和厚樸酚通過調節自噬對帕金森病模型小鼠多巴胺能神經元的影響及機制*

張 申， 陳 坤， 趙丹鵬， 張紅霞， 徐國衛△

（1鄭州大學附屬鄭州中心醫院神經電生理科，河南 鄭州 450000；2鄭州大學附屬鄭州中心醫院神經內科，河南 鄭州 450000）

帕金森病是一種神經退行性疾病，多發于老年人群，其典型臨床癥狀包括肌肉僵直、靜止性震顫、運動遲緩和姿勢反射障礙等，其主要神經病理學特征為腦黑質多巴胺能神經元變性、丟失［1-2］。近年來，帕金森病發病率不斷上升，但目前的治療手段只能部分緩解疾病癥狀，缺乏足夠有效、成熟的藥物阻止或逆轉帕金森病情進展［3］。因此，尋找有效的藥物減少腦黑質多巴胺能神經元丟失，仍是帕金森病治療的重要挑戰。和厚樸酚是中藥厚樸中的主要生物活性成分之一，具有抗炎、抗菌、抗氧化等多重效用［4］。研究發現，和厚樸酚能減輕神經細胞損傷，具有發展為抗神經系統疾病藥物的潛力［5］。相關研究發現，退行性疾病的發生與自噬缺陷有關，誘導自噬能減少帕金森病小鼠黑質多巴胺能神經元的丟失、凋亡［6-7］。而和厚樸酚在肺癌中被發現能誘導肺癌A549 細胞自噬，但其對抗帕金森病模型小鼠神經損傷的機制是否涉及自噬尚不清楚［8-9］。AMP 活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）/沉默信息調節因子1（silent information regulator 1，SIRT1）通路是常見的自噬通路［10］?；诖耍狙芯繉⑻接懞秃駱惴诱{控自噬通路對帕金森病模型小鼠多巴胺能神經元的影響。

材料和方法

1 動物

雄性C57BL/6小鼠共80只，10周齡，購自河南省實驗動物中心，許可證號為SCXK（豫）2017-0001。飼養條件：室溫（24～26）℃，濕度45%～55%，自由飲食進水，晝夜12 h交替循環。

2 主要試劑與儀器

1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）購自Med-ChemExpress；和厚樸酚購自上海寶曼生物科技有限公司；氯喹購自TargetMol；TUNEL 試劑盒購自上海澤葉生物科技有限公司；beclin-1 免疫組化染色試劑盒購自上海雅吉生物科技有限公司；兔抗p-AMPK、兔抗AMPK、兔抗SIRT1、兔抗beclin-1、兔抗Bcl-2 相關X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、兔抗胱天蛋白酶3（caspase-3）、兔抗GAPDH 和山羊抗兔Ⅱ抗均購自Abcam；兔抗微管相關蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）購自北京博奧森生物科技有限公司。SA102型Rotarod疲勞轉棒儀購自江蘇賽昂斯生物科技有限公司；DM3000型熒光顯微鏡購自Leica；Ti-S型顯微鏡購自Nikon；GS-800型凝膠掃描成像系統購自Bio-Rad。

3 主要方法

3.1 帕金森病小鼠模型制備 采用MPTP注射法建立帕金森病小鼠模型。用生理鹽水將MPTP 稀釋為1 g/L，向小鼠腹腔注射30 mg/kg，每日1次，連續注射7 d，觀察到小鼠自發性活動減少，爬行、逃避反應減慢，靜息時全身明顯震顫，表明帕金森病小鼠模型構建成功。

3.2 實驗分組及實驗給藥 將本實驗模型構建成功的64 只小鼠分為模型組、低劑量和厚樸酚組、高劑量和厚樸酚組及自噬抑制組，每組16 只，另取同期連續腹腔注射7 d 等體積生理鹽水的16 只小鼠為對照組。低、高劑量和厚樸酚組小鼠分別灌胃20 和60 mg/kg 和厚樸酚（用乙醇溶解后，用生理鹽水分別配制成 2 和 6 g/L，分別灌胃 10 mL/kg）［9］，自噬抑制組小鼠灌胃60 mg/kg 和厚樸酚和20 mg/kg 氯喹（用生理鹽水分別配制成2 g/L，灌胃10 mL/kg），對照組及模型組小鼠均灌胃等體積生理鹽水（灌胃10 mL/kg），連續灌胃14 d，每日1次。

