circKEAP1通過影響miR-661/LIF軸促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖和遷移*

黃曉文， 張能華△， 陳興英， 袁 梅， 費(fèi)春霞， 徐屹寧

（1浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬嘉興中醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江 嘉興 314001；2浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院骨科，浙江 杭州 310020）

骨肉瘤是來源于間葉組織最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，好發(fā)于青少年及兒童，主要表現(xiàn)為骨骼或關(guān)節(jié)處的腫脹感與疼痛，活動(dòng)后加劇，部分可觸及腫塊［1］。骨肉瘤的發(fā)病率約為3/100 萬，占全世界相關(guān)年齡段腫瘤的2.4%［2］。過去幾十年來，隨著新輔助放化療結(jié)合手術(shù)的應(yīng)用，骨肉瘤的治療方式有了顯著的進(jìn)步。盡管如此，骨肉瘤的患者預(yù)后僅有微小的提升。而伴有化療耐藥與腫瘤組織轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者，其五年生存率僅為15%～30%［3］。骨肉瘤治療目前尚無特異性的有效靶點(diǎn)。在體外水平尋找抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖與遷移的靶點(diǎn)，是后續(xù)開發(fā)新型有效的臨床治療藥物首要與關(guān)鍵步驟。

與傳統(tǒng)的線性RNA 不同，環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一種呈現(xiàn)環(huán)狀閉合結(jié)構(gòu)的非編碼RNA，不具備5'末端帽子和3'末端多聚腺苷酸尾巴，且有更高的穩(wěn)定性，表現(xiàn)為對(duì)RNA 酶更高的耐受［4］。circRNA 廣泛存在于機(jī)體各個(gè)組織器官中，在特定條件下具有一定的功能，與其他RNA 或蛋白共同維持生物體內(nèi)微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。circRNA 可與特定的蛋白相互作用，從而影響靶蛋白功能［5］。少部分circRNA被證明具有翻譯功能，能夠翻譯蛋白或肽段行使其生物學(xué)功能［6-7］。此外，circRNA 存在廣泛的微小RNA（microRNA，miRNA，miR）的結(jié)合位點(diǎn)，能夠海綿吸附 miRNA 并調(diào)節(jié)其下游靶基因［8］。miRNA 是一類不具備編碼功能的短核苷酸單鏈RNA 分子，參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控，在腫瘤發(fā)生和心血管疾病等生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用［9］。其中，miR-661 被證明可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞色素C 增強(qiáng)星形孢菌素或腫瘤壞死因子α介導(dǎo)的骨肉瘤細(xì)胞凋亡［10］。

此前有研究報(bào)道，circRNA circKEAP1 在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單核細(xì)胞中的表達(dá)量顯著下調(diào)［11］。此外，還有學(xué)者報(bào)道 circKEAP1 對(duì)預(yù)測(cè)肺腺癌患者的生存率具有重要意義［12］。基因表達(dá)集合數(shù)據(jù)庫（GSE140256）分析結(jié)果顯示，circKEAP1 有較高的豐度，且在多個(gè)骨肉瘤細(xì)胞系中顯著高表達(dá)。由此推斷，我們探討了circKEAP1 通過海綿吸附miR-661，進(jìn)而調(diào)控其靶基因白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）影響骨肉瘤增殖與遷移的分子機(jī)制，并為探索基于circKEAP1-miR-661-LIF 軸的骨肉瘤新型治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

材料和方法

1 材料

凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BD；24孔Transwell板及小室購(gòu)自Corning；CCK-8 和雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；小干擾RNA、miR-661 模擬物與miR-661 抑制劑購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；LIF過表達(dá)質(zhì)粒購(gòu)自漢恒生物科技（上海）有限公司；Lipofectamine 3000、胎牛血清、DMEM 高糖培養(yǎng)液、Opti-MEM 培養(yǎng)液、胰蛋白酶溶液和 PBS 購(gòu)自 Thermo Fisher Scientific；總 RNA 提取試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技股份有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑購(gòu)自艾科瑞生物；熒光定量PCR SYBR Green熒光染料購(gòu)自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；熱穩(wěn)定性的DNA 聚合酶（Taq 酶）購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；放線菌素D 購(gòu)自Selleck；引物購(gòu)自北京擎科生物科技有限公司；

