腫瘤新抗原預測與鑒定的研究進展*

海博寧， 王 琳， 田怡然， 嚴 翔， 邵吉民

（浙江大學醫學院病理學與病理生理學系，浙江大學醫學院附屬第二醫院腫瘤研究所，浙江 杭州 310058）

腫瘤新抗原是腫瘤免疫治療的特異性靶標，具有高度異質性。如何準確且快速地鑒定腫瘤新抗原是其應用于臨床腫瘤免疫治療的關鍵，目前仍處于早期開發階段且具有挑戰性［1］。根據基因組測序、轉錄組測序或表位肽質譜數據、并結合計算工具評估免疫原性是腫瘤新抗原預測和鑒定的基本方法。近年，腫瘤新抗原的類型及其預測和鑒定的策略和技術取得了新進展，包括多組學（multi-omics）和T 細胞受體（T-cell receptor，TCR）表位篩選技術、生物信息學預測方法、以及免疫原性鑒定方法等方面。本綜述聚焦腫瘤新抗原預測與鑒定的研究進展，并討論目前存在的問題與展望。

1 腫瘤新抗原的概念與類型

1.1 腫瘤新抗原的概念 體細胞發生突變是癌癥的一大標志［2］，由此產生的突變蛋白經加工成為突變肽段、繼而被主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）I 類分子遞呈至腫瘤細胞表面并被T 細胞所識別時，會引發抗腫瘤的免疫應答，這種突變表位肽被稱為“新抗原”［3-5］。新抗原只特異性地存在于腫瘤細胞中，既不受既存的免疫耐受性的影響，也不會產生自身免疫性，因此腫瘤新抗原被認為是基于T 細胞免疫療法的安全有效的腫瘤特異性靶點。目前免疫療法更多靶向患者個體腫瘤特有的私有新抗原，往往步驟繁多、耗時長且成本高。而靶向衍生自腫瘤驅動基因的公共新抗原如KRAS、TP53、PIK3CA等可以規避靶向個體腫瘤特異性新抗原的限制，實現在患者中廣泛應用［6］。目前已有研究證明了公共新抗原具有免疫原性且相應臨床實驗正在進行中［7］。

1.2 腫瘤新抗原的類型 腫瘤新抗原除了傳統意義上來源于DNA 水平的體細胞突變如單核苷酸變異（single-nucleotide variant，SNV）、插入-缺失突變（insertion-deletion mutation，INDEL）［8］和基因融合［9］外，還來源于轉錄水平，比如 RNA 的可變剪接［10］和RNA 修飾［11］；同時，免疫蛋白組學研究顯示，蛋白酶體產生的剪接肽，以及經磷酸化、甲基化和糖基化等［12］翻 譯 后 修 飾（post-translational modification，PTM）的肽也可被T細胞識別而引發免疫反應。這些發現擴大了腫瘤新抗原的概念和種類。這些不同類型的新抗原均特異性存在于腫瘤細胞并具有免疫原性。

2 腫瘤新抗原篩選與預測方法

2.1 基于組學技術篩選出腫瘤新抗原 我們先前的綜述曾介紹腫瘤新抗原多組學的鑒定以及在臨床上的治療應用［13］。腫瘤新抗原的預測和鑒定主要包括以下幾個步驟：（1）從全外顯子測序（whole-exome sequencing，WES）數據中獲取基因組體細胞突變的列表并結合轉錄組測序（RNA-Seq）中的基因表達水平；（2）預測適當長度的包含突變的“新抗原多肽”與患者特異性MHC-I/II 類分子之間的親和力；（3）體內外實驗驗證親和力并鑒定預測肽段的免疫原性。

針對不同來源的新抗原會有不同的篩選方法。首先，對于體細胞突變，基于基因組學的策略應用最為普遍。WES靶向占整個基因組2%～3%的、與蛋白質編碼相關的基因，這些基因是導致突變蛋白出現的體細胞突變的主要來源［14］。同時RNA-Seq 可提供有關基因表達水平的信息，以確定突變基因是否在腫瘤中表達，以及表達的相對豐度，從而可以篩選更可能產生真實蛋白質的突變基因［15］。突變類型的多樣性導致針對不同類型的突變需要用到不同的識別工具。例如，Mutect2 和Strelka2 是用于體細胞SNV識別的最可靠的工具［16］，它們運用多種突變檢測算法以提高靈敏度與精度，應用Bayesian 方法檢測低頻 突 變。Strelka［17］、EBCall 及 Pindel［18］是用于 檢 測INDEL 的專用工具而用于鑒定融合基因的常用工具是 INTEGRATE［19］和 STAR-fusion［20］。

