巖藻多糖對(duì)酒精依賴小鼠腸黏膜屏障功能及神經(jīng)行為學(xué)的作用*

張 楠 ， 薛美蘭▲， 高海琪， 黨 凱， 李捷銳 ， 梁 惠

（1青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266071；2青島大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，山東 青島 266071）

飲酒與健康是全世界人們廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題，長(zhǎng)期或過(guò)量的飲酒對(duì)身體是有害的，影響著全世界數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的人，并造成巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)。酒精中毒（alcoholism）包括酒精濫用和進(jìn)一步誘導(dǎo)的酒精依賴，是僅次于心血管疾病和惡性腫瘤居第三位的公共健康問(wèn)題，常表現(xiàn)出對(duì)酒精無(wú)法自控，對(duì)社會(huì)功能造成嚴(yán)重?fù)p害。中樞神經(jīng)系統(tǒng)作為酒精最敏感的靶點(diǎn)，受到酒精顯著抑制。酒精可以自由通過(guò)血腦屏障，影響神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能。越來(lái)越多的研究證明，酒精依賴患者常表現(xiàn)出抑郁和認(rèn)知障礙的癥狀［1-2］。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，過(guò)量飲酒會(huì)導(dǎo)致大腦氧化應(yīng)激，改變神經(jīng)免疫反應(yīng)，損害神經(jīng)再生，誘發(fā)神經(jīng)炎癥，導(dǎo)致認(rèn)知衰退、運(yùn)動(dòng)功能障礙［3-5］。另外，海馬區(qū)和大腦皮層容易受到酒精濫用影響，可能造成焦慮、抑郁、失眠和癲癇發(fā)作以及記憶和學(xué)習(xí)能力受損［6］。越來(lái)越多的研究顯示，過(guò)量飲酒會(huì)使腸道微生物菌群失調(diào)，腸道通透性增加進(jìn)而損傷腸黏膜屏障［7-8］。腸黏膜屏障是一個(gè)多層系統(tǒng)，長(zhǎng)期和反復(fù)的酒精刺激致使腸上皮細(xì)胞之間的claudin、ZO-1等緊密連接蛋白表達(dá)降低，進(jìn)而破壞腸黏膜屏障［9-10］。腸黏膜通透性增加時(shí)，細(xì)菌轉(zhuǎn)移到外部腸道部位，包括血液、脾臟和肝臟，這可能導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥［11］。血液中的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可以穿過(guò)血腦屏障進(jìn)入大腦，影響小膠質(zhì)細(xì)胞的激活與極化，進(jìn)而刺激產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，最終導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥［12］。

巖藻多糖是一種復(fù)雜的硫酸化碳水化合物，來(lái)源于棕色海藻和一些海洋無(wú)脊椎動(dòng)物的組織中。巖藻多糖富含褐藻多糖與硫酸基，并且由于其分支和單糖的不同而顯示出多種功能，已經(jīng)證實(shí)巖藻多糖具有廣泛的藥理作用，如抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗凝血等多種生物活性［13-14］。另外，巖藻多糖作為一種可口服的天然海藻活性物質(zhì)，其安全性已在動(dòng)物和臨床研究中得到證實(shí)［15-16］。據(jù)報(bào)道，巖藻多糖可有效抑制Aβ 誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞和原代皮層神經(jīng)元凋亡，并促進(jìn)神經(jīng)突起再生，證明巖藻多糖具有良好的神經(jīng)保護(hù)作用［17］。另外，研究證明巖藻多糖處理可以減少小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和氧化應(yīng)激，對(duì)海馬區(qū)神經(jīng)元發(fā)揮保護(hù)作用，進(jìn)而可作為一種預(yù)防短暫性腦缺血損傷的有益藥物［18］。有研究報(bào)道，巖藻多糖可能作為一種有益的膳食補(bǔ)充劑調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)，保護(hù)腸黏膜屏障功能，進(jìn)而減輕宿主的炎癥反應(yīng)［19］。前期研究結(jié)果顯示［20-21］，巖藻多糖可以通過(guò)改善腸道屏障功能對(duì)乳腺癌大鼠發(fā)揮保護(hù)作用；在酒精暴露小鼠模型中，巖藻多糖通過(guò)調(diào)控腸道微生態(tài)抑制酒精誘導(dǎo)的小鼠脂肪變性和膽汁酸代謝紊亂，進(jìn)而對(duì)酒精性肝損傷發(fā)揮保護(hù)作用。鑒于巖藻多糖的神經(jīng)保護(hù)作用以及與腸道屏障的密切關(guān)系，我們推測(cè)巖藻多糖能夠通過(guò)改善酒精依賴小鼠的腸黏膜屏障功能對(duì)小鼠的神經(jīng)行為學(xué)發(fā)揮保護(hù)作用。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)自由飲用15%乙醇溶液構(gòu)建酒精依賴小鼠模型，以巖藻多糖為干預(yù)物，旨在探究巖藻多糖對(duì)酒精依賴小鼠神經(jīng)行為學(xué)的保護(hù)作用及機(jī)制。