2 細(xì)胞

293T、143B、HOS、U2OS、SJSA-1、MG63 和hFOB1.19 細(xì)胞系均購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫（American Type Culture Collection，ATCC），培養(yǎng)條件均為含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)液，培養(yǎng)環(huán)境為5%CO2、37 ℃恒溫恒濕細(xì)胞培養(yǎng)箱。

3 主要方法

3.1 PCR 與RT-qPCR 根據(jù)總RNA 提取試劑盒說明書提取處理后的U2OS、HOS、MG63、143B、SJSA-1與hFOB1.19 細(xì)胞的總RNA。隨后使用艾科瑞生物的逆轉(zhuǎn)錄試劑將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA。PCR為 10 μL 體系，其中 2× Taq 酶取 5 μL，互補(bǔ) DNA 取0.5 μL，正、反向引物各取 0.25 μL，去離子水取 4 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)。將上述PCR 產(chǎn)物加入1%瓊脂糖膠，120 V 恒壓電泳30 min后顯影。對(duì)于RT-qPCR，將β-actin 作為內(nèi)參照。反應(yīng)體系為 10 μL，其中 2× SYBR Green 預(yù)混液取 5 μL，正、反向引物各取0.25 μL，互補(bǔ)DNA 按照1∶10用去離子水稀釋后取4.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火/延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。采用 2-ΔΔCt方法計(jì)算 circKEAP1 及 KEAP1 的相對(duì)表達(dá)量。circKEAP1 的正向引物序列為5'-CGAGAAGTGTGTCCTCCACG-3'，反向引物序列為5'-CACTCAGGGACCTCCCCAAAAT-3'；KEAP1 的 正向引物序列為5'-CTGGAGGATCATACCAAGCAGG-3'，反向引物序列為5'-GGATACCCTCAATGGACACCAC-3'；β-actin 的正向引物序列為 5'-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3'，反向引物序列為5'-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3'。

3.2 質(zhì)粒構(gòu)建 選擇上海漢恒生物科技有限公司的 pHBLV-CMV-MCS-3FLAG-EF1-ZsGreen-T2A-PURO 載體，依次加入載體DNA（1 g/L）、10×Buffer、超純水、限制性核酸內(nèi)切酶（EcoR I和BamH I）試劑，輕輕吸打混勻，置于37 ℃水浴鍋中反應(yīng)2 h；酶切結(jié)束之后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段。設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行目的片段PCR 擴(kuò)增后，瓊脂糖凝膠回收得到正確大小的目的片段。將目的基因片段（大于100 ng）、線性化載體、無縫克隆試劑預(yù)混液與超純水配置克隆連接體系，于在50 ℃反應(yīng)30 min后，置于冰上5 min。隨后將DH5α 感受態(tài)細(xì)胞從-80 ℃冰箱拿出來之后立刻放到冰上融化，加入1 μL目的質(zhì)粒，冰上放置30 min，42 ℃熱激90 s，立刻插入冰上冰育2 min，隨后加入 500 μL 不含抗生素的 Luria-Bertani（LB）肉湯培養(yǎng)液，在37 ℃恒溫?fù)u床上震蕩培養(yǎng)60 min。將菌液涂到相應(yīng)抗性的固體平板上，涂布均勻，然后將板倒放37 ℃恒溫箱培養(yǎng)16 h。次日，挑陽性單克隆，進(jìn)行測(cè)序，確認(rèn)序列無誤后，使用質(zhì)粒抽提試劑盒對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增抽提。

3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞接種于6 孔板中，待其生長(zhǎng)到50%～60%密度備用轉(zhuǎn)染。準(zhǔn)備兩個(gè)微型離心管，分別加入100 μL 的Opti-MEM 培養(yǎng)液。對(duì)于小干擾RNA 的轉(zhuǎn)染，在第 1 個(gè)微型離心管中加入 5 μL 的 Lipofectamine 3000，另一個(gè)微型離心管中加入10 μL 20 μmol/L 濃度的小干擾RNA，將兩個(gè)微型離心管共孵育15 min 后，將上述樣品滴入細(xì)胞培養(yǎng)液中。對(duì)于質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染，在第1 個(gè)微型離心管中加入5 μL 的Lipofectamine 3000，另1個(gè)微型離心管中加入1 μg濃度的質(zhì)粒，并加入2 μL P3000。將兩個(gè)微型離心管中的溶液共孵育15 min 后，再將上述樣品滴入細(xì)胞培養(yǎng)液中。24 h后，換用新鮮的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

