circRNA_0000994通過翻譯蛋白抑制心肌細胞肥大相關基因表達*

郭繼深， 豐嘉欣， 溫藝紅， 陳澤潤， 李 藝， 朱杰寧，李 暉 ， 徐金東 ， 方咸宏 ， 單志新 ，△

［1南方醫科大學第二臨床醫學院，廣東 廣州 510280；2華南理工大學生物科學與工程學院，廣東 廣州 510006；3華南理工大學醫學院，廣東 廣州 510006；4廣東省人民醫院（廣東省醫學科學院）廣東省臨床藥理學重點實驗室，廣東 廣州 510080；5廣東省人民醫院（廣東省醫學科學院）檢驗科，廣東 廣州 510080；6廣東省人民醫院（廣東省醫學科學院）麻醉科，廣東 廣州 510080］

心臟肥大是心臟長期處于壓力負荷過重狀態，導致心肌細胞代償性肥大，表現為心肌細胞體積增大，收縮力增強，以維持正常的血液循環，同時使心臟具備一定的儲備力［1］。心臟肥大主要分為生理性肥大和病理性肥大，生理性肥大可長期維持心臟功能［2］，而病理性肥大是心力衰竭（heart failure，HF）的常見病理前改變［3］。多種信號通路參與調控心臟肥大的病理過程［4］，但其具體的機制尚不明確；研究并闡明新的心臟肥大調控機制，可能為臨床心臟肥大的預防及治療提供科學依據和干預靶點。

大多數環狀RNA（circular RNA，circRNA）是由宿主編碼基因的外顯子或內含子序列通過反向剪接（back-splicing）形成的，主要機制可能為長側翼反向重復元件（如Alu 元件）、RNA 結合蛋白或套索驅動環化等。circRNA 具有穩定的環形結構，相對于線性RNA，具有更高的RNA 穩定性［5］。circRNA 具有多種生物學功能，胞核內的circRNA 可直接參與轉錄調控、調節宿主基因的表達水平，胞質中的circRNA 可能通過海綿吸附微小RNA、與RNA 結合蛋白（RNA-binding protein，RBP）相互作用或編碼蛋白等途徑發揮生物學作用［6］。既往研究表明，環狀RNA 與多種心血管疾病密切相關，參與調節心血管疾病的發生發展過程［7］，但大多數circRNA 發揮生物學作用的機制多集中在通過海綿吸附微小RNA［8］或與RBP 相互作用2種途徑［9］，通過編碼蛋白對心臟肥大表型影響及機制的研究卻少有報道。

本課題組前期工作顯示，HF 患者心肌組織中circRNA_0000994 表達顯著上調，通過在線數據庫circBank 預測其可能包含了內部核糖體進入位點（internal ribosome entry site，IRES）及開放閱讀框（open reading frame，ORF），提示 circRNA_0000994可能具有編碼功能。circRNA_0000994 來源于溶質載體家族 8 成員 A1（solute carrier family 8 member A1，SLC8A1），該基因可編碼鈉鈣離子交換器1（Na+-Ca2+exchanger 1，NCX1；一種逆向膜轉運蛋白）。本文利用HF 患者心肌組織檢測circRNA_0000994 的表達特征，利用原代分離新生小鼠心室肌細胞（neonatal mouse ventricular cardiomyocytes，NMVCs），通過重組腺病毒rAd-circRNA_0000994 介導過表達該circRNA，探究circRNA_0000994 及其編碼蛋白對心肌細胞肥大相關基因表達的調控作用。

