5 Exe通過上調PPARδ促進胰島β細胞自噬

Figure 5. Effect of Exe and GW501516 on the GSIS（A）and protein expression of PPARδ，LC3B-II and P62（B）in NIT-1 cells.Mean±SEM. n=4.*P＜0.05 vs BSA group；#P＜0.05 vs PA group.圖5 Exe及GW501516對NIT-1細胞GSIS及PPARδ、LC3B-II和P62蛋白表達的影響

與 PA 組相比，Exe 干預 NIT-1 細胞后 LC3B-II 蛋白表達升高，P62 蛋白表達降低，而 PPARδ 拮抗劑GSK0660 干預組 LC3B-II 蛋白表達下調，P62 蛋白表達上調；與 PA+Exe 組對比，PA+Exe+GSK0660 干預組NIT-1 細胞LC3B-II 蛋白表達減少，P62 蛋白表達增加（P＜0.05），見圖6。為進一步驗證PPARδ在Exe調控β細胞自噬中的作用，通過CRISPR/Cas9技術構建PPARδ基因敲除模型，結果顯示，與PPARδ-WT 細胞對比，PPARδ基因敲除后LC3B-II 蛋白表達降低，P62蛋白表達增多；而在PPARδ-KO細胞中，Exe干預后LC3B-II 及P62 蛋白表達與PA 組對比均無明顯改變，見圖7。以上結果說明，GLP-1受體激動劑Exe可能通過上調PPARδ促進胰島β細胞自噬作用。

討 論

GLP-1 是由胃腸道分泌的一類參與血糖調節的激素，通過中樞性抑制食欲、葡萄糖濃度依賴性促進胰島素釋放及抑制胰高糖素分泌、延緩胃排空等作用從而降低血糖，并具有較明顯的減重作用，在能量代謝中發揮重要作用［11］。更令人關注的是，GLP-1促進胰島β 細胞增殖和抑制凋亡的作用已在多項動物研究中得到證實［12-13］。與GLP-1 有53%同源性的GLP-1受體激動劑艾塞那肽可高度親和GLP-1受體，因此可模擬天然GLP-1 的生理效應。既往多項臨床研究均已證實GLP-1 受體激動劑對糖代謝、胰島功能及胰島素抵抗的改善作用［14-16］。本研究在高脂誘導的T2DM小鼠中同樣證實了GLP-1受體激動劑Exe干預8 周后可以顯著降低T2DM 小鼠體重及FPG，并改善小鼠葡萄糖耐量受損情況。

細胞自噬是蛋白質在膜包囊泡中降解的生物學過程，通過對受損細胞器和老化蛋白質等大分子物質進行降解進而維持細胞內環境穩定及細胞的完整性［17］。越來越多的證據顯示，自噬在T2DM 的病理生理過程中發揮重要作用，但其對胰島功能的作用仍存在爭議。有研究發現，PA 干預后可以增加胰島β 細胞系 INS-1 細胞自噬［18］。在糖尿病小鼠中發現胰島自噬上調［19］。另一方面，也有研究發現自噬受損導致了 β 細胞功能障礙及 T2DM 發展［20］。Liu 等［3］研究發現，糖尿病小鼠胰島中β 細胞自噬通量受損。在胰島β細胞中抑制自噬后，β細胞功能受損且凋亡增加［21］。很多學者認為，自噬的提高抑制了脂毒性對胰島β 細胞的損害，從而保護了胰島β 細胞功能［22］。

Figure 6. Effect of Exe and GSK0660 on autophagy in NIT-1 cells. Mean±SEM. n=3.*P＜0.05 vs BSA group；#P＜0.05 vs PA group；△P＜0.05 vs PA+Exe group；▲P＜0.05 vs PA+GSK0660 group.圖6 Exe及GSK0660對NIT-1細胞自噬的影響

Figure 7. Effect of Exe on autophagy of PPARδ-KO NIT-1 cells. A：representative immunoblot bands of PPARδ in PPARδ-KO NIT-1 cells；B：representative immunoblot band and quantitative analysis of LC3B-II and P62 in PPARδ-KO NIT-1 cells，which were incubated with Exe for 24 h. PPARδ-WT：NIT-1 cells with wlid-type PPARδ gene. Mean±SEM. n=3.*P＜0.05 vs BSA group；#P＜0.05 vs PPARδ-WT group.圖7 Exe對PPARδ-KO NIT-1細胞自噬的影響