材料和方法

1 動(dòng)物

無(wú)特定病原體級(jí)C57BL/6J小鼠36只（雄性，8周齡），體質(zhì)量為20～25 g，由維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司（北京）提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXX（京）2016-0006。

2 主要試劑

巖藻多糖提取自墨角藻，95%純度，分子量220～260 kD，購(gòu)于Sigma。將巖藻多糖粉用生理鹽水稀釋成300 mg/kg懸液保存?zhèn)溆谩?/p>

血清5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）、神經(jīng)肽 Y（neuropeptide Y，NPY）、多巴胺（dopamine，DA）、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1 beta，IL-1β）、IL-18、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）、單核細(xì)胞趨化蛋白1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）、細(xì)菌內(nèi)毒素、二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）、D-乳酸（D-lactic acid，D-LA）和脂肪酸結(jié)合蛋白2（fatty acid binding protein 2，F(xiàn)ABP2）等ELISA 試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。β-actin 抗體購(gòu)自 Abcam；ZO-1 和 claudin 2抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology。56%酒精溶液由北京紅星股份有限公司提供。

3 主要方法

3.1 動(dòng)物分組及模型建立 適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，將36 只雄性C57BL/6J 小鼠隨機(jī)分為3 組（每組12 只）：對(duì)照組，模型組和巖藻多糖（300 mg/kg）干預(yù)組。課題組前期研究顯示，巖藻多糖使用劑量為200～400 mg/kg 時(shí)，小鼠均無(wú)不良反應(yīng)，因此本研究選取300 mg/kg作為實(shí)驗(yàn)劑量［21-22］。在模型組和巖藻多糖干預(yù)組中，通過(guò)自由飲用15%乙醇溶液的方式建立酒精依賴模型［23］。模型組和巖藻多糖組動(dòng)物于每周一至周五的上午8時(shí)至下午4時(shí)自由飲用新鮮自來(lái)水，然后自由飲用15%乙醇溶液至第2 天上午8 時(shí)。對(duì)照組的小鼠從周一到周五自由飲用自來(lái)水。在周六所有組的小鼠切斷一切水源進(jìn)行戒斷，周日全天自由飲用新鮮自來(lái)水。巖藻多糖干預(yù)組小鼠于每天中午12：00 灌胃給予巖藻多糖（300 mg/kg）溶液。同時(shí)，對(duì)照組和模型組小鼠每日灌胃等體積生理鹽水。實(shí)驗(yàn)持續(xù)10周。最后1周戒斷酒精1 d后，所有小鼠進(jìn)行蔗糖偏好實(shí)驗(yàn)（sucrose preference test，SPT）、懸尾實(shí)驗(yàn)（tail suspension test，TST）、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)（Forced swimming test，F(xiàn)ST）、Y 迷宮實(shí)驗(yàn)、高架十字迷宮（elevated plus maze，EPM）實(shí)驗(yàn)等行為學(xué)測(cè)試。

3.2 小鼠攝食量和體重檢測(cè) 在干預(yù)開(kāi)始前，稱量小鼠體重和攝食量作為第0 周（week 0）數(shù)據(jù)，干預(yù)后每周稱量1 次體重和攝食量，即week 1、week 2、week 3、week 4、week 5、week 6、week 7、week 8、week 9、week 10各稱量1次，共計(jì)11次。

