蘋果多酚通過調控Keap1/Nrf2通路減輕脂多糖誘導的大鼠急性肺損傷*

湯建華， 詹旭莉， 馮 平， 張志華△

（1河北北方學院附屬第一醫院藥學部，河北 張家口 050051；2河北北方學院附屬第一醫院呼吸科，河北 張家口 050051）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是多種因素導致肺組織發生病理改變的臨床綜合征［1］。該疾病的臨床表現是急性發作、進行性低氧血癥和胸部X光片上的雙側肺浸潤［2］。盡管為尋找潛在的治療策略付出了相當大的努力，但保護性通氣策略、限制性液體管理和抗生素應用仍是ALI 患者唯一可用的治療選擇。然而，這些措施在降低ALI 患者的高死亡率方面效果有限［3］。因此，進一步探索ALI的潛在治療方法是必要且緊迫的。蘋果多酚（apple polyphenols，AP）是一種從未成熟蘋果中提取的化合物，其具有抗氧化和抗炎特性［4］。據報道，AP 能夠改善大鼠低氧性肺動脈高壓［5］。提示AP 對肺具有保護作用。而AP 對脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導大鼠ALI 的影響鮮有報道。Kelch 樣環氧氯丙烷相關蛋白 1（Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1，Keap1）/核轉錄因子 E2 相關因子 2（nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2）通路被認為是最關鍵的內源性抗氧化應激通路之一，是炎癥相關疾病的重要靶點［6］。相關研究表明，激活Keap1/Nrf2 通路可減輕LPS 誘導的小鼠 ALI［7］。而 AP 能否通過調控 Keap1/Nrf2 通路對LPS 誘導大鼠ALI 發揮作用尚不明確。因此，本研究主要探究AP 對LPS 誘導大鼠ALI 的影響以及其作用機制。

材料和方法

1 動物

72 只體質量為 140～160 g 的 6 周齡 SPF 級雄性SD 大鼠購自廣州銳格生物科技有限公司，生產許可證號為SCXK（粵）2021-0059。所有動物實驗得到本院動物倫理委員會的批準。

2 主要試劑

AP、Nrf2抑制劑ML385購自上海源葉生物公司；LPS 購自北京伊塔生物公司；地塞米松（dexamethasone，DEX）購自北京索萊寶科技公司；大鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒購自上海廣銳生物公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒購自上海遠慕生物公司；細胞核蛋白提取試劑盒購自上海聯碩生物公司；兔源1 抗Keap1、Nrf2、血紅素氧合酶1（heme oxygenase-1，HO-1）、GAPDH、histone、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔Ⅱ抗均購自Abcam。

3 主要方法

3.1 ALI 大鼠模型的構建 參照文獻［8］復制ALI 大鼠模型，簡言之，利用1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，將大鼠固定于手術臺上，剪開皮膚，暴露氣管，向氣管內緩慢注射5 mg/kg LPS以構建ALI模型。

3.2 動物分組及給藥處理 按照隨機數字表法將72只大鼠隨機分為對照（control）組、模型（model）組、低劑量AP（low-dose AP，AP-L）組、高劑量 AP（highdose AP，AP-H）組、DEX 組、AP-H+ML385 組，每組12只。AP-L組、AP-H 組［9-10］、DEX 組［11］大鼠分別腹腔注射25 mg/kg AP、100 mg/kg AP、5 mg/kg DEX，而APH+ML385組［12］大鼠需同時腹腔注射100 mg/kg AP 和30 mg/kg ML385，control 組、model組大鼠腹腔注射等量的生理鹽水，每天腹腔注射給藥1 次，持續給藥14天。末次給藥1 h 后，除control 組外，其它組大鼠均采用向氣管內注射5 mg/kg LPS 的方法構建ALI 模型，control 組大鼠的氣管內注射等體積的生理鹽水，造模24 h后，麻醉大鼠，收集每組大鼠肺泡灌洗液用于細胞總數、中性粒細胞數的檢測，收集每組全部大鼠血清用于TNF-α、IL-6 水平的檢測。肺泡灌洗液、血清收集完畢后，處死大鼠，收集大鼠肺組織，分為3部分（每部分包含每組4 只大鼠肺組織），一部分用于HE 染色，一部分用于肺組織濕重（wet weight，W）/干重（dry weight，D）比的檢測，剩余一部分用于氧化應激指標、RT-qPCR、western blot實驗檢測。

3.3 肺泡灌洗液中細胞總數、中性粒細胞數的檢測 向大鼠氣管內注射1 mL 預冷的PBS 灌洗肺泡，重復灌洗3 次，肺泡灌洗液的回收率達75%，將肺泡灌洗液在 4 ℃下以 250 ×g離心 10 min，收集細胞沉淀，將細胞沉淀用PBS 懸浮，利用細胞計數板計數總細胞數。將細胞沉淀涂片，進行瑞氏染色后對中性粒細胞進行計數。