目前有關GLP-1 受體激動劑通過自噬影響胰島功能的機制研究相對較少。Chen 等［23］學者發現，GLP-1 受體激動劑可以促進MIN6 細胞自噬，通過抑制胰淀粉樣多肽形成保護β 細胞功能。在本研究中發現，T2DM 小鼠胰島自噬標志物LC3B 熒光表達降低，T2DM 小鼠胰島和PA 誘導的NIT-1 細胞中發現LC3B-II 蛋白表達降低，P62 蛋白表達升高。LC3 家族蛋白包括LC3A、LC3B 及LC3C，目前研究最多和了解較深入的LC3 家族蛋白是LC3B。LC3B 對于自噬的執行是必不可少的［24］。LC3 存在兩種形式，LC3-Ⅰ和LC3-II。LC3-II 與自噬小體特異性結合，含量與自噬小體形成的程度相關，是研究自噬的一個很好的標記物［25］。另外，當自噬活性減弱或自噬系統受損時，P62 蛋白會在細胞質中不斷積累，因而P62也是反映自噬活性的重要標記蛋白之一，其蛋白含量間接反映自噬小體清除水平，與自噬流呈負相關［26］。因此，以上結果說明在T2DM 小鼠胰島及PA誘導的NIT-1 細胞中自噬減弱，但在GLP-1 受體激動劑Exe 干預后，T2DM 小鼠胰島LC3B 熒光表達升高，小鼠胰島及NIT-1 細胞LC3B-II 蛋白表達升高，P62蛋白表達降低，說明GLP-1受體激動劑Exe可促進胰島自噬作用。

PPARs 是調節目標基因表達的核內受體轉錄因子超家族，成員包括PPARα、PPARγ 及PPARδ。在2003 年發現了PPARδ 的特異性選擇性激動劑GW501516 后，PPARδ 的生物學功能研究逐漸受到關注。相對于PPARα 及PPARγ，PPARδ 在體內表達更為廣泛，且同時涉及脂肪酸代謝及糖代謝［27］。已有研究發現，在 PPARs 家族中，PPARδ 在胰島 β 細胞中表達水平最高［6］。在不同的胰島細胞株中激活PPARδ 可提高線粒體氧化能力，增強胰島素促進糖刺激的胰島素分泌效應，使持續暴露于脂毒性下所致的胰島細胞糖刺激的胰島素分泌效應受損程度減少［6，28］。使用PPARδ選擇性激動劑后，脂肪甘油三脂酯酶敲除小鼠線粒體氧化過程包含的基因表達水平明顯上升，糖刺激的胰島素分泌效應恢復；但使用PPARα 選擇性激動劑后，并沒有發現以上結果［29］。可見，PPARδ 在胰島功能中發揮著重要作用。我們的研究發現T2DM 小鼠胰島及PA 誘導的NIT-1 細胞中PPARδ的表達下降，GLP-1受體激動劑Exe干預可以顯著上調胰島PPARδ 的表達；同時發現GLP-1 受體激動劑 Exe 及 PPARδ 激動劑 GW501516 明顯促進葡萄糖刺激胰島素的分泌增加，促進LC3B-II蛋白表達，抑制 P62 蛋白表達，而 Exe 聯合 PPARδ 拮抗劑GSK0660 可明顯降低 LC3B-II 蛋白表達，增加 P62 蛋白表達；敲除PPARδ基因后，NIT-1細胞中LC3B-II蛋白表達下降，P62 蛋白表達升高，說明自噬明顯受到抑制，而同時GLP-1 受體激動劑Exe 效應明顯減弱。以上結果表明 GLP-1 受體激動劑 Exe 通過 PPARδ 促進自噬作用，改善β細胞功能。

綜上所述，我們的研究初步證實GLP-1 受體激動劑Exe 可通過促進自噬改善高脂損傷的胰島β 細胞功能，并且這種作用由PPARδ 所介導。本研究在分子水平上補充了GLP-1 受體激動劑Exe 改善胰島β 細胞功能作用的機制，其深入機制仍需進一步研究。相信隨著更多有關GLP-1 受體激動劑Exe 研究的開展，我們對這類藥物改善胰島功能的作用機制也將會有更深入的了解。