材料和方法

1 動物

新生（1～3 日齡）SPF 級C57BL/6 乳小鼠，雌雄不限，購自廣州中醫藥大學實驗動物中心，許可證號為SCXK（粵）2013-0034。

2 細胞株和主要試劑

本文所用細胞株購自ATCC 細胞庫；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、胰蛋白酶（0.25% trypsin-EDTA）、膠原酶 II 及 DMEM/F12 培養液購自 Gibco；血管緊張素 II（angiotensin II，Ang II）購自Sigma-Aldrich；iFluor? 647 標記鬼筆環肽購自 Yeasen；Lipofectamine RNAiMax 和 Trizol 試 劑 購 自 Invitrogen；RIPA 裂解液和考馬斯亮藍超快染色液購自Beyotime；4× SDS loading Buffer 購 自 TaKaRa；預 混 型qPCR 試劑盒（2× SYBR Green Premix）和逆轉錄試劑預混液（Evo M-MLV RT Premix）購自Accurate Biology；PVDF 膜和ECL 化學發光檢測試劑盒購自Millipore；蛋白酶和磷酸酶抑制劑微型片劑及BCA 蛋白定量試劑盒購自Thermo Fisher Scientific；siRNA 購自Ribobio；兔抗 β-肌球蛋白重鏈（β-myosin heavy chain，β-MHC）抗體、兔抗骨骼肌肌動蛋白α1（skeletal muscle actin alpha 1，ACTA1）抗體、兔抗NCX1 抗體和鼠抗GAPDH 抗體購自Protein Technology；兔抗心房鈉尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）抗體購自Bioworld；抗兔和抗小鼠Ⅱ抗購自invitrogen；其他生化試劑均為進口分裝或國產分析純。

3 主要方法

3.1 實驗組織 本文所利用的18 份健康器官捐獻者和28 份HF 患者心肌組織樣品均獲得患者知情同意，并經廣東省人民醫院倫理委員會批準（No.GDREC2016255H），手術樣品來源：廣東省心血管病研究所。

3.2 NMVCs的分離與培養 取10只1～3日齡的SPF級C57BL/6小鼠心臟置于預冷的PBS溶液中，修剪心臟周圍的血管組織，轉移至50 mL離心管，加入10 mL胰蛋白酶（0.1%trypsin-EDTA），4 ℃、70 r/min水平震蕩消化過夜。次日，加入終止消化后加入7 mL 無血清 F12 和 70 μL 膠原酶 II，37 ℃、70 r/min 水平震蕩消化10 min，用巴氏管吹打直至組織完全消化，立即用完全培養液終止消化，使用70 μm濾網過濾，300×g離心5 min，棄上清，用完全培養液重懸細胞沉淀，轉移至T75細胞培養瓶中，置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養1.5～2 h，進行差速貼壁，未貼壁的即為NMVCs，將分離的NMVCs 懸液均勻鋪于預先用鼠尾膠原I包裹的12孔板，待細胞穩定生長24 h，用PBS清洗細胞，更換完全培養液繼續培養24 h后處理。

3.3 RT-qPCR 檢測 利用Trizol 試劑提取人心肌組織或者 NMVCs 的總 RNA，取 1 μg 總 RNA 采用逆轉錄試劑預混液（Evo M-MLV RT Premix）逆轉錄得到cDNA，利用ViiA 7 Quantitative PCR System（Applied Biosystems）進 行 qPCR 檢 測 circRNA_0000994、SLC8A1 mRNA 及心臟肥大標志物mRNA 表達水平。以GAPDH 為胞質內參照，U6 為胞核內參照，利用2-ΔΔCt法比較目的基因的表達差異。本文所用qPCR引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列Table 1. The sequences of the primers for qPCR

3.4 Western blot 檢測 利用RIPA 裂解液（加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑）提取細胞樣品，采用BCA試劑盒測定樣品的蛋白濃度，取20 μg 蛋白樣品，加入4×SDS loading buffer 混勻，99 ℃變性 10 min 后進行SDS-PAGE，將凝膠中的蛋白電轉至PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，用Ⅰ抗［β-MHC 和ACTA1 抗體（1∶2 000），ANP和NCX1抗體（1∶1 000），GAPDH抗體（1∶5 000）］4 ℃過夜孵育。TBST 溶液漂洗 3 次，每次 10 min，用相同種屬的抗兔或抗小鼠Ⅱ抗（1∶5 000）室溫孵育 1 h，TBST 溶液漂洗 3 次，每次 10 min。使用LAS 500 超靈敏化學發光成像儀顯影，ImageJ 軟件進行圖像灰度分析，采用目的蛋白/內參的灰度值比值比較蛋白的表達水平，細胞內參照為GAPDH。