3.3 蔗糖偏好實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物禁食禁水24 h 后，進(jìn)行蔗糖偏好實(shí)驗(yàn)。參考文獻(xiàn)［24］，測(cè)試期間普通飲用水和1%蔗糖溶液各500 mL稱重后給予小鼠（左右隨機(jī)放置），每隔1 h 對(duì)瓶子位置進(jìn)行互換，避免位置偏向。5 h后，重新稱量瓶子。糖水偏好度=（總蔗糖攝入量/總液體攝入量）×100%。

3.4 懸尾實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)［25］，用不粘膠將小鼠懸掛于距離臺(tái)面50 cm 的支架邊緣上，使其呈倒懸狀態(tài)，不粘膠黏貼在距小鼠尾尖1.5 cm 處，腹部對(duì)準(zhǔn)攝像頭。小鼠為了能夠克服不正常體位而進(jìn)行掙扎，但在活動(dòng)的一段時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)間斷性不動(dòng)，表現(xiàn)出失望心理狀態(tài)。攝像記錄6 min，適應(yīng)2 min，統(tǒng)計(jì)后4 min小鼠累計(jì)不動(dòng)時(shí)間（s）總和，即小鼠放棄掙扎，呈僵直狀態(tài)，或僅有細(xì)小的肢體運(yùn)動(dòng)。

3.5 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)［26］，將小鼠被放置在一個(gè)開(kāi)放的有機(jī)玻璃缸中（25 cm×10 cm）。缸內(nèi)水深10 cm，溫度（23±1）℃。每只小鼠游泳6 min，攝像頭記錄游泳的最后4 min。當(dāng)小鼠停止掙扎并漂浮在水中時(shí)視為靜止不動(dòng)，小鼠不動(dòng)時(shí)間的增加被認(rèn)為是其處于絕望狀態(tài)的一個(gè)指標(biāo)。在測(cè)試過(guò)程中，使用攝像機(jī)（Handycam，Sony）記錄每只小鼠的行為，并使用視頻跟蹤系統(tǒng)（SMART V3.0，Panlab Harvard instruments）計(jì)算不動(dòng)時(shí)間。測(cè)試結(jié)束后，用毛巾將小鼠擦干。

3.6 Y-迷宮實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)［27］，小鼠的空間記憶和工作記憶通過(guò)Y-迷宮實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，Y-迷宮由三個(gè)等間距的手臂（120°，50×32×16 cm）組成。其中一只手臂為起始臂，每只小鼠起初都被放在起始臂處，其余兩只手臂中一只被擋住了，稱為新奇臂，另一只手臂則為交替臂。首先小鼠探索起始臂和交替臂5 min，然后將小鼠拿出。2 min 后，將其重新放回起始臂，開(kāi)放新奇臂，自由探索3個(gè)手臂5 min。每次測(cè)試后，用75%酒精溶液擦拭各手臂，去除先前測(cè)試小鼠留下的氣味線索。用攝像機(jī)和視頻跟蹤系統(tǒng)自動(dòng)收集小鼠的行為數(shù)據(jù)。記錄最后5 min 內(nèi)小鼠的以下各項(xiàng)指標(biāo)：①總進(jìn)臂次數(shù)（total number of entries）：動(dòng)物進(jìn)入迷宮臂的次數(shù)（以小鼠四肢均進(jìn)入臂為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)臂一次）；②輪流（交替）一次（an alternation）：依次連續(xù)進(jìn)入Y 迷宮全部三個(gè)臂一次，稱為有效進(jìn)臂；③大輪流次數(shù)（number of maximum alternations）：總進(jìn)臂次數(shù)-2。計(jì)算每只小鼠的有效進(jìn)臂率，有效進(jìn)臂率=總輪流次數(shù)/大輪流次數(shù)×100%。