在轉錄水平上，RNA 可變剪接和RNA 修飾可產生新抗原。與正常樣本相比，在腫瘤中轉錄剪接多樣性的增加會導致新的腫瘤特異性外顯子-外顯子連接［21］，從而導致新抗原的產生。同時，腫瘤中可變剪接的類型也與正常組織不同。Kahles 等［22］通過對樣本RNA-Seq 數據分析，結果表明在腫瘤樣本中選擇性3'剪接位點和互斥外顯子的剪接調控得到增強，他們也開發了SplAdder 工具包來識別腫瘤特異性剪接事件。RNA 修飾本身不會改變RNA 序列，但對蛋白編碼序列的修飾會導致功能改變的蛋白表達。通過結合腫瘤基因圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）中的 RNA-Seq、WES 及蛋白質組數據，Peng 等［23］的研究表明 A-to-I 的 RNA 修飾方式增加了腫瘤中的蛋白質多樣性，相當多的修飾事件會導致氨基酸序列發生變化。

隨著質譜技術的發展，研究者可使用較少的組織樣本在蛋白水平上直接分析MHC 配體組，從細胞系和患者組織中篩選出成千上萬個MHC 呈遞的肽序列，得以確定真實存在的抗原表位。典型的質譜工作流程（基于免疫沉淀）如下：利用MHC 特異性抗體嵌合的磁珠免疫沉淀肽-MHC 復合物，同時設置陰性對照；隨后逐步洗脫，確保去除未結合以及非特異結合的多肽；之后對洗脫物進行質譜分析［24］。同時基于質譜技術的免疫蛋白組學可更好地鑒定經翻譯后修飾（如磷酸化［25］、甲基化和糖基化［26］等）的肽段，以及蛋白酶體產生的剪接肽。

2.2 基于計算機算法預測腫瘤新抗原 在基于組學技術篩選得到候選表位之后，研究者進一步研究它們是否可以最終成為能引發免疫反應的新抗原，其中驗證突變體肽的表達以及預測肽與MHC 之間的親和力是當前計算新抗原預測算法的2 個關鍵要素［27］。現已開發出了許多基于MHC-I類分子與肽段之間親和力的人工神經網絡模型（artificial neural network，ANN），用以預測肽段與MHC分子親和力水平。這些算法工具利用源自生化方法檢測的大規模肽與MHC 分子的結合數據以及通過MHC 配體組的高通量質譜分析獲得的洗脫配體數據，訓練基于機器學習的分類器，該分類器可以識別結合體和非結合體并計算親和力得分［28］，例如 NetMHC［29］和 NetMHCpan［30］工具可以預測超過80 個不同長度的MHCA、MHC-B和MHC-C分型表位肽的親和力。

除了對表位肽與MHC 分子之間親和力的預測，許多新抗原預測工具如 Netchop、NetCTL 等［31-32］也整合了蛋白酶體加工及內質網轉運的相關信息。此外，肽與MHC 之間相互作用的穩定性也與免疫原性關系密切［33］。雖然MHC分子呈遞突變肽是T細胞活化的必要條件，但并非所有呈遞的肽都能觸發T 細胞活化，候選新抗原可能由于難以觸發TCR 反應或有反應的TCR對自身抗原也有反應，從而被剔除［34］。

在前期研究中關于新抗原的預測工具大多僅是基于肽-MHC 親和力與加工遞呈的預測，由于有較多的質譜/親和力數據集可用于訓練與驗證，關于肽-MHC親和力的在線預測算法軟件發展迅速且逐漸成熟，但預測準確性有限。近幾年來，研究重點逐漸集中到其他與免疫原性相關的生物學特性上［27］，如多肽的氨基酸特征、理化性質、序列相似性等來預測其能否引發免疫反應，以提高準確性。