3.5 鬼筆環肽染色 將分離的NMVCs 懸液均勻鋪于預先用鼠尾膠原I包裹的共聚焦培養皿，經重組腺病毒感染或siRNA 轉染處理24 h 后，吸干培養液，用PBS 漂洗2 次；加入500 μL 4 %多聚甲醛固定液，室溫靜置20～30 min，棄去多聚甲醛固定液，PBS 漂洗2次，每次 10 min；加入 500 μL 0.5% TritonX-100 透化液，室溫靜置5 min，棄去透化液，PBS 漂洗2 次；加入500 μL 新鮮配制的鬼筆環肽工作液（1 mL 1% BSA溶液加入1 μL 1 000× iFluor? 647 標記鬼筆環肽），室溫避光染色 60～90 min，PBS 漂洗 2 次，每次 10 min，滴入5 滴DAPI 封片劑，置于4 ℃避光保存，使用SP5-FCS激光共聚焦顯微鏡拍攝圖片。

3.6 考馬斯亮藍染色 染色：蛋白樣品利用SDSPAGE分離后，去離子水潤洗1次，加入20 mL考馬斯亮藍超快染色液，于水平搖床40 r/min 室溫染色30 min；脫色：棄去染色液，加入適量去離子水，于水平搖床40 r/min 室溫脫色2 h，每隔30 min 更換新的去離子水，繼續在搖床上脫色。

4 統計學處理

應用GraphPad Prism 9.0 軟件進行統計分析。數據均采用均數±標準差（mean±SD）表示。兩組間均數比較采用t檢驗；多組間均數比較先進行正態分布和方差齊性檢驗，方差齊性檢驗后采用單因素方差分析，并用Bonferroni 校正的t檢驗進行組間兩兩比較。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 circRNA_0000994在HF心肌組織中表達增加

RT-qPCR 結 果 顯 示 ，circRNA_0000994 及SLC8A1 mRNA 在HF 心肌中表達上調（P＜0.05），見圖1A。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，circRNA_0000994 的反向引物能以人的cDNA 模板擴增出特異性條帶，而不能以人的基因組DNA（genomic DNA，gDNA）為模板擴增出條帶（圖1B）。circRNA_0000994 的序列來源于宿主基因SLC8A1第一個外顯子的全部序列，長度1 832 nt；Sanger 測序證實檢測到的circRNA_0000994 包含特征的接頭序列，見圖1C。放線菌素D實驗結果顯示，circRNA_0000994的相對表達水平顯著高于SLC8A1 mRNA（P＜0.01），見圖 1D。RNase R 實驗結果證實，circRNA_0000994 能夠耐受RNase R 消化，而線性SLC8A1 mRNA 很容易被RNase R 消化（P＜0.05），見圖1E。RNA 核質分離實驗結果顯示circRNA_0000994 在人AC16 心肌細胞的胞質中較豐富，見圖1F。

2 circRNA_0000994 抑制心肌細胞肥大相關基因的表達

利用定向克隆構建circRNA_0000994 的重組腺病毒rAd-circRNA_0000994 并用于感染NMVCs。rAd-circRNA_0000994感染NMVCs，熒光顯微鏡視野下可見大部分細胞表達綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP），提示rAd-circRNA_0000994 已充分感染NMVCs（圖2A）；RT-qPCR 結果進一步證實circRNA_0000994 在 NMVCs 中得到有效表達（P＜0.01），見 圖 2B。在 過 表 達 circRNA_0000994 的NMVCs 中，心臟肥大相關基因Myh7（編碼β-MHC 蛋白）、Acta1和Nppa（編碼ANP 蛋白）的mRNA 表達水平顯著降低（圖2C）。Western blot 結果顯示，rAdcircRNA_0000994 感染NMVCs 后，心臟肥大相關蛋白β-MHC、ACAT1 和ANP 表達水平也顯著下調（圖2D）。鬼筆環肽染色結果顯示，Ang II處理的NMVCs表面積明顯增大，而過表達circRNA_0000994 可有效抑制Ang II誘導的心肌細胞肥大反應（圖2E）。

3 circRNA_0000994可翻譯蛋白SLC8A1-605aa

根據在線數據庫circBank（http：//www.circbank.cn/index. html）的預測結果，circRNA_0000994 序列中包含一個跨越接頭序列的ORF 和一個IRES，提示circRNA_0000994 具有編碼蛋白的潛能。預測circRNA_0000994 的ORF 序列可編碼605 個氨基酸，因此命名為SLC8A1-605aa，該蛋白的C 端包含2 個特異的氨基酸RL（圖3A、B）。通過SDS-PAGE 分離過表達circRNA_0000994 的人AC16 細胞總蛋白，結合考馬斯亮藍染色，在65～75 kD 之間的可見一條差異條帶；切割該位置凝膠行MS shot-gun分析，可鑒定到與預測的SLC8A1-605aa 蛋白一致的肽段序列（圖3C），而且利用NCX1多抗通過Western blot 檢測可證實SLC8A1-605aa蛋白的表達（圖3D）。

