琯溪蜜柚黃酮重結晶工藝優化

胡 陽 鄭麗燕 楊遠帆 吳錦輝 倪 輝

黃酮類化合物是一類重要的多酚類次級代謝產物，廣泛分布于植物中，對果實色澤、風味和營養及植物抗逆性和抗病蟲害具有重要影響[1-2]。常見的黃酮類化合物有柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、蕓香苷和槲皮素等，其抗氧化和清除自由基功能使其可以應用于生產抗腫瘤、抗炎鎮痛、降血糖、免疫調節、抗病毒抑菌等藥物及功能性保健食品中[3]。此外，黃酮類化合物還具有一定的顏色和風味，在食品工業中可作為天然食品添加劑(如食用色素、風味改良劑等)用于食品、飲料的生產等[4]。黃酮類物質在醫藥、食品、化妝品等行業均具有廣闊的發展前景和應用潛力[5-6]。

目前，常見的黃酮提取方法有有機溶劑提取法和水提取法等，黃酮類物質精制純化方法包括色譜法(常壓柱層析法、高壓制備型HPLC法、高速逆流色譜法)和結晶法等[7]。高麗等[8]利用大孔樹脂精制荷葉黃酮，黃酮純度達55.28%；康彤[9]利用大孔樹脂精制甘草黃酮粗品，黃酮純度為66.8%；江正祥等[10]利用甲醇與異丙醇的混合溶液作結晶溶劑純化曲克盧丁，純度可達95%，回收率為75%；劉艷杰[11]利用甲醇反溶劑重結晶法純化黃酮純度為99.8%。相比較而言，采用色譜法對黃酮進行純化設備昂貴、耗時長、溶劑消耗大，而采用重結晶法分離純化黃酮類物質具有對分離設備要求低、操作簡單、溶劑用量少等優點，因此是黃酮產品工業生產中精制純化普遍采用方法。同時，不同植物來源的黃酮種類及特性不同，溶劑種類、酸堿度、添加量，以及結晶溫度和時間等均對黃酮重結晶具有一定影響，進而影響重結晶黃酮的純度和產量[12]。

相關研究[2]表明，柑橘類水果中含有大量的黃酮類化合物，是人類膳食中黃酮類化合物攝入的主要來源之一，也是食品和準制藥工業中黃酮類化合物的主要來源。柚類水果是重要的柑橘類水果，中國柚類水果產量占全球12%左右，僅福建省平和縣琯溪蜜柚產量就達到了120萬t[13]。柚類水果的殘次廢果及加工副產物含有橙皮苷、新橙皮苷和柚皮苷等黃酮類物質，含量達1%～6%[14]，是工業化生產黃酮的潛在優質原料。課題組[15]前期已優化建立了柚皮黃酮乙醇提取工藝，提取得率為柚皮干重的4.90%。研究擬在此基礎上，進一步優化柚皮黃酮的重結晶工藝參數，并對重結晶產物進行結構和純度分析，以期為植物黃酮的重結晶精制提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

琯溪蜜柚：福建省漳州市平和縣；

蘆丁(純度≥95.0%)、九水合硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

無水乙醇：分析純，天津市大茂化學試劑廠；

甲醇、乙腈：色譜純，美國Thermo公司；

高速粉碎機：JP-500C型，永康市久品工貿有限公司；

旋轉蒸發儀：RE-501型，上海力辰科技有限公司；

酶標儀：Epoch 2T型，美國伯騰儀器有限公司；

超聲波清洗機：KQ5200DE型，昆山市超聲儀器有限公司；

島津液相色譜儀：LC-20AT型，日本島津公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 柚皮黃酮粗品制備 參照晏幸等[15]的方法并修改。設置提取液料比30∶1 (mL/g)、乙醇體積分數67%、超聲頻率163 W、超聲溫度35 ℃，超聲時間50 min，提取兩次后收集提取液，真空濃縮至粗提液中黃酮質量濃度≥2.0 mg/mL，于4 ℃析出晶體沉淀，過濾，60 ℃烘干后制得黃酮粗品。

1.2.2 重結晶單因素試驗

(1) 乙醇體積分數對黃酮重結晶得率的影響：稱取0.50 g 黃酮粗品，液料比為30∶1 (mL/g)，乙醇體積分數分別為10%，20%，30%，40%，50%，對黃酮結晶粗品進行超聲水浴輔助溶解，離心取上清液，測定其黃酮含量，調節pH值為4.0，4 ℃下進行重結晶，24 h后收集重結晶沉淀，計算晶體重結晶得率。