3.4 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活力 將細(xì)胞接種于96 孔板，轉(zhuǎn)染si-circKEAP1 或miR-661 抑制劑或過表達(dá)LIF 后，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的143B 細(xì)胞取出，棄去培養(yǎng)液，用PBS 溶液洗滌一遍后加入含有10% CCK-8溶液的培養(yǎng)液，進(jìn)一步培養(yǎng)2 h。隨后將96孔板置于酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 的吸光度（A）值，并計(jì)算細(xì)胞活力。

3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將細(xì)胞接種于6孔板，轉(zhuǎn)染si-circKEAP1或miR-661 抑制劑或過表達(dá)LIF 后，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的143B 細(xì)胞取出。使用PBS 溶液洗滌細(xì)胞，隨后使用無EDTA 的胰蛋白酶溶液將細(xì)胞消化下來，再次用PBS 溶液洗滌后，使用400 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞。向上述樣品中加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL 碘化丙啶（propidium iodide，PI）并在避光條件下孵育15 min。最后將樣品置于流式細(xì)胞儀中上機(jī)，并分析細(xì)胞凋亡比例。

3.6 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞接種于6 孔板，轉(zhuǎn)染sicircKEAP1 或 miR-661 抑制劑或過表達(dá) LIF 后，將細(xì)胞消化并離心重懸計(jì)數(shù)，均勻的鋪在24 孔Transwell板上層小室。上層小室中加入無血清培養(yǎng)液，下層加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液。24 h 后使用4%多聚甲醛固定，在孔板中加入結(jié)晶紫染液染色1 h，隨后使用清水洗凈。取出Transwell 上層小室，擦去上層多余的細(xì)胞，置于顯微鏡下觀察，并記錄典型視野。

3.7 螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 將293T 細(xì)胞接種于24 孔板中，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，待其貼壁并生長(zhǎng)達(dá)到密度50%～60%。將1.5 μL Lipofectamine 3000試劑、1 μL P3000試劑、500 ng對(duì)應(yīng)螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒（野生型或突變型）及3 μL 標(biāo)準(zhǔn)濃度的miR-661 模擬物（或miR 陰性對(duì)照）于無血清Opti-MEM 培養(yǎng)液中共孵育15 min，并轉(zhuǎn)染入293T 細(xì)胞中。36 h 后參照雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說明書，使用裂解液裂解細(xì)胞并加入螢火蟲螢光素酶底物，通過化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)螢火蟲熒光素酶活性，隨后檢測(cè)海腎螢光素酶活性，計(jì)算螢火蟲螢光素酶與海腎螢光素酶活性的比值。

3.8 Western blot 實(shí)驗(yàn) 將三羥甲基氨基甲烷3.02 g、甘氨酸18.8 g 和十二烷基硫酸鈉1 g 加水溶解，定容至1 L，制成電泳液。將三羥甲基氨基甲烷5.8 g、甘氨酸2.9 g 和十二烷基硫酸鈉0.376 g 加水溶解，定容至800 mL，并加入200 mL 甲醇，制成轉(zhuǎn)膜液。組裝電泳槽，倒入電泳液，在配好的SDS-PAGE 膠中每孔加入15 μg 蛋白樣品與適量蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。接通電泳儀電源后，首先以恒壓80 V 進(jìn)行電泳，隨后以120 V 恒壓電泳直至樣品移動(dòng)至分離膠末端。將PVDF 膜置于甲醇中激活，隨后將海綿、雙層濾紙、凝膠、PVDF 膜、雙層濾紙，海綿從下到上依次安裝并夾緊。根據(jù)目標(biāo)蛋白的分子量大小，在冰浴中按280 mA 恒流的條件轉(zhuǎn)膜90 min。使用TBST 溶液配制5%的牛血清白蛋白溶液，將PDVF 膜置于配置好的牛血清白蛋白溶液中室溫封閉1 h。TBST漂洗后，將對(duì)應(yīng)PVDF 膜裁剪后置于對(duì)應(yīng)配置好的Ⅰ抗中，4 ℃搖床孵育過夜或室溫下孵育1 h。取出PVDF 膜，使用TBST 溶液洗滌3 次，每次10 min。將與Ⅰ抗對(duì)應(yīng)種屬的Ⅱ抗按1∶10 000 的比例配制于5%牛血清白蛋白溶液中，將PVDF 膜置于含有Ⅱ抗的溶液中，于室溫在搖床上緩慢孵育1.5 h。取出PVDF 膜，使用TBST 溶液洗滌3 次，每次10 min。使用電化學(xué)超敏發(fā)光液進(jìn)行曝光顯影。使用ImageJ 軟件對(duì)目標(biāo)條帶進(jìn)行灰度定量分析。