3.7 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn) 高架十字迷宮是一個(gè)十字形狀的裝置，高出地面50 cm，為避免反光，裝置表面為啞光白色。裝置由四個(gè)相對(duì)的臂組成，其中兩個(gè)相對(duì)的臂向周圍開(kāi)放稱為開(kāi)放臂（50×10×0.5 cm），另外兩個(gè)相對(duì)的臂閉合稱為閉合臂（50×10×30 cm）。四個(gè)手臂相互連接，在中心形成一個(gè)開(kāi)放區(qū)域（10×10 cm）。參考文獻(xiàn)［28］，小鼠被放置在中心，面對(duì)一處開(kāi)放臂，每只小鼠在迷宮中測(cè)試5 min。每次測(cè)試后，用75%酒精溶液擦拭整個(gè)迷宮裝置，去除先前測(cè)試小鼠留下的氣味線索。用攝像機(jī)和視頻跟蹤系統(tǒng)自動(dòng)收集小鼠的行為數(shù)據(jù)。記錄以下各項(xiàng)指標(biāo)：進(jìn)入開(kāi)放臂時(shí)間；進(jìn)入開(kāi)放臂次數(shù)，即以小鼠四肢均進(jìn)入到臂內(nèi)為準(zhǔn)，中途一個(gè)爪子從該臂中完全退出則視為該次進(jìn)入活動(dòng)完成。

3.8 實(shí)驗(yàn)樣本指標(biāo)檢測(cè) 行為學(xué)測(cè)試后，小鼠禁食不禁水12 h。通過(guò)眼球取血分離得到上清，放于-80 ℃下保存，以備后續(xù)指標(biāo)檢測(cè)。隨后小鼠被迅速斬首分離大腦和回腸組織。

3.8.1 免疫熒光染色 大腦組織用10%多聚甲醛固定過(guò)夜，石蠟包埋。將組織切片，用5%正常山羊血清在PBS 中封閉30 min。所有切片分別用CD68（1∶200）和GFAP（1∶200）抗體在4 ℃下孵育過(guò)夜。PBS沖洗3次，使用與Ⅰ抗對(duì)應(yīng)種屬的熒光Ⅱ抗室溫下避光孵育1 h，滴加含有DAPI 的抗熒光衰減封片劑封片，最后在熒光顯微鏡下觀察。

3.8.2 ELISA 大腦組織 5-HT、BDNF、NPY 和 DA水平檢測(cè)采用ELISA 試劑盒。腦組織在冰上用0.02 mol/L 冰磷酸鹽緩沖液（pH 7.0-7.42）進(jìn)行勻漿。1 010×g離心15 min后，檢測(cè)上清液中上述神經(jīng)遞質(zhì)以及神經(jīng)性營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)水平。腦組織IL-1β、IL-18、TNF-α 和 MCP-1 等炎性因子水平；血清內(nèi)毒素、DAO、D-LA 和FABP2 等腸黏膜屏障指標(biāo)同樣均采用ELISA 試劑盒檢測(cè)。操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

3.8.3 Western blot 使用組織蛋白提取試劑盒（Beyotime）從回腸組織中提取總蛋白，并使用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒（Beyotime）進(jìn)行定量。將等量的蛋白樣品（20 μg）通過(guò)8%～10% SDS-PAGE 分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉 1 h 后，用 TBST 溶液洗膜 3 次每次 10 min，隨后分別加入不同I 抗在4 ℃孵育過(guò)夜。上述方法洗膜后，加入與Ⅰ抗對(duì)應(yīng)種屬的Ⅱ抗（稀釋，1∶800）室溫孵育1 h。

3.8.4 回腸超微結(jié)構(gòu)觀察 參考前期發(fā)表文獻(xiàn)［29］，提取回腸組織放入3%戊二醛固定液中固定，4 ℃冷藏過(guò)夜。磷酸緩沖液漂洗后，1%鋨酸溶液于3 ℃再固定1 h，進(jìn)行第2 次漂洗。采用不同濃度丙酮進(jìn)行梯度脫水。環(huán)氧樹(shù)脂包埋劑固化后，將樣本取出，使用切片機(jī)將其切成60 nm 的切片。醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛進(jìn)行組織染色。使用透射電鏡對(duì)小鼠回腸組織超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察拍攝。