3.4 ELISA法檢測大鼠血清中TNF-α和IL-6水平嚴格按照試劑盒說明書檢測大鼠血清中TNF-α 和IL-6水平。

3.5 HE 染色檢測各組大鼠肺組織病理損傷情況將各組大鼠的右側肺組織在4%多聚甲醛中固定過夜。經包埋、切成4 μm 厚的切片后進行HE 染色。在光學顯微鏡下觀察肺組織病理損傷，并進行病理評分，評分標準［13］：0 分為無病理損傷；1 分為≤25%的肺組織存在病理損傷；2分為＞25%且≤50%的肺組織存在病理損傷；3分為＞50%且≤75%的肺組織存在病理損傷；4分為＞75%的肺組織存在病理損傷。

3.6 大鼠肺組織W/D 的檢測 稱量各組大鼠新鮮右側肺組織質量記錄為濕重，稱量后將大鼠肺組織放入60 ℃烘箱中烘烤48 h 后再稱量質量記錄為干重，計算肺組織W/D比。

3.7 大鼠肺組織中SOD、GSH-Px 活性、MDA 含量、ROS 水平的檢測 干重嚴格按照試劑盒說明書檢測大鼠肺組織中 SOD、GSH-Px 活性、MDA 含量。DCFH-DA 熒光探針檢測大鼠肺組織中ROS 水平，記錄各組的熒光強度值，結果以相對于control 組熒光強度值表示。

3.8 RT-qPCR 檢測肺組織中Keap1 和Nrf2 mRNA的表達 使用TRIzol 試劑從肺組織勻漿中分離總RNA。將 RNA 逆轉錄為 cDNA 后，以 cDNA 為模板進行 RT-qPCR 反應。以 GAPDH 為內參照，通過 2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。GAPDH 的正向引物序列為5′-CATTCTTCCACCTTTGAT-3′，反向引物序列為 5′-CTGTAGCCATATTCATTGT-3′；Keap1 的正向引物序列為 5′-ATCGCTGCTGTCTCTGTA-3′，反向引物序列為 5′-GTTCTGCTGCCTCTTCTG-3′；Nrf2 的正向引物序列為5'-CCAACACACGGTCCACAGCT-3'，反向引物序列為5'-TCCGTCGCTGACTGAAGTCAA-3'。

3.9 Western blot 檢測肺組織中 Keap1、Nrf2 蛋白的表達 RIPA 裂解液提取肺組織勻漿總蛋白用于Keap1、GAPDH 蛋白的檢測；細胞核蛋白提取試劑盒提 取的肺組織勻漿中的核蛋白用于Nrf2、histone 蛋白的檢測。簡言之，將蛋白質經定量、電泳、轉膜、封閉后，將膜分別與Ⅰ抗 Keap1（1∶2 000）、GAPDH（1∶1 000）、Nrf2（1∶2 000）、Histone（1∶1 000）在 4 ℃下過 夜孵育，再在37 ℃下與Ⅱ抗（1∶1 000）共孵育2 h。加入ECL 試劑觀察蛋白條帶顯色情況，經Quantity-One軟件量化蛋白灰度值。

4 統計學處理

使用GraphPad Prism 8 進行統計分析，所有數據以平均值±標準差（mean±SD）表示。單因素方差分析用于比較多組之間的差異，進一步兩組間的比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 AP 對各組大鼠肺泡灌洗液中細胞總數和中性粒細胞數的影響

與contrl 組比較，model 組大鼠肺泡灌洗液中細胞總數和中性粒細胞數升高（P＜0.05）；與model 組比較，AP-L 組、AP-H 組和 DEX 組大鼠肺泡灌洗液中細胞總數和中性粒細胞數降低（P＜0.05）；與AP-L 組比較，AP-H 組和DEX 組大鼠肺泡灌洗液中細胞總數和中性粒細胞數降低（P＜0.05）；與AP-H組比較，APH+ML385組大鼠肺泡灌洗液中細胞總數和中性粒細胞數升高（P＜0.05），見表1。

表1 AP 對各組大鼠肺泡灌洗液中細胞總數和中性粒細胞數的影響Table 1. Effects of AP on the total number of cells and the number of neutrophils in the bronchoalveolar lavage fluid of rats in each group（×105 mL-1. Mean±SD. n=12）