3.3 小鼠行為學功能測試 末次給藥后，采用轉棒實驗及爬桿實驗測試所有小鼠的行為學功能。轉棒實驗：小鼠置于疲勞轉棒儀的30 mm 轉棒上，設置轉速為30 r/min，記錄從轉棒開始旋轉到小鼠掉落的時間（跌落潛伏期），每只小鼠連測3 次，每次間隔1 min，取3 次結果的均值為最終結果，所有小鼠在正式測試之前適應性測試3 次。爬桿實驗：長50 cm、直徑1 cm 的木桿上端固定直徑25 cm 的軟木球，木桿上纏紗布防滑，將小鼠置于軟木球上，記錄小鼠爬至桿底所需時間（爬桿時間），所有小鼠在正式測試之前引導自桿頂爬下至桿底3次。

3.4 TUNEL 染色檢測黑質神經元凋亡 進行行為學功能測試后，每組取8 只小鼠用1%戊巴比妥鈉麻醉斷頭處死，分離腦部黑質，甲醛固定、乙醇脫水、透明后石蠟包埋、切片。黑質石蠟切片經烤片、脫蠟、水化等處理后，滴加不含DNase 的蛋白酶K，并在37 ℃下作用15 min，PBS 洗滌。于冰上制備TUNEL反應混合液，滴加在標本上50 μL，于暗濕盒中37 ℃反應1 h，PBS 洗滌，用含DAPI 的抗熒光淬滅封片液封片，在熒光顯微鏡下觀察，計算細胞凋亡率。

3.5 免疫組化染色檢測黑質中beclin-1表達 黑質石蠟切片經烤片、脫蠟、水化等常規操作脫蠟至水，用 0.2%Triton X-100 室溫孵育 10 min，用 3%H2O2溶液室溫下孵育10 min，浸入枸櫞酸鈉緩沖溶液中用微波爐加熱修復抗原，常溫冷卻，用5%脫脂奶粉室溫孵育0.5 h，加入I抗（兔抗beclin-1）4 ℃孵育過夜，加入II抗（羊抗兔IgG）室溫孵育0.5 h，滴加SABC 室溫反應20 min，DAB 顯色，蘇木精復染，中性樹膠封片，顯微鏡觀察，低倍鏡下選beclin-1 陽性細胞密集區，高倍鏡下選5 個視野進行陽性細胞計數，取均值。

3.6 Western blot 法檢測黑質中AMPK/SIRT1 自噬通路及凋亡相關蛋白表達 每組剩余8只小鼠用1%戊巴比妥鈉麻醉，斷頭處死，分離腦部黑質，于冰上加入含磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液，置于搖床上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min 離心30 min 分離上清，BCA 法測定總蛋白濃度。各個蛋白標本取40 μg，采用SDS-PAGE分離蛋白，結束后將目標蛋白轉印至PVDF 膜上，放在5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h，分別放入不同I 抗（兔抗AMPK、兔抗p-AMPK、兔抗 SIRT1、兔抗 LC3、兔抗 beclin-1、兔抗Bax、兔抗 caspase-3 和兔抗 GAPDH）孵育液（均 1∶1 200稀釋）中4℃孵育過夜，PBS洗膜，放入山羊抗兔Ⅱ抗孵育液（1∶2 000 稀釋）中室溫孵育1 h，PBS 洗膜，加ECL 發光液顯色，在凝膠成像系統中掃描圖像，用ImageJ軟件分析圖像中各條帶灰度。

4 統計學處理

本研究數據以均數±標準差（mean±SD）表示，使用GraphPad 軟件進行統計分析，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 各組小鼠行為學功能

與對照組相比，模型組小鼠的跌落潛伏期顯著縮短，爬桿時間顯著延長（P＜0.05）；與模型組相比，低、高劑量和厚樸酚組小鼠的跌落潛伏期顯著延長，爬桿時間顯著縮短（P＜0.05）；隨著和厚樸酚劑量的升高，小鼠的跌落潛伏期延長，爬桿時間縮短（P＜0.05）；與高劑量和厚樸酚組相比，自噬抑制組小鼠的跌落潛伏期顯著縮短，爬桿時間顯著延長（P＜0.05），見圖1。