3.8.5 小腸滲透性示蹤分析（intestinal permeability analysis，IPA） 同樣參考文獻(xiàn)［29］，取回腸組織2 cm，將一端結(jié)扎，采用小鼠灌胃針從另一端緩慢注入2 g/L 熒光生物素（EZ-link Sulfo-NHS-Biotin）后結(jié)扎。室溫孵育5 min 后，用多聚甲醛固定4 h。將樣品用石蠟包埋并切成60 nm切片后，加入鏈霉親和素避光孵育30 min。熒光顯微鏡觀察熒光生物素在腸道中的分布情況。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad Prism 5.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差（one-way ANOVA）分析，t檢驗(yàn)分析兩組間的差異，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 巖藻多糖對(duì)酒精暴露小鼠的攝食量及體重的影響

各組小鼠均自由飲食，每周測(cè)定1 次攝食量和體重。干預(yù)開(kāi)始前，所有組小鼠的攝食量和體重均沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）。干預(yù)10 周后，酒精依賴模型組小鼠的攝食量和體重下降，均顯著低于正常對(duì)照組（P＜0.05）。巖藻多糖干預(yù)治療組小鼠攝食量增多，明顯高于酒精依賴模型組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 小鼠體重及攝食量檢測(cè)情況Table 1. Detection of body weight and food intake in mice（g. Mean±SD. n=12）

2 巖藻多糖對(duì)酒精暴露小鼠的行為學(xué)影響

通過(guò) SPT、TST、FST、EPM 實(shí)驗(yàn)和 Y 迷宮實(shí)驗(yàn)確定巖藻多糖是否能緩解酒精暴露小鼠的認(rèn)知行為障礙和抑郁樣行為。SPT 結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，酒精依賴模型組小鼠對(duì)蔗糖溶液的偏好顯著降低（P＜0.01），巖藻多糖干預(yù)可緩解這一下降趨勢(shì)（P＜0.05）。TST 結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，酒精依賴模型小鼠的不動(dòng)時(shí)間顯著增加（P＜0.01），巖藻多糖干預(yù)后小鼠的不動(dòng)時(shí)間顯著降低了40.1%（P＜0.05）。FST結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，酒精依賴模型組小鼠靜止不動(dòng)時(shí)間顯著延長(zhǎng)（P＜0.05）。但與模型組相比，巖藻多糖治療組小鼠的不動(dòng)時(shí)間減少，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Y 迷宮實(shí)驗(yàn)顯示，與正常對(duì)照組相比，酒精依賴模型組小鼠有效進(jìn)臂率顯著下降49.79%（P＜0.05），巖藻多糖干預(yù)后使小鼠有效進(jìn)臂率有一定提高。此外，EPM 結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，長(zhǎng)期酒精暴露導(dǎo)致小鼠進(jìn)入開(kāi)放臂停留的時(shí)間和次數(shù)分別下降了52.97%和50%（P＜0.05），巖藻多糖干預(yù)后小鼠停留時(shí)間顯著延長(zhǎng)了87.09%（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

3 巖藻多糖對(duì)腦組織神經(jīng)遞質(zhì)以及神經(jīng)性營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)水平的影響

酒精依賴模型組小鼠腦組織中NPY、DA、BDNF和5-HT 水平均低于正常對(duì)照組（P＜0.05）；通過(guò)添加巖藻多糖干預(yù)能夠改善這一情況，其中BDNF 和5-HT 水平較模型組顯著升高48.49%和45.73%（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

4 巖藻多糖對(duì)腦組織炎性細(xì)胞因子水平的影響

酒精暴露可引起小鼠腦組織中炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-18 和 MCP-1 水平均高于正常對(duì)照組（P＜0.05）；經(jīng)巖藻多糖干預(yù)后，TNF-α、IL-1β 和MCP-1 水平分別較模型組降低45.05%、42.36%和41.07%（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

5 巖藻多糖對(duì)大腦小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響

免疫熒光結(jié)果顯示對(duì)照組CD68 染色較弱說(shuō)明小膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物CD68蛋白表達(dá)水平較低，而酒精依賴模型組CD68 染色較強(qiáng)說(shuō)明小膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物CD68 蛋白表達(dá)水平較高；與模型組相比，巖藻多糖干預(yù)組CD68 染色減弱說(shuō)明小膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物CD68蛋白表達(dá)水平降低。類似地，對(duì)照組GFAP染色較弱說(shuō)明星形膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物GFAP蛋白表達(dá)水平較低，而酒精依賴模型組GFAP染色較強(qiáng)說(shuō)明星形膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物GFAP 蛋白表達(dá)水平較高。與模型組相比，巖藻多糖干預(yù)組GFAP染色減弱說(shuō)明星形膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物GFAP 蛋白表達(dá)水平降低，見(jiàn)圖4。