從“伙伴”到“對(duì)手”：《美國(guó)國(guó)家安全戰(zhàn)略報(bào)告》的話語空間分析 ……………………… 劉文宇 徐博書（6.8）

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，KS檢驗(yàn)數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，方差分析數(shù)據(jù)符合方差齊性。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，兩兩比較比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 circKEAP1 在骨肉瘤細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，且具有更高的穩(wěn)定性

通過對(duì)基因表達(dá)集合數(shù)據(jù)庫（GSE140256）的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，我們篩選到在骨肉瘤組織中表達(dá)顯著上調(diào)的circRNA circKEAP1，又名has_circ_0049271（圖1A）。RT-qPCR 結(jié)果顯示，相比于對(duì)照成骨細(xì)胞hFOB1.19，骨肉瘤細(xì)胞系 U2OS、HOS、MG63、143B和SJSA-1 中circKEAP1 具有較高的豐度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖1B。circKEAP1 是由其母基因KEAP1的2 號(hào)外顯子自身成環(huán)形成，一代測(cè)序確認(rèn)其circRNA 結(jié)構(gòu)，且成環(huán)剪切位點(diǎn)為“TGGA”（圖 1C）。PCR 結(jié)果顯示，circKEAP1 僅存在于互補(bǔ)DNA 中，且不存在于基因組DNA 中。相比之下，其母基因KEAP1則同時(shí)存在于互補(bǔ)DNA 和基因組DNA 中（圖1D）。此外，我們使用放線菌素D 抑制RNA 合成。RT-qPCR 結(jié)果顯示，相比于 KEAP1 線性RNA，circKEAP1 具有更高的穩(wěn)定性，12 和 24 h 降解速率有顯著差異（P＜0.05或P＜0.01），見圖1E。

2 circKEAP1 促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞活力與遷移，抑制其凋亡

構(gòu)建針對(duì)circKEAP1 環(huán)狀剪切位點(diǎn)的小干擾RNA，使用 Lipofectamin 3000 將 si-circKEAP1 轉(zhuǎn)染入143B 細(xì) 胞 。 RT-qPCR 結(jié) 果 顯 示 ，143B 細(xì) 胞 中 的circKEAP1 表達(dá)顯著下降（P＜0.01），見圖2A。CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲減circKEAP1后，143B 細(xì)胞的活力顯著降低，48 和72 h 相比差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖2B。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲減circKEAP1后，143B 細(xì)胞的遷移能力顯著下降（P＜0.01），見圖2C。此外，流式細(xì)胞凋術(shù)結(jié)果顯示，敲減circKEAP1后，143B 細(xì)胞的凋亡比例顯著上升（P＜0.01），見圖2D。

3 circKEAP1 結(jié)合 miR-661 影響 143B 骨肉瘤細(xì)胞的活力和遷移

通過檢索CircBank 數(shù)據(jù)庫與CircInteractome 數(shù)據(jù)庫，預(yù)測(cè)能與circKEAP1 結(jié)合的miRNA 并取二者交集。進(jìn)一步通過生物信息學(xué)分析與文獻(xiàn)檢索，得到在骨肉瘤細(xì)胞中具有抑癌作用的miR-661（圖3A）［10，13］。circKEAP1 與 miR-661 存在較高評(píng)分的結(jié)合位點(diǎn)（圖3B）。構(gòu)建miR-661 模擬物、野生型及突變型雙螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒。雙螢光素報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示，miR-661 能與circKEAP1 結(jié)合，而不能與位點(diǎn)突變的 circKEAP1 結(jié)合（P＜0.01），見圖 3C。構(gòu)建miR-661 的抑制劑，將 si-circKEAP1 與 miR-661 抑制劑（或miRNA 抑制劑對(duì)照）共轉(zhuǎn)染入143B 細(xì)胞。CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-661 抑制劑能部分逆轉(zhuǎn)敲減circKEAP1介導(dǎo)的細(xì)胞活力降低，在48 和72 h 有顯著差異（P＜0.05 或P＜0.01），見圖3D。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-661 抑制劑能部分逆轉(zhuǎn)敲減circKEAP1引起的細(xì)胞遷移減少（P＜0.01），見圖3E。此外，流式細(xì)胞細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，抑制miR-661 能部分逆轉(zhuǎn)si-circKEAP1 介導(dǎo)的凋亡增加（P＜0.01），見圖3F。