2 各組小鼠黑質神經元凋亡情況

與對照組相比，模型組小鼠黑質神經元凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，低、高劑量和厚樸酚組小鼠黑質神經元凋亡率顯著降低（P＜0.05）；隨著和厚樸酚劑量的升高，小鼠黑質神經元凋亡率降低（P＜0.05）；與酚高劑量和厚樸酚組相比，自噬抑制組小鼠黑質神經元凋亡率顯著升高（P＜0.05），見圖2。

3 各組小鼠黑質中beclin-1表達差異

與對照組相比，模型組小鼠黑質中beclin-1 陽性細胞數顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，低、高劑量和厚樸酚組小鼠黑質中beclin-1 陽性細胞數顯著升高（P＜0.05）；隨著和厚樸酚劑量的升高，小鼠黑質中beclin-1陽性細胞數升高（P＜0.05）；與高劑量和厚樸酚組相比，自噬抑制組小鼠黑質中beclin-1陽性細胞數顯著降低（P＜0.05），見圖3。

4 各組小鼠黑質中AMPK/SIRT1 自噬通路相關蛋白表達情況

與對照組相比，模型組小鼠黑質中p-AMPK/AMPK、SIRT1、LC3-II/LC3-I和beclin-1蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，低、高劑量和厚樸酚組小鼠黑質中p-AMPK/AMPK、SIRT1、LC3-II/LC3-I 和beclin-1 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；隨著和厚樸酚劑量的升高，小鼠黑質中p-AMPK/AMPK、SIRT1、LC3-II/LC3-I和beclin-1蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與高劑量和厚樸酚組相比，自噬抑制組小鼠黑質中 p-AMPK/AMPK、SIRT1、LC3-II/LC3-I和 beclin-1 蛋白表達水平 顯 著 降 低（P＜0.05），見圖4。

Figure 1. Fall latency（A）and pole climbing time（B）of the mice in each group. Mean±SD. n=16.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs low-dose honokiol group；▲P＜0.05 vs high-dose honokiol group.圖1 各組小鼠跌落潛伏期和爬桿時間

5 各組小鼠黑質中凋亡相關蛋白表達情況

與對照組相比，模型組小鼠黑質中Bax 和caspase-3 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，低、高劑量和厚樸酚組小鼠黑質中Bax 和caspase-3 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）；隨著和厚樸酚劑量的升高，小鼠黑質中Bax 和caspase-3 蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與高劑量和厚樸酚組相比，自噬抑制組小鼠黑質中Bax 和caspase-3 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），見圖5。

討 論

Figure 3. The positive expression of beclin-1 in nigral neurons of the mice in each group. Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs low-dose honokiol group；▲P＜0.05 vs high-dose honokiol group.圖3 各組小鼠黑質中beclin-1陽性表達情況

帕金森病是全球僅次于阿爾茨海默病的神經退行性疾病，影響約1%的60 歲以上人群的健康［11］。帕金森病的發生可導致患者生活不能自理，嚴重降低生活質量，還會引起多種并發癥，然而目前無法根治［12］。因此，探索更有效的藥物改善帕金森病癥狀并明確其相關調控機制具有重要意義。腦黑質多巴胺能神經元丟失是帕金森病最主要的病理改變，目前研究通常通過使用神經毒素特異性損傷腦黑質多巴胺能神經元，模擬相應病理改變，構建帕金森病動物模型［13］。本研究使用可透過血腦屏障的神經毒素MPTP 構建帕金森病小鼠模型，可見小鼠的跌落潛伏期顯著縮短，爬桿時間顯著延長，表明小鼠姿勢調整及平衡協調能力減弱，在行為學上已出現運動遲緩及姿勢協調障礙，帕金森病造模成功。同時，MPTP誘導建模后，小鼠黑質神經元凋亡率及凋亡蛋白Bax和caspase-3 水平顯著升高，表明MPTP 已損傷小鼠的腦黑質，導致多巴胺能神經元丟失。