2 AP對各組大鼠血清TNF-α和IL-6水平的影響

與 control 組比較，model 組大鼠血清中 TNF-α 和IL-6 水平升高（P＜0.05）；與model 組比較，AP-L 組、AP-H 組和 DEX 組大鼠血清中 TNF-α 和 IL-6 水平降低（P＜0.05）；與AP-L組比較，AP-H 組和DEX 組大鼠血清中TNF-α和IL-6水平降低（P＜0.05）；與AP-H 組比較，AP-H+ML385組大鼠血清中TNF-α和IL-6水平升高（P＜0.05），見表2。

表2 AP對各組大鼠血清中TNF-α和IL-6水平的影響Table 2. The effect of AP on the levels of TNF-α and IL-6 in serum of rats in each group（ng/L. Mean±SD. n=12）

3 AP對各組大鼠肺組織病理損傷的影響

HE 染色結果顯示，control 組大鼠肺組織結構正常，肺泡腔清晰可見，肺泡壁薄，未見炎性細胞浸潤；model組大鼠肺組織結構異常，肺泡腔出血、滲出，肺泡壁增厚，可見大量炎性細胞浸潤；與model組比較，AP-L 組、AP-H 組和DEX 組大鼠肺組織病理損傷減輕，病理評分降低（P＜0.05）；與AP-H 組比較，AP-H+ML385 組大鼠肺組織病理損傷嚴重，病理評分升高（P＜0.05），見圖1。

4 AP對各組大鼠肺組織W/D的影響

與 control 組比較，model 組大鼠肺 W/D 升高（P＜0.05）；與Model組比較，AP-L組、AP-H組和DEX組大鼠肺W/D 降低（P＜0.05）；與AP-L 組比較，AP-H 組和DEX 組大鼠肺W/D 降低（P＜0.05）；與AP-H 組比較，AP-H+ML385組大鼠肺W/D升高（P＜0.05），見圖2。

Figure 1. The effect of AP on the lung tissue pathological damage score of rats in each group（HE staining，scale bar=50 μm）. Black arrow：alveolar space；red arrow：alveolar wall. Mean±SD. n=4.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs AP-L group；▲P＜0.05 vs AP-H group.圖1 AP對各組大鼠肺組織病理損傷評分的影響

Figure 2. The effect of AP on the W/D ratio of rat lung tissues in each group. Mean±SD. n=4.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs AP-L group；▲P＜0.05 vs AP-H group.圖2 AP對各組大鼠肺組織W/D的影響

5 AP對各組大鼠肺組織中SOD、GSH-Px、MDA和ROS水平的影響

與control 組比較，model組大鼠肺組織中SOD 和GSH-Px 活性降低，MDA 含量和 ROS 水平升高（P＜0.05）；與model組比較，AP-L組、AP-H組和DEX組大鼠肺組織中SOD 和GSH-Px 活性升高，MDA 含量和ROS 水平降低（P＜0.05）；與AP-L 組比較，AP-H 組和DEX組大鼠肺組織中SOD和GSH-Px活性升高，MDA含量和ROS水平降低（P＜0.05）；與AP-H組比較，APH+ML385組大鼠肺組織中SOD和GSH-Px活性降低，MDA含量和ROS水平升高（P＜0.05），見圖3。

6 AP 對各組大鼠肺組織中Keap1/Nrf2 通路相關因子mRNA及蛋白表達的影響

與control 組比較，model 組大鼠肺組織Keap1 mRNA、Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA、Keap1、HO-1 蛋白及核 Nrf2 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05）；與model 組比較，AP-L 組、AP-H 組和 DEX 組大鼠肺組織 Keap1 mRNA、Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA、Keap1、HO-1 蛋白及核Nrf2 蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）；與 AP-L 組比較，AP-H 組和 DEX 組大鼠肺組織Keap1 mRNA、Nrf2 mRNA、Keap1、HO-1 蛋白及核Nrf2蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）；與AP-H 組比較，AP-H+ML385 組大鼠肺組織Keap1 mRNA、Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA、Keap1、HO-1 蛋白及核Nrf2蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05），見圖4。

討 論

Figure 3. Effects of AP on SOD activity，GSH-Px activity，MDA content and ROS level in lung tissues of rats in each group. Mean±SD. n=4.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs AP-L group；▲P＜0.05 vs AP-H group.圖3 AP對各組大鼠肺組織中SOD活性、GSH-Px活性、MDA含量和ROS水平的影響

Figure 4. Comparison of Keap1，HO-1 and Nrf2 mRNA and protein expression levels in lung tissues of rats in each group. A：comparison of Keap1，Nrf2 and HO-1 mRNA expression in lung tissues of rats in each group；B：Western blot was used to detect Keap1，Nrf2 and HO-1 protein expression in rat lung tissues. Mean±SD. n=4.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs AP-L group；▲P＜0.05 vs AP-H group.圖4 各組大鼠肺組織中Keap1、Nrf2和HO-1 mRNA及蛋白表達的比較