4 miR-661能與LIF相互作用

Figure 1. The characteristics of circKEAP1 and its expression alteration in osteosarcoma cells. A：the differential expression of circRNAs in osteosarcoma and its adjacent tissue in GSE140256；B：the expression level of circKEAP1 in osteoblast hFOB1.19 and different osteosarcoma cell lines including U2OS，HOS，MG63，143B and SJSA-1；C：schematic illustration demonstrated the formation of circKEAP1 via exon 2 of KEAP1，and the formation of circKEAP1 was validated using PCR followed by Sanger sequencing；D：PCR confirming the existence of circKEAP1 in 143B cells（circKEAP1 was amplified by divergent primers in cDNA but not gDNA，while KEAP1 was amplified by convergent primers in both cDNA and gDNA）；E：the expression levels of circKEAP1 and KEAP1 mRNA in 143B cells treated with actinomycin D at the indicated time points were detected by RT-qPCR. Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs hFOB1.19 group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs circKEAP1 group.圖1 circKEAP1的特性及其在骨肉瘤細(xì)胞中表達(dá)的改變

為進(jìn)一步探究circKEAP1 發(fā)揮作用的下游靶基因，我們將轉(zhuǎn)染si-circKEAP1 后的143B 骨肉瘤細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。熱圖顯示敲減circKEAP1的143B細(xì)胞與對(duì)照差異RNA 表達(dá)情況（圖4A）。TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)miR-661下游有1 293個(gè)靶基因。將預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)與轉(zhuǎn)錄組中下調(diào)的RNA 取交集，進(jìn)一步生物信息學(xué)分析結(jié)合文獻(xiàn)檢索，可得高評(píng)分靶基因LIF（圖4B）。在 143B 細(xì)胞中，使用 si-circKEAP1 敲減circKEAP1，進(jìn)一步 RT-qPCR 分析顯示 LIF 的 mRNA 水平顯著下調(diào)（P＜0.01），見圖4C。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示LIF基因上有3 個(gè)miR-661 的結(jié)合位點(diǎn)，分別位于3'非翻譯區(qū)135～157、983～1005 和1978～2001。分別構(gòu)建針對(duì)3個(gè)位點(diǎn)的Luc-LIF突變型雙螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒（以及Luc-LIF 野生型對(duì)照質(zhì)粒），miR-661 模擬物（與miRNA 對(duì)照）在293T 中共轉(zhuǎn)染。螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，miR-661 能與LIF 結(jié)合，且3個(gè)位點(diǎn)均有較強(qiáng)的結(jié)合能力（P＜0.01），見圖4D。

Figure 2. circKEAP1 knockdown inhibited the viability and migration of 143B cells. A：the expression level of circKEAP1 evaluated by RT-qPCR；B：CCK-8 assay showing the viability of 143B cells transfected with si-circKEAP1 at 24，48 and 72 h；C：Transwell assay demonstrating the migration ability of 143B cells after circKEAP1 knockdown（scale bar=100 μm）；D：flow cytometry detecting the apoptosis rate change after 143B cells transfected with si-circKEAP1. Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs NC group.圖2 敲減circKRAP1抑制骨肉瘤細(xì)胞143B的活力和遷移