6 巖藻多糖對(duì)血清內(nèi)毒素、DAO、FABP2 和D-LA水平的影響

酒精依賴模型組小鼠血清中內(nèi)毒素、DAO、FABP2和D-LA水平均高于正常對(duì)照組（P＜0.05）；巖藻多糖干預(yù)治療后，D-LA 和FABP2 水平較酒精依賴模型組顯著降低（P＜0.05）；此外，巖藻多糖能顯著降低酒精暴露小鼠血清中內(nèi)毒素水平（P＜0.05），見(jiàn)圖5。

7 巖藻多糖對(duì)酒精暴露小鼠腸黏膜屏障的影響

腸道示蹤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠腸道的綠色熒光生物素主要分布在腸細(xì)胞膜外側(cè)，并且生物素未滲透出腸黏膜，而酒精依賴模型組小鼠腸道的綠色熒光生物素滲透進(jìn)細(xì)胞縫隙；經(jīng)巖藻多糖干預(yù)后，小鼠腸道的綠色熒光生物素大部分聚集在腸細(xì)胞膜外側(cè)，僅有少量生物素滲漏。

透射電鏡觀察結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠的小腸結(jié)構(gòu)完整。酒精依賴模型組小鼠小腸微絨毛排列雜亂無(wú)章，細(xì)胞鏈接松弛，間隙增寬；經(jīng)巖藻多糖干預(yù)后，小鼠小腸微絨毛排列逐漸整齊，細(xì)胞連接縫隙減小。此外，酒精依賴模型組小鼠小腸絨毛長(zhǎng)度顯著低于正常對(duì)照組（P＜0.01）；巖藻多糖干預(yù)治療后，小腸絨毛長(zhǎng)度較酒精依賴模型組顯著增加（P＜0.05），見(jiàn)圖6。

8 巖藻多糖對(duì)酒精暴露小鼠小腸組織緊密連接蛋白表達(dá)的影響

Figure 1. Cognitive and behavioural performance of the mice. SPT（A），TST（B），F(xiàn)ST（C），Y-maze test（D）and EPM test（E）were performed to determine whether fucoidan could improve depression behaviors and cognitive function of mice induced by alcohol. Mean±SD. n=12.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05 vs model group.圖1 小鼠的認(rèn)知和行為表現(xiàn)

與對(duì)照組相比，酒精依賴模型組和巖藻多糖干預(yù)組小鼠的ZO-1 和claudin 2 蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01）。與模型組相比，巖藻多糖干預(yù)組小鼠的ZO-1 和claudin 2 蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。此外，對(duì)照組小鼠回腸組織中ZO-1 和claudin 2 蛋白免疫熒光染色較強(qiáng)說(shuō)明蛋白表達(dá)水平高，而酒精依賴模型組和巖藻多糖干預(yù)組小鼠回腸組織ZO-1 和claudin 2 蛋白染色均較弱說(shuō)明蛋白表達(dá)水平低；與模型組相比，巖藻多糖干預(yù)后小鼠回腸組織ZO-1 和claudin 2 蛋白染色增強(qiáng)說(shuō)明蛋白表達(dá)水平升高。見(jiàn)圖7。

討 論

Figure 2. Expression levels of neurotransmitters and neurotrophic factors in the brain of mice. The levels of NPY（A），BDNF（B），5-HT（C）and DA（D）were detected by ELISA kits. Mean±SD. n=12.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group.圖2 小鼠腦組織神經(jīng)遞質(zhì)以及神經(jīng)性營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)水平

Figure 3. Expression level of inflammatory factors. The levels of IL-1β（A），IL-18（B），TNF-α（C）and MCP-1（D）were detected by ELISA kits. Mean±SD. n=12.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group.圖3 小鼠腦組織炎性因子的表達(dá)水平