ALI是人類日益關注的問題，并且經常導致具有高發病率和死亡率的急性呼吸窘迫綜合征［14］。真菌、病毒和細菌感染是ALI 的主要原因。具體來說，革蘭氏陰性菌，如銅綠假單胞菌，會分泌各種內毒素，包括LPS。暴露于LPS會加速中性粒細胞募集和促炎分子的表達，最終加劇ALI的進展［15］。LPS 長期以來被廣泛用于誘導ALI 大鼠肺部炎癥［16］。本研究通過向氣管內注射LPS以構建ALI大鼠模型，結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠肺組織病理損傷嚴重，提示造模成功。中性粒細胞在ALI 的發病機制中起重要作用，去除中性粒細胞可以減少ALI 的損害［17］；肺水腫是ALI 發病機制的中心環節，肺組織的W/D 比可用來評估肺水腫的程度［18］；促炎細胞因子IL-6、TNF- α 在 ALI 的發生發展中起重要調控作用［19］；此外，氧化應激是 LPS 引起 ALI 的主要特征之一，在該過程中肺組織SOD、GSH-Px 活性降低，MDA含量升高［20］；LPS 可通過增加 ROS 的生成引起氧化應激，ROS 的過多積累可引起肺水腫以及大量的炎性細胞浸潤，進而導致ALI［8］。本研究顯示，與對照組比較，模型組細胞總數、中性粒細胞數、W/D比、IL-6、TNF-α、MDA、ROS含量升高，SOD、GSH-Px活性降低，提示氧化應激及炎癥反應參與了模型大鼠ALI過程，進而造成肺組織病理損傷嚴重。

AP是蘋果中多元酚類化合物的總稱，具有抗炎、抗氧化的特性。如AP對LPS誘發的小鼠單核/巨噬細胞 RAW264.7 細胞炎癥具有抑制作用［21］；AP 可以提高高脂血癥小鼠的抗氧化能力［22］。而關于AP對LPS誘導的大鼠ALI 的影響鮮有報道。本研究顯示，低、高劑量AP可抑制ALI大鼠肺組織炎癥反應及氧化應激，減輕肺組織病理損傷，且AP 劑量越高，對應的趨勢越明顯；而AP-H 組與DEX 組比較，對應指標變化差異無統計學意義，提示AP 可能通過抑制炎癥反應及氧化應激對LPS誘導的大鼠ALI發揮保護作用。

Keap1/Nrf2信號通路是重要的抗氧化通路，在正常生理狀態下，Nrf2 和Keap1 位于細胞質中。然而，當氧化應激被激活時，蛋白激酶將被激活以誘導Nrf2與Keap1解離并轉移到細胞核中，入核的Nrf2與抗氧化反應元件（如HO-1）結合，啟動抗氧化蛋白的轉錄，進而發揮抗氧化作用［23］。據報道，百合固金湯通過激活Keap1/Nrf2信號通路對LPS誘導的小鼠ALI發揮保護作用［24］。提示Keap1/Nrf2信號通路的激活可對LPS誘導的ALI 發揮保護作用。本研究結果與其是一致的，本研究顯示，模型組大鼠肺組織中Keap1 mRNA、Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA、Keap1、HO-1蛋白及核Nrf2蛋白表達降低，AP-L組、AP-H組大鼠肺組織中上述指標表達升高，且AP 劑量越高，對應的升高趨勢越明顯，Model組Keap1表達下調，鑒于Keap1對Nrf2的錨定作用，此時Nrf2應呈現胞質定位減少而入核增多，因此核Nrf2 蛋白量應增加，但本研究Model 組中核Nrf2 含量反而降低，這可能是由于ALI 過程中，機體出現自噬功能障礙，使得p62與Nrf2間的反饋回路無法被破壞，使得Nrf2在胞漿呈持續激活或延長激活狀態導致的［25］。基于上述結果推測AP 可能通過激活Keap1/Nrf2信號通路對LPS誘導的大鼠ALI發揮保護作用。為了驗證該猜想，本研究在高劑量AP 處理的基礎上再加上Nrf2抑制劑ML385干預ALI大鼠，結果顯示，ML385減弱了高劑量AP對LPS誘導的大鼠ALI的保護作用，證實了猜想是正確的。

綜上所述，AP 可能通過激活Keap1/Nrf2 信號通路對LPS 誘導的大鼠ALI發揮保護作用。AP 可能具有臨床治療LPS誘導的ALI的潛力。