5 circKEAP1通過LIF提高骨肉瘤細(xì)胞活力并促進(jìn)其遷移

Figure 3. circKEAP1 enhanced the viability and migration of 143B cells through miR-661. A：Venn diagram demonstrating the targeted miRNAs of circKEAP1 predicted by CircBank and CircInteractome database；B：the interaction regions and the sequence of circKEAP1，miR-661 and mutant circKEAP1；C：luciferase reporter assay showing the interaction between circKEAP1 and miR-661；D：CCK-8 assay revealing the viability changes of 143B cells transfected with si-circKEAP1 and miR-661 inhibitor；E：Transwell assay showing the migration ability of 143B cells transfected with si-circKEAP1 and miR-661 inhibitor（scale bar=100 μm）；F：flow cytometry detecting the apoptosis rate change of 143B cells transfected with sicircKEAP1 and miR-661 inhibitor. Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs NC+miR-NC group；△△P＜0.01 vs si-circKEAP1+miRNC group；##P＜0.01 vs Luc-circKEAP1 WT+mimic NC group；▲▲P＜0.01 vs Luc-circKEAP1 WT+miR-661 mimic group.圖3 circKEAP1通過吸附miR-661促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞活力與遷移

討 論

Figure 4. miR-661 could interact with LIF. A：heatmap of RNA sequencing demonstrating the differential expression genes between 143B cells treated with si-circKEAP1 and controls；B：Venn diagram showing the overlap between target genes of miR-661 predicted by TargetScan database and down-regulated genes in RNA sequencing data；C：RT-qPCR revealing the LIF mRNA expression after circKEAP1 knockdown；D：luciferase reporter assay exhibiting the interaction between LIF and miR-661 in the 3 predicted binding sites（diagram illustrates the sequences of the 3 binding sites）. Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs Luc-LIF WT+mimic NC group；△△P＜0.01 vs Luc-LIF WT+miR-661 mimic group；##P＜0.01 vs NC group.圖4 miR-661能與LIF基因相互作用

circRNA 是一種共價(jià)閉環(huán)的非編碼RNA，不具備5'末端帽子和3'末端多聚腺苷酸尾巴。40 多年前，circRNA 首次被發(fā)現(xiàn)。隨后很長(zhǎng)一段時(shí)間，這種RNA 被認(rèn)為是一種無意義的剪切產(chǎn)物［14］。然而，近些年隨著高通量測(cè)序及針對(duì)circRNA 生物信息算法的發(fā)展，越來越多的circRNA 在真核細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)并鑒定，且呈現(xiàn)出一定的組織特異性分布［15］。大部分circRNA 定位于細(xì)胞質(zhì)，經(jīng)可變剪切從編碼蛋白的基因中產(chǎn)生。通常circRNA 由一個(gè)或多個(gè)外顯子構(gòu)成，也有少量由內(nèi)含子或內(nèi)含子聯(lián)合外顯子構(gòu)成［16］。盡管circRNA 相對(duì)于線性基因表達(dá)豐度稍低，但其高度的穩(wěn)定性使得circRNA 在許多病理生理過程中發(fā)揮著重要的作用。小鼠circRNA-42398通過調(diào)控TGF-β1/Smads 信號(hào)通路抑制肝星狀細(xì)胞活化［17］。在結(jié)腸癌中高表達(dá)的circPTK2 可以與波形蛋白（vimentin）的Ser38、Ser55 和Ser82 位點(diǎn)相結(jié)合，促進(jìn)結(jié)腸癌的進(jìn)展。這也使得circPTK2 有望成為治療結(jié)腸癌的潛在靶點(diǎn)［18］。在骨肉瘤中此前有研究報(bào)道，circECE1 通過競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合c-Myc 蛋白泛素化位點(diǎn)，減弱c-Myc蛋白泛素化降解，促進(jìn)TXNIP轉(zhuǎn)錄進(jìn)而促進(jìn)骨肉瘤的瓦博格效應(yīng)［19］。鑒于circRNA 重要的生物學(xué)功能與作用，尋找在特定疾病中具有較高豐度與穩(wěn)定性的一類circRNA，可能是干預(yù)并治療特病疾病，尤其是腫瘤的重要靶點(diǎn)。