(2) 液料比對黃酮重結晶得率的影響：稱取0.50 g黃酮粗品，液料比分別為10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1 (mL/g)，乙醇體積分數為20%，對黃酮粗品進行超聲水浴輔助溶解，離心取上清液，測定其黃酮含量，并調節pH值為4.0，4 ℃下進行結晶，24 h后收集重結晶沉淀，計算晶體重結晶得率。

(3) pH值對黃酮重結晶得率的影響：稱取0.50 g黃酮粗品，乙醇體積分數為20%，液料比為30∶1 (mL/g)，對黃酮粗品進行超聲水浴輔助溶解，離心取上清液，測定其黃酮含量，并分別調節pH為3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，4 ℃下進行結晶，24 h后收集重結晶沉淀，計算晶體重結晶得率。

(4) 結晶時間對黃酮重結晶得率的影響：稱取0.50 g黃酮粗品，乙醇體積分數為20%、液料比為30∶1 (mL/g)，對黃酮粗品進行超聲水浴輔助溶解，離心取上清液，測定其黃酮含量，并調節pH為4.0，4 ℃下進行結晶，結晶時間分別為6，12，24，36，48 h，收集重結晶沉淀，計算晶體重結晶得率。

1.2.3 響應面試驗設計與優化 根據Box-Behnken中心組合試驗原則，以單因素試驗結果為基礎，利用Design-Expert 8.06軟件對選定因素進行響應面試驗設計、方差分析以及回歸分析，獲得最佳重結晶工藝。

1.2.4 指標測定方法

(1) 黃酮總含量：參照晏幸等[15]的方法。

(2) 黃酮重結晶得率：按式(1)計算提取液中黃酮重結晶得率。

(1)

式中：

X1——黃酮重結晶得率，%；

m1——重結晶的晶體質量，g；

m0——被結晶物的質量，g。

(3) 黃酮主要成分的HPLC分析：采用Shim-pack GIS C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱對樣品進行HPLC分析，進樣體積5 μL；流速0.5 mL/min，柱溫40 ℃，檢測波長284 nm；梯度洗脫條件：0～15 min，35%流動相A(超純水)、65%流動相B(乙腈)。采用標準品對照確定主要成分含量。

(4) 黃酮純度：分別取0.02 g柚皮苷標準品、黃酮粗品和黃酮重結晶樣品溶解于10 mL乙腈中，定容；過0.22 μm濾膜進行HPLC分析。根據標準品與樣品的HPLC峰面積之比，按式(2)計算重結晶樣品純度。

(2)

式中：

X2——黃酮純度，%；

A1——重結晶晶體的液相峰面積；

A0——標準品的液相峰面積。

1.3 數據處理

采用Excel 2013軟件對數據進行平均值、標準偏差的計算和圖表繪制；采用RStudio 2022.02.0對數據進行單因素顯著性分析；通過Design-Expert 8.06軟件進行響應面試驗設計與數據方差分析。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇體積分數對黃酮重結晶得率的影響 由圖1可知，隨著乙醇體積分數的升高，黃酮晶體重結晶得率先增大后顯著減少，當乙醇體積分數為20%時達最大值2.41%，與林芳等[16]的結論一致，是因為隨著乙醇體積分數的上升，乙醇溶液極性下降，黃酮溶解度下降，而低體積分數的乙醇溶液極性更接近于黃酮極性，更有利于黃酮的溶解以及混合液體系的飽和，從而利于晶體的析出。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖1 乙醇體積分數對黃酮重結晶得率的影響Figure 1 Effects of ethanol volume fraction on the recrystallization yield of flavonoids

2.1.2 液料比對黃酮重結晶率的影響 由圖2可知，隨著液料比的增大，溶液中的黃酮含量和黃酮重結晶得率呈明顯下降趨勢，當液料比為10∶1 (mL/g)時，重結晶得率達到最大值8.21%。

2.1.3 pH值對黃酮重結晶得率的影響 由圖3可知，隨著pH值的升高，黃酮重結晶得率先升高后下降，當pH值為4.0時黃酮重結晶得率達最大值8.45%，與甄暢迪等[17]的結論一致，說明酸性條件下更有利于黃酮物質的溶解以及結晶速度的提高。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖2 液料比對黃酮重結晶得率的影響Figure 2 Effects of the liquid-solid ratio on the recrystallization yield of flavonoids