和厚樸酚是中藥厚樸中最主要的兩個活性成分之一，具有廣泛的藥理作用，如抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤及保護心腦血管等，對中樞神經系統的影響尤其顯著，已被發現具有抗抑郁、抗癲癇、抗焦慮、抗凝血、抗老年癡呆及抗帕金森病神經損傷等作用［14］。徐瑩等［9］發現，和厚樸酚能增加帕金森病小鼠的自主活動次數及腦內多巴胺含量，具有神經保護作用。Chen 等［15］發現，和厚樸酚能激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ，緩解偏側帕金森病小鼠的運動功能障礙。本研究顯示，使用和厚樸酚治療后，帕金森病小鼠的跌落潛伏期顯著延長，爬桿時間顯著縮短，同時小鼠黑質神經元凋亡率及Bax 和caspase-3 蛋白水平逐漸降低，且和厚樸酚劑量越高，效果越明顯，表明和厚樸酚可抑制帕金森病小鼠黑質神經元凋亡，減輕行為學障礙，但其降低黑質神經元凋亡的機制還需進一步研究。

自噬，又稱作Ⅱ型程序性細胞死亡，在細胞生長發育及細胞內環境穩定調節過程中起重要作用，目前普遍被認為是一種防御、應激調控機制，在細胞應激條件下，可將損傷細胞器、錯誤蛋白再利用，避免更多細胞損傷、凋亡［16］。大量研究發現，帕金森病等退行性疾病的發生伴隨自噬缺陷，自噬的減弱很可能是退行性疾病患者神經元不斷凋亡的重要因素［17-18］。本研究亦顯示，帕金森病小鼠黑質中自噬相關蛋白LC3-II/LC3-I 和beclin-1 水平顯著降低，黑質中beclin-1陽性細胞數亦顯著降低，表明帕金森病發生后，能發生自噬反應的黑質神經元減少，黑質中自噬反應減弱。

Figure 4. The protein levels of p-AMPK，AMPK，SIRT1，LC3-I，LC3-II and beclin-1 in nigral neurons of the mice in each group.Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs low-dose honokiol group；▲P＜0.05 vs high-dose honokiol group.圖4 各組小鼠黑質中p-AMPK、AMPK、SIRT1、LC3-I、LC3-II和beclin-1蛋白水平

Figure 5. Expression of Bax and caspase-3 proteins in nigral neurons of the mice in each group. Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs low-dose honokiol group；▲P＜0.05 vs high-dose honokiol group.圖5 各組小鼠黑質中Bax和caspase-3蛋白表達情況

AMPK/SIRT1是調控自噬的上游信號通路，自噬過程中，AMPK 發生磷酸化并激活SIRT1，導致下游beclin-1表達增加，LC3由LC3-I向LC3-II轉化［19］。本研究顯示，MPTP 誘導建模后，小鼠黑質中p-AMPK/AMPK、SIRT1 蛋白表達水平降低，表明帕金森病發生時，AMPK/SIRT1介導的自噬途徑受到抑制。有研究發現，和厚樸酚能激活SIRT1/FOXO1信號通路，抑制膿毒癥腦損傷小鼠腦組織細胞凋亡［20］。陳蘭等［21］研究顯示，和厚樸酚能激活Sirt3/AMPK 途徑，抑制肺微血管內皮凋亡。本研究使用和厚樸酚治療后，帕金森病小鼠黑質中p-AMPK/AMPK、SIRT1、LC3-II/LC3-I 和beclin-1 蛋白表達水平及beclin-1 陽性細胞數均顯著升高，表明和厚樸酚可激活AMPK/SIRT1介導的自噬途徑，恢復自噬反應，提高發生自噬反應的黑質神經元數量。使用和厚樸酚治療的同時使用氯喹抑制自噬反應，結果可見，小鼠的跌落潛伏期顯著縮短，爬桿時間顯著延長，黑質中beclin-1 陽性細胞數及 p-AMPK/AMPK、SIRT1、LC3-II/LC3-I 和 beclin-1 蛋白表達水平顯著降低，黑質神經元凋亡率及Bax 和caspase-3 蛋白表達水平顯著升高。這些結果表明，和厚樸酚抑制帕金森病小鼠黑質多巴胺能神經元凋亡的機制與激活AMPK/SIRT1 通路介導的自噬反應有關。

綜上所述，和厚樸酚能激活自噬反應，活化AMPK/SIRT1通路，抑制帕金森病小鼠黑質多巴胺能神經元凋亡，改善其行為學功能，可為臨床改善帕金森病癥狀提供參考資料。