Figure 5. LIF overexpression reversed circKEAP1 knockdown-induced inhibition of viability and migration of 143B cells. A：RT-qPCR revealing the mRNA expression of LIF in 143B cells transfected with si-circKEAP1 and LIF；B：Western blot revealing the protein expression of LIF in 143B cells transfected with si-circKEAP1 and LIF；C：CCK-8 assay demonstrating the viability of 143B cells transfected with si-circKEAP1 and LIF；D：Transwell assay showing the migration rate change of 143B cells transfected with si-circKEAP1 and LIF（scale bar=100 μm）；E：flow cytometry detecting the apoptosis rate change of 143B cells transfected with si-circKEAP1 and LIF. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs NC+Vec group；△△P＜0.01 vs si-circKEAP1+Vec group.圖5 過表達(dá)LIF能逆轉(zhuǎn)敲減circKEAP1介導(dǎo)的細(xì)胞活力和遷移抑制

本項(xiàng)研究中，我們通過分析基因表達(dá)集合數(shù)據(jù)庫GSE140256，首次檢測(cè)并篩選出在骨肉瘤組織中顯著表達(dá)上調(diào)的circRNA circKEAP1。經(jīng)RT-qPCR確認(rèn)，相對(duì)于成骨細(xì)胞hFOB1.19，該circRNA在各骨肉瘤細(xì)胞系中高表達(dá)，同時(shí)使用放線菌素D 驗(yàn)證了其具有較高的穩(wěn)定性。這表明circKEAP1 在骨肉瘤細(xì)胞中可能具有潛在的重要功能。circKEAP1 是由其線性轉(zhuǎn)錄本第2 號(hào)外顯子成環(huán)而來，針對(duì)其剪切位點(diǎn)我們?cè)O(shè)計(jì)了小干擾RNA，通過敲減circKEAP1的方法，驗(yàn)證了其具有促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞143B 增殖與遷移，同時(shí)抑制凋亡的功能。circRNA 具有較多微小RNA 結(jié)合位點(diǎn)，可通過海綿樣吸附微小RNAs 發(fā)揮作用［4］。這也是circRNA 被報(bào)道最多的作用機(jī)制之一。因此通過分析數(shù)據(jù)庫CircBank 與CircInteractome，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-661可通過增強(qiáng)骨肉瘤凋亡抑制骨肉瘤進(jìn)展，我們鎖定了miR-661 可能是潛在的circKRAP1 下游之一。circKEAP1 表面具有miR-661的反應(yīng)元件，我們通過螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了二者的結(jié)合。此外，抑制miR-661 可以部分逆轉(zhuǎn)敲減circKEAP1對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的抑制作用，這進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-661是circKEAP1的下游信號(hào)分子。

為進(jìn)一步探究下游的效應(yīng)基因，我們通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析篩選受circKEAP1 調(diào)控的基因，同時(shí)通過TargetScan 數(shù)據(jù)庫生物信息學(xué)分析miR-661 下游靶基因，取二者交集，經(jīng)過篩選得到LIF基因。LIF基因是白細(xì)胞介素6 細(xì)胞因子家族中最具多效性的成員之一，可激活多種信號(hào)通路，例如JAK/STAT 通路、MAPK 通路和PI3K 通路等。盡管如此，其在不同類型細(xì)胞中可能具有矛盾的相反作用，包括刺激或抑制細(xì)胞增殖、分化和存活等［20］。有學(xué)者報(bào)道，LIF可通過激活STAT3 通路促進(jìn)骨肉瘤生長(zhǎng)［21］。本研究中，我們驗(yàn)證了LIF可與miR-661相互作用，且3個(gè)結(jié)合位點(diǎn)均有較高的結(jié)合力。過表達(dá)LIF基因可部分逆轉(zhuǎn)敲減circKEAP1介導(dǎo)的腫瘤增殖抑制、凋亡增加與遷移減弱。這表明，circKEAP1 可通過對(duì)miR-661的海綿吸附作用，進(jìn)一步調(diào)控LIF，發(fā)揮其對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的促腫瘤作用。當(dāng)然，我們并不排除circKEAP1能夠靶向其他微小RNA，或者通過結(jié)合其他RNA 結(jié)合蛋白，甚至發(fā)揮翻譯作用引起骨肉瘤的生物學(xué)改變。該部分研究將在后續(xù)進(jìn)一步展開。

綜上所述，circKEAP1 能夠通過吸附miR-661，進(jìn)而調(diào)控其靶基因LIF，促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖與遷移。在體外水平，circKEAP1-miR-661-LIF 軸是干預(yù)骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的重要信號(hào)靶點(diǎn)，為骨肉瘤治療提供了參考資料。