例如，Kim 等［35］開發的工具 Neopepsee 根據基因和蛋白質水平的信息，將與免疫原性相關的潛在特征分為3 類：MHC-I 分子結合和呈遞、氨基酸特征及復雜分數（complex scores），之后選定了IC50、親和力排名百分數、氨基酸疏水性、極性及與已知表位序列相似性等9 個特征構建深度學習分類器以預測新抗原免疫原性。Tang 等［36］開發的 TruNeo 則考慮了抗原肽遞呈至MHC 分子過程中的生物學特征、腫瘤的異質性和人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）雜合性缺失（HLA-loss of heterozygosity，HLALOH）等因素綜合得到免疫原性預測得分。此外，Zhang 等［37］開發的 ASNEO 是一種基于 RNA-Seq 數據來準確預測可變剪接新肽的算法，比較可變剪接肽與體細胞突變肽的免疫原性，以及對選擇剪接肽對T細胞反應的進行預測評估。

在 2020 年 11 月，腫瘤新抗原篩選聯盟［1］（Tumor Neoantigen Selection Alliance，TESLA）聯合了 25 個研究團隊對臨床樣本的新抗原進行了預測分析，利用各團隊獨立的預測方法以及基于重復隨機子樣本的方法鑒定出影響新抗原表位免疫原性的關鍵參數，即肽-MHC 親和力、腫瘤中表達豐度、結合穩定性、突變多肽與野生型多肽的親和力比值以及突變多肽與已知表位的相似度（外源性），這對新抗原預測與鑒定工作具有指導意義。2021 年，Lang 等［38］開發了NeoFox 工具，通過將文獻報道的描述代表新抗原的單個特征或單個特征組合的算法整合到NeoFox中來注釋具有16 種新抗原特征的候選新抗原。Lu等［39］開發的基于遷移學習構建的pMTnet 模型可以預測I 類肽-MHC 的TCR 結合特異性，使用長短期記憶（long short-term memory，LSTM）網絡對 I 類肽-MHC 進行編碼，以便可以用數字表示抗原和MHC 的蛋白質序列；堆疊式自動編碼器對TCR 序列進行編碼，再次以數字方式對TCR 序列的文本字符串進行編碼；最后利用經過訓練的TCR和肽-MHC數字向量編碼來學習它們之間的配對，從而解決了長期存在的TCR-肽-MHC 配對預測問題。表1 是對近年來計算機在線預測算法與數據庫的梳理和總結。

表1 新抗原預測的計算機在線方法與數據庫Table 1. Computer online pipelines and databases for neoantigen prediction

Table 1. (continued)

Table 1. (continued)

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新抗原肽從產生到被MHC 分子遞呈，最后被TCR 識別并激活T 細胞這一過程復雜且影響因素眾多，普遍認為很多參數會影響到新抗原的預測，但問題是如何對這些參數綜合評估以提高預測準確性，這需要大量已驗證的表位肽信息來支持。同時還有很多其他因素，如這些突變是否導致突變蛋白的產生，肽翻譯后修飾對肽穩定性和MHC 結合能力的影響，以及不同的MHC 分子對抗原呈遞細胞獲得的交叉呈遞抗原的能力等［1］，都會對最終效果產生影響。

2.3 基于TCR 的預測方法 新抗原引發免疫反應的關鍵是能被T細胞識別，T細胞主要通過TCR 的互補 決定 區 3（complementarity-determining region 3，CDR3）環來識別肽-MHC 復合物。之前已經提到過呈遞的肽可能會由于與自身肽相似而被清除，源自SNV 的新抗原往往只有一個氨基酸的變化，而大多情況下MHC 呈遞的自身多肽中的單個氨基酸變化足以逃避自身耐受性［50］。基于此，Calis 等［51］進行了模型的開發，通過將突變多肽的序列與對應野生型進行比較，該模型可用于為新抗原賦予“外源性分數”，從而增加被TCR所識別的可能。

具有不同TCR 庫的不同個體可以識別相同的抗原表位，由此說明這樣的表位存在某種內在模式，使得它更容易被TCR 識別［52］，也說明對同一表位具有特異性的TCR 庫在其核心序列中具有相似性［53］，由此可基于肽與TCR 組成部分的序列進行模擬。現今已報道的預測多肽與TCR 結合的工具有TCRex［54］、NetTCR［55］、Repitope［56］、ERGO［57］、Deepwalk approach［58］、TCRdist［53］、GLIPH2［59］等。其中，TCRex 基于相似的TCR 序列通常靶向相同的表位的原理，可以使用機器學習技術來學習這些表位特異性TCR 序列所共享的分子基礎，使用在公開可用的TCRβ序列數據上訓練的表位特異性預測模型來評估結合目標表位的可能性；Repitope則基于表位序列包含一些易于激活T 細胞反應的內在隱藏模式，利用TCR 序列作為“誘餌”來探測具有免疫原性的表位，并提出了一種模擬肽-MHC 復合物與公共TCR 克隆型之間熱力學相互作用的計算框架。