酒精是最常被濫用的藥物之一，每年都有數(shù)百萬(wàn)人死于酒精使用障礙，給家庭和社會(huì)帶來(lái)巨大危害。持續(xù)過(guò)量飲酒可誘導(dǎo)酒精依賴，而酒精戒斷綜合癥通常在反復(fù)飲酒后發(fā)生，在情緒上主要表現(xiàn)為抑郁和焦慮［30］。有文獻(xiàn)報(bào)道，在反復(fù)束縛應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁樣大鼠模型中，巖藻多糖可緩解大鼠的行為認(rèn)知障礙及抑郁樣行為［31］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過(guò)自由飲用15%乙醇溶液構(gòu)建的酒精依賴模型小鼠，其認(rèn)知行為障礙及抑郁樣行為明顯增加，這與以往的研究結(jié)果相一致［32-33］。巖藻多糖干預(yù)治療后，行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示較酒精依賴模型組有明顯改善，提示巖藻多糖可緩解酒精誘導(dǎo)的小鼠抑郁樣行為，改善小鼠的記憶和認(rèn)知功能。

Figure 4. Changes of activation levels of microglia（CD68）and astrocytes（GFAP）in hippocampus of mice（scale bar=20 μm）.圖4 小鼠海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化水平的變化

Figure 5. Changes of main biochemical indexes of intestinal mucosal barrier in mice. The serum levels of endotoxin（A），F(xiàn)ABP2（B），D-LA（C）and DAO（D）were detected using ELISA kits. Mean±SD. n=12.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05 vs model group.圖5 小鼠腸黏膜屏障主要生化指標(biāo)變化

酒精依賴與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生有密切關(guān)系，發(fā)病時(shí)常伴隨各種神經(jīng)因子發(fā)生一系列病理變化。NPY 是內(nèi)源性抗焦慮、抗癲癇活性物質(zhì)，可有效抑制酒精戒斷過(guò)程中的肌肉、精神癥狀［34］。5-HT 是調(diào)節(jié)精神和情緒的重要神經(jīng)遞質(zhì)，研究顯示5-HT 循環(huán)通路的功能與酒精依賴的形成關(guān)系密切［35］。酒精對(duì)BDNF 水平具有調(diào)節(jié)作用，而B(niǎo)DNF 水平與酒精對(duì)靶組織的短期和長(zhǎng)期影響有關(guān)，如情緒異常、認(rèn)知能力下降和神經(jīng)細(xì)胞死亡［36］。DA 是一種大腦中的神經(jīng)傳遞素，研究顯示DA 水平降低與抑郁癥發(fā)生有直接關(guān)系［36］。一項(xiàng)人群試驗(yàn)報(bào)道［37］，以酒精依賴患者與健康志愿者為試驗(yàn)樣本，酒精依賴患者血漿BDNF水平明顯高于健康志愿者。近期研究報(bào)道［38］，在脂多糖和慢性束縛應(yīng)激誘導(dǎo)的兩種抑郁樣小鼠模型中，巖藻多糖均可升高其血清中BDNF 水平減輕神經(jīng)炎癥進(jìn)而發(fā)揮抗抑郁作用。此外最新研究顯示［39］，巖藻多糖可在魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的帕金森病大鼠模型中升高其血清中DA 水平，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)巖藻多糖治療后NPY、5-HT、BDNF和DA 水平的降低程度有所減輕，這與行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果相一致，提示巖藻多糖可以改善酒精暴露小鼠的行為認(rèn)知能力。