4 circRNA_0000994 通過編碼蛋白SLC8A1-605aa發揮抑制NMVCs肥大的作用

為了驗證SLC8A1-605aa 蛋白的功能，我們構建了可表達SLC8A1-605aa 的重組腺病毒載體，命名為rAd-circRNA_00000994-ORF。 Western blot 結 果 顯示 ，利 用 rAd-circRNA_0000994 和 rAd-circRNA_00000994-ORF 分別感染NMVCs，心臟肥大相關蛋白β-MHC、ACAT1 和ANP 表達均顯著降低（P＜0.05），見圖4A。鬼筆環肽染色結果顯示，過表達circRNA_0000994 和 SLC8A1-605aa 可一致減弱 Ang II 誘導的NMVCs 肥大反應（P＜0.05），見圖4B。進一步的，在過表達circRNA_0000994 的NMVCs 中轉染SLC8A1-605aa siRNA，Western blot 結果顯示，SLC8A1-605aa siRNA 可 降 低 circRNA_0000994 翻 譯 SLC8A1-605aa水平，而敲減SLC8A1-605aa 表達能有效減弱circRNA_0000994 抑制NMVCs 中心臟肥大相關蛋白的表達（P＜0.05），見圖4C。

討 論

心臟肥大是心臟應對壓力或容量負荷時的一種代償性調節，以維持心臟原有的泵血功能。然而，長時間的病理性刺激引起的心臟肥大將最終導致HF。前期對HF 患者心肌的RNA 測序結果提示circRNA_0000994 表達增加。circRNA_0000994 是人心臟中表達豐度最高的 circRNA 之一［10］，它與編碼 NCX1 的SLC8A1基因序列同源［11］。有趣的是，我們發現在HF患者心肌組織中circRNA_0000994 表達水平顯著高于其宿主基因SLC8A1，提示該circRNA 可能參與心臟肥大病理過程的調節。

Figure 1. Up-regulation of circRNA_0000994 and its host gene in the myocardium of patients with heart failure（HF）. A：the expression of circRNA_0000994 and SLC8A1 mRNA in the human myocardium was detected by RT-qPCR（n=18 to 28）；B：PCR detection of circRNA_0000994 and SLC8A1 by divergent（??）and convergent（??）primers in human cDNA and genomic DNA；C：circRNA_0000994 sequence is derived from exon 1 of SLC8A1 gene，and the sequence of back splicing site in circRNA_0000994 was confirmed by Sanger sequencing；D：the levels of circRNA_0000994 and SLC8A1 mRNA were measured after treatment with 2 g/L actinomycin D at the indicated time points（n=3）；E：the levels of circRNA_0000994 and SLC8A1 mRNA in RNase R-treated total RNA（20 U/mg RNA）were detected by RT-qPCR（n=3）；F：circRNA_0000994 was abundant in the cytoplasm of human AC16 cardiomyocytes（n=3）. GADPH and U6 were used as positive controls in the cytoplasm and nucleus，respectively. Mean±SD.*P＜0.05，**P＜0.01 vs healthy donors；#P＜0.05，##P＜0.01 vs SLC8A1 mRNA；△△P＜0.01 vs mock group.圖1 環狀RNA circRNA_0000994及其宿主基因在心衰患者心肌組織中表達上調

Figure 2. Over-expression of circRNA_0000994 inhibited the expression of cardiac hypertrophy-related genes in NMVCs. A：the infection efficiency of rAd-circRNA_0000994 was monitored by the co-expressed marker green fluorescent protein（scale bar=100 μm）；B：the expression of circRNA_0000994 was determined by RT-qPCR；C：the mRNA expression of Myh7，Acta1 and Nppa in NMVCs was detected by RT-qPCR；D：the protein expression of β-MHC，ACTA1 and ANP in NMVCs was detected by Western blot assay；E：morphological changes of NMVCs observed by phalloidin-iFluor 647 staining（scale bar=50 μm）. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs vector group；##P＜0.01 vs vector+vehicle group；△△P＜0.01 vs vector+Ang II group.圖2 過表達circRNA_0000994抑制新生小鼠心室肌細胞中肥大相關基因的表達