還有計算TCR 序列相似性的方法，如TCRdist使用BLOSUM62 評分矩陣計算兩個受體環之間的相似性權重錯配距離，每個TCR 都映射到受體內已知與肽-MHC 提供接觸的環的氨基酸序列，通過使用相似性加權Hamming 距離比較這些串聯的CDR 序列來計算兩個TCR 之間的距離，引入空位罰分以捕獲長度變化；GLIPH 算法則可根據CDR3 中的共有相似性，對識別相同表位的TCR 進行聚類，并預測其MHC 分型，而在此基礎上研發出的GLIPH2 可以快速分析數百萬個TCR 序列，具有較高的聚類效率和準確性。另外，也可以基于結構進行預測，例如PePSSI［60］（通過溶劑化界面預測肽-MHC 結構）是一種可預測與HLA-A2分子結合的肽結構的方法，它包括肽主鏈構象的采樣和MHC 側鏈的靈活移動，并考慮了肽-MHC 復合體界面處的水分子。HLAffy［61］是基于肽-MHC 識別機制開發的模型，通過學習對肽結合的重要配對電位，再通過評估肽-MHC 復合物的結合親和力來預測任何MHC-I 類表位。在與MHC 結合的肽的構象中也應考慮諸如氨基酸電荷和大小以及疏水性殘基的組成等性質的影響。表2 總結了近年來預測多肽與TCR結合的工具與數據庫。

表2 預測多肽與T細胞受體結合的工具與數據庫Table 2. Tools and databases for predicting peptides binding to T-cell receptor（TCR）

目前有些研究表明，肽-HLA 的TCR 識別概率與突變肽和致病性抗原之間的相似性呈正相關，且多肽的芳香族氨基酸側鏈（色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸）或疏水性氨基酸側鏈（纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸）可觸發其與TCR 的高度親和力［62］，多肽的第4～6位氨基酸對TCR 的識別十分重要［63］。在此基礎上也開發了一定的模擬算法，但目前這類工具尚處于開發早期，其算法質量很大程度上依賴于實驗數據集的大小，而目前描述新抗原免疫原性的數據集仍然很小，不斷增加的實驗數據量將支持具有更大預測能力的模型的生成。若能確定TCR 與多肽間識別的模式，結合之前的計算機預測方法定能大大提高腫瘤新抗原預測與鑒定的準確性與應用性。

3 腫瘤新抗原免疫原性驗證方法

在完成了上述對于腫瘤新抗原的預測分析與篩選后，接下來則是驗證出真正能激活T 細胞的新抗原表位，這可通過利用來自患者本身或健康個體的T細胞來實現。與使用質譜法相比，基于T 細胞的測定法具有直接檢測患者的T 細胞庫是否已檢出MHC呈遞的新抗原的優勢。

但實際中，驗證得出T 細胞新抗原的工作具有一定的挑戰，主要因為：（1）靶向某一特定抗原的T細胞在外周血中的含量很低，很難準確地檢測出來；（2）TCR 與抗原肽存在多特異性，某一特異TCR 可能會識別出不相干的抗原［64］；（3）TCR 與肽-MHC 之間相互作用的親和力比抗體及其抗原之間的親和力要低好幾個數量級［65］，需要更為靈敏的生化技術；（4）抗原的加工和呈遞產生大量潛在的T 細胞表位，使其難以在抗原呈遞細胞中合成或表達以進行篩選。目前，比較常見的TCR抗原靶點篩選技術分為以下2個類別：

3.1 通過新抗原去篩選其特異性TCR 這類方法的經典策略是通過檢測T 細胞暴露于給定抗原后的功能反應來評估TCR-肽-MHC 相互作用，包括通過流式細胞術檢測T 細胞增殖，鉻釋放試驗檢測活化T細胞的抗原特異性殺傷細胞能力，以及酶聯免疫斑點測定法（enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT）和胞內因子染色（intracellular cytokine staining，ICS）檢測T 細胞活化后釋放的細胞因子等。另一個常用策略是應用熒光標記的肽-MHC 多聚體，即MHC 分子與合成表位肽的寡聚體形式，與流式細胞術結合，篩選和分離抗原特異性T細胞［66］。