星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞是介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)炎癥最重要的兩類膠質(zhì)細(xì)胞，負(fù)責(zé)維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境平衡和應(yīng)對(duì)病理?yè)p傷［40］。酒精暴露激活膠質(zhì)細(xì)胞［41］，膠質(zhì)細(xì)胞活化后釋放多種促炎細(xì)胞因子。有研究報(bào)道［42］，巖藻多糖可降低脂多糖誘導(dǎo)的 BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞中的 IL-1β、TNF-α 和 MCP-1 水平。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，巖藻多糖治療組小鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-18 和MCP-1 水平均有所下降，提示巖藻多糖可以發(fā)揮抗炎作用從而減輕膠質(zhì)細(xì)胞活化導(dǎo)致的神經(jīng)炎癥。CD68 是活化小膠質(zhì)細(xì)胞的理想標(biāo)記物，有研究報(bào)道，CD68 水平在選擇性神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的抑郁樣大鼠模型中有所上升［43］，而GFAP特異地表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)星形膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，可作為星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物［44］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，巖藻多糖干預(yù)處理可以減弱酒精暴露誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，抑制炎性細(xì)胞因子釋放進(jìn)而減輕神經(jīng)炎癥。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種病理反應(yīng)與腸道黏膜屏障之間也存在密切聯(lián)系［45］。正常生理狀態(tài)下，D-LA、FABP2和DAO血漿水平較低，腸黏膜屏障受損時(shí)，DLA、FABP2 和DAO 釋放入血，導(dǎo)致血漿中三者水平升高［46-47］。此外，腸黏膜屏障受損還會(huì)使腸道菌群失調(diào)導(dǎo)致血漿中LPS 水平升高，LPS 跨越血腦屏障，最終造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥［47］。緊密連接蛋白是腸黏膜屏障的核心部分，包括閉合蛋白、咬合蛋白和帶狀閉合蛋白3種跨膜蛋白。前期研究結(jié)果顯示［48］，在乳腺癌大鼠模型中，巖藻多糖可通過(guò)降低血漿中D-LA與DAO的水平以及促進(jìn)緊密連接蛋白的表達(dá)改善腸黏膜屏障功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，巖藻多糖干預(yù)治療后小鼠血清中D-LA、FABP2、DAO和內(nèi)毒素水平得到明顯降低，緊密連接蛋白表達(dá)明顯升高，提示巖藻多糖可有效減輕腸黏膜屏障損傷。近期研究報(bào)道［49］，在環(huán)磷酰胺損傷小鼠小腸黏膜模型中，巖藻多糖干預(yù)處理后小鼠小腸組織形態(tài)得到明顯改善，小腸絨毛長(zhǎng)度有不同程度的增長(zhǎng)。在本研究中，透射電鏡觀察和小腸滲透性示蹤實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示巖藻多糖能改善腸黏膜通透性以及組織形態(tài)，進(jìn)而減輕腸黏膜屏障損傷，與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。此外，最近一項(xiàng)人群試驗(yàn)報(bào)道［50］，以酒精依賴患者與健康志愿者為試驗(yàn)樣本，酒精依賴患者組與健康志愿者組相比，腸道緊密連接蛋白表達(dá)降低，腸道通透性增加，腸黏膜屏障受損。該人群試驗(yàn)與本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示酒精暴露造成腸黏膜屏障損傷，而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示巖藻多糖可減輕小鼠腸黏膜屏障損傷并進(jìn)一步推測(cè)對(duì)小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮保護(hù)作用。

Figure 6. Structural changes of intestinal mucosal barrier in mice. A：intestinal permeability analysis（IPA）. If the function of intestinal mucosal barrier is normal，green fluorescent biotin will not permeate the intestinal mucosa. On the contrary，when the intestinal mucosal barrier is damaged，green fluorescent biotin permeates into the cell gap（scale bar=50 μm）. B：transmission electron microscopic（TEM）observation：the structure of the small intestine of the control group was intact，while the small intestinal microvilli of the model group were arranged disorderly and the intercellular space was broadened（arrow indication）. Scale bar=500 nm. C：villus length. Mean±SD. n=12.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05 vs model group.圖6 小鼠腸黏膜屏障結(jié)構(gòu)變化

綜上所述，在本研究中，我們檢測(cè)了口服巖藻多糖對(duì)慢性酒精暴露和戒斷小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制。結(jié)果提示，口服巖藻多糖能有效緩解酒精依賴小鼠的認(rèn)知行為功能障礙及抑郁樣行為，其機(jī)制可能與巖藻多糖對(duì)小鼠腸黏膜屏障的保護(hù)作用有關(guān)。

Figure 7. Changes of tight junction protein expression in small intestine of mice. A：Western blot；B：immunofluorescence staining（scale bar=20 μm）. Mean±SD. n=12.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05 vs model group.圖7 小鼠小腸組織緊密連接蛋白表達(dá)水平變化