circRNA 是由mRNA 反向剪接產生的共價閉合RNA，具有較高的穩定性［12］。人類基因組可編碼數以萬計的circRNAs，而其中絕大部分功能仍未知［13］。長期以來，人們認為circRNA 是通過海綿吸附微小RNA 或與 RBP 相互作用直接參與各種生物過程［14］。近年來，已有多項證據表明circRNA 可以通過編碼蛋白來調節腫瘤的進展［15］。由于編碼蛋白與宿主蛋白具有高度同源性，其可能作為“誘餌”減少宿主蛋白的降解［16］，從而增強宿主蛋白的功能或通過與宿主蛋白競爭性結合下游信號分子，從而抑制宿主蛋白的功能［14］；還可以直接與下游信號分子結合發揮生物學功能［15］。

Figure 3. Identification of circRNA_0000994-translated SLC8A1-605aa protein. A：the potential IRES and ORF sequences in circRNA_0000994；B：the predicted amino acid sequences of circRNA_0000994-translated SLC8A1-605aa protein；C：total protein from human AC16 cardiomyocytes with over-expression of circRNA_0000994 was separated by SDS-PAGE，and the differential protein bands between 65 to 75 kD were cut and used for mass spectrum shot-gun analysis；D：the expression of SLC8A1-605aa in AC16 cells with over-expression of circRNA_0000994 was detected by Western blot.圖3 circRNA_0000994編碼蛋白SLC8A1-605aa的鑒定

Figure 4. circRNA_0000994 inhibited cardiomyocyte hypertrophy by translating SLC8A1-605aa protein. A：the protein expression of β-MHC，ACTA1，ANP and SLC8A1-605aa in NMVCs with over-expression of circRNA_0000994 or SLC8A1-605aa；B：morphological changes of NMVCs observed by phalloidin-iFluor 647 staining（scale bar=50 μm）；C：the protein expression of β-MHC，ACTA1，ANP and SLC8A1-605aa in NMVCs was detected by Western blot. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs vector group；##P＜0.01 vs vector+vehicle group；△P＜0.05 vs vector+Ang II group；$$P＜0.01 vs vector+si-NC group；▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs vector+si-circRNA_0000994-ORF group.圖4 circRNA_0000994通過翻譯SLC8A1-605aa蛋白發揮抑制心肌細胞肥大的作用

目前，有翻譯功能的circRNA 在心肌重構調節方面的報道不多。有研究表明，circRNA-Nlgn 在心肌重構中表達上調，而且能通過翻譯蛋白Nlgn173與lamin B 結合入核，進一步激活血清及糖皮質激素誘導激酶 3（serum and glucocorticoid-inducible kinase-3，SGK3）和生長蛋白4 抑制因子（inhibitor of growth protein 4，ING4）啟動子參與心肌重構過程［17］。本課題組前期研究發現，circRNA_0036176可通過編碼蛋白Myo9a-208aa 發揮抑制心肌成纖維細胞增殖的作用，而 miR-218-5p 可通過與 circRNA_0036176 結合來抑制編碼蛋白Myo9a-208aa 的表達，從而減弱circRNA_0036176 對心肌成纖維細胞增殖的抑制作用［18］。本文通過預測 circRNA_0000994 具有的潛在ORF 及IRES 序列，利用特異性抗體及質譜shot-gun技術鑒定了編碼蛋白SLC8A1-605aa 的存在。功能實驗證實SLC8A1-605aa 與circRNA_0000994 同樣具有抑制心肌細胞肥大的作用；進一步的功能回復實驗發現，利用siRNA 靶向沉默circRNA_0000994 上SLC8A1-605aa 的ORF 序列，能有效減弱circRNA_0000994 抑制心肌細胞肥大的作用，提示circRNA_0000994 可能通過翻譯SLC8A1-605aa 蛋白發揮抑制心肌細胞肥大的作用。

綜上所述，本文證實circRNA_0000994 在HF 心肌中表達上調，且能夠編碼蛋白SLC8A1-605aa 來發揮抑制心肌細胞肥大的作用。而對于SLC8A1-605aa通過何種途徑發揮抑制心肌細胞肥大的作用，我們將繼續探究其相關信號通路和具體分子機制，為基于circRNA 為干預靶點的心臟肥大治療研究提供科學資料。