近年來還有多種新技術手段被研發出來。例如質譜流式標記技術，通過結合使用質譜流式與肽-MHC 多聚體染色技術，Newel 等［67］報道了在單個樣本中同時鑒定109 個肽-MHC 多聚體的特異性以及20～30 個細胞表面和胞內標志物的方法；還有DNA-條形碼標記技術［68］，使用DNA 條碼可同時標記上千種肽-MHC 多聚體，可以并行檢測上千種多肽的特異性。這些技術均為提高T 細胞表位篩選能力提供了方便。這些方法同時也都存在需要大量T 細胞，熒光染料數量不夠等缺點。

3.2 通過已知TCR 篩選被識別的抗原 以TCR 為主導的篩選方法在早期主要使用隨機合成肽庫，該庫將肽段中某一個或幾個位置固定而對其余所有位置的氨基酸進行隨機化，通過分析其對攜帶某一TCR 的T 細胞的激活能力從而找到該TCR 識別的抗原信息［69-70］。該策略也已用于鑒定腫瘤特異性T 細胞克隆的模擬表位以及評估TCR交叉反應性［71］。

2019 年，Li 等［72］利用了 T 淋巴細胞和抗原遞呈細胞之間特有的胞啃作用開發了新的篩選方法，一旦表達某一TCR 的Jurkat T 細胞成功識別了攜帶肽-MHC的K562靶細胞，事先標記過的TCR會在胞啃作用下轉移至K562細胞表面，通過流式分選這些K562細胞，后續經測序可得到遞呈的抗原信息。還有Kula 等［73］研發的 T-scan 平臺則使用了顆粒酶 B 報告基因系統，T 細胞一旦成功識別了靶細胞，T 細胞分泌的顆粒酶B 導致靶細胞中報告基因系統活性熒光蛋白的激活，從而篩選出能被T 細胞的靶細胞，經測序得到抗原信息。這些基于細胞的方法可在104～105范圍內對表位進行篩選，且更接近于真實的T 細胞與抗原之間的識別，接下來的研究需進一步確定所需的最小T細胞豐度。

4 討論與展望

在基因組學測序等技術以及計算能力的增強和不斷改進的推動下，腫瘤新抗原預測與鑒定領域在近十年來已經有了巨大的發展。在新抗原預測工具與技術不斷改進的同時，臨床試驗也對新抗原作為腫瘤免疫治療的單一或組合靶點進行了探索［27］。早期臨床報告表明，以mRNA 為載體、以新抗原為靶點的個性化新抗原疫苗單獨或者與PD-1和PD-L1阻斷劑聯合使用具有臨床抗腫瘤活性［74-75］。同時，基于新抗原的T 細胞療法［如腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TIL）和TCR-T 療法］的臨床試驗也在穩步推進中［76］。

但新抗原篩選和鑒定所需的時間相對較長，至少需要6～8 周，對于治療窗口較短的患者來說沒有足夠的時間，且鑒于當前可用的新抗原預測算法的準確性有限，因此仍需要努力來利用機器學習平臺來提高新抗原預測的準確性。缺乏實驗數據是最主要問題，同時用于訓練這些模型的數據集通常非常冗余，包含許多相同或非常相似的表位，如不加處理會導致預測工具過度擬合，從而降低準確率［77］。盡管對T 細胞表位內的錨定殘基和面向TCR 的殘基的研究正在不斷發展［78］，但新抗原表位與TCR 分析數據集相連接的能力還尚未完全發展。

目前在個性化新抗原免疫治療推向更廣泛臨床應用之前存在幾個主要障礙，包括準確檢測和定量免疫原性腫瘤新抗原以及對免疫逃逸的準確生物學障礙的了解，這些都限制了個別患者對免疫治療的有效性［79］。盡管鑒定突變來源的新抗原的實驗方法和計算機模擬方法的準確性有所提高，但是大多數MHC 表位預測方法嚴重偏向可提供訓練數據的MHC-I 類新抗原，對II 類新抗原和罕見的MHC 同種異型缺乏敏感性和特異性［79］，還有其他因素可能會影響預測表位的最終免疫原性包括基因表達、RNA剪接、蛋白質體加工的整體模式等。目前這些預測算法與模型都存在各自的問題，如何提高準確性，更好地將這些預測方法組合起來，同時臨床研究上將免疫療法合理組合，擴大新抗原特異性T 細胞群，增強T 細胞向腫瘤的轉運將極大的推動腫瘤免疫治療的發展。