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖3 pH對黃酮重結晶得率的影響Figure 3 Effects of pH value on the recrystallization yield of flavonoids

2.1.4 結晶時間對黃酮重結晶得率的影響 由圖4可知，結晶時間對黃酮重結晶得率的影響與一般規律相同，當結晶時間為24 h時黃酮重結晶得率達8.26%，并趨于穩定，當結晶時間為36 h時達最大值8.47%，但無顯著性差異，說明結晶時間為24 h左右，粗品中的黃酮已接近全部析出，考慮到工業生產中的成本與效益，取結晶時間24 h為最優結晶時間。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖4 結晶時間對黃酮重結晶得率的影響Figure 4 Effects of crystallization time on the recrystallization yield of flavonoids

2.2 響應面試驗

2.2.1 Box-Behnken設計方案及試驗結果 固定液料比為10∶1 (mL/g)，以黃酮重結晶率為響應值，對乙醇體積分數、pH和結晶時間3個因素進行響應面設計，試驗因素水平見表1，試驗設計及結果見表2。

經Design-Expert 8.06多項擬合回歸后，得二次項回歸方程為：

Y=-19.703+1.442A+6.479B-0.045C-8.775×10-2AB+2.083×10-4AC+4.292×10-2BC-2.324×10-2A2-7.888×10-2B2-1.571×10-3C2。

(3)

2.2.2 回歸模型方差分析 由表3可知，回歸模型F=19.97，P<0.05，說明該回歸模型顯著；一次項A、B、C，交互項AB及二次項A2和B2均具有顯著影響(P<0.05)。

表1 響應面試驗因素與水平表Table 1 Factors and levels of response surface test

因此，二次項回歸方程修訂為Y=-19.703+1.442A+6.479B-0.045C-8.775×10-2AB-2.324×10-2A2-7.888×10-2B2。各因素的效應關系為A(乙醇體積分數)>C(結晶時間)>B(pH)。相關系數R2=0.973，變異系數CV=8.31%<10%，表明模型可信且擬合程度良好，試驗誤差小，可用該模型對黃酮重結晶工藝進行分析、優化和預測。

2.2.3 響應面分析與優化 由圖5可知，乙醇體積分數與pH的交互作用對黃酮重結晶率的影響比較顯著，與方差分析結果一致。

對二次多項式回歸方程進行求導計算，得出黃酮重結晶最優工藝條件為乙醇體積分數24.09%，pH 3.75，結晶時間36 h，預測黃酮重結晶得率最高為9.13%。結合實際生產情況，將其參數修正為液料比10∶1 (mL/g)，乙醇體積分數24%，pH 3.75，結晶時間24 h，重復3次實驗測得黃酮重結晶得率為8.76%，與預測值相近，由此驗證了響應面法優化所得的黃酮重結晶工藝模型的可靠性和合理性。

2.3 黃酮晶體的初步鑒定

由圖6可知，精制黃酮的保留時間與柚皮苷標準品完全對應，由此可以判定黃酮重結晶產物為柚皮苷。經重結晶精制純化后雜質含量明顯減少，說明重結晶精制黃酮粗品的方法具有一定效果。

表2 響應面試驗優化設計與結果Table 2 The optimization design and results of response surface test

2.4 黃酮晶體純度

柚皮中的黃酮類物質有柚皮苷、蘆丁、橙皮苷和新橙皮苷，其中柚皮苷和蘆丁含量較多[18]。根據標準曲線計算可得精制品中柚皮苷純度為83.38%，相對于粗結晶樣CV=8.31%。

表3 基于黃酮重結晶得率的方差分析結果?Table 3 Analyses of variance results based on the recrystallization yield of flavonoids

圖5 各因素交互作用對柚皮黃酮重結晶得率的影響Figure 5 Effects of interaction of various factors on the recrystallization yield of flavonoids from pomelo peel

圖6 精制黃酮、黃酮粗品和柚皮苷標準品的HPLC圖Figure 6 HPLC diagram of refined flavonoid, crude flavonoid and naringin standard

品，純度提高了36%。許鷺[19]通過D101型大孔樹脂分離純化柚皮苷3次，經60%乙醇溶液重溶后，得到純度為92.44%的柚皮苷精制品；項飛等[12]通過乙醇溶液提取黃酮后，經多次重結晶和洗滌得到純度為70.36%的黃酮化合物；涂招秀等[20]利用大孔樹脂—結晶法精制蔓三七葉黃酮，得到純度為91.8%的黃酮精品。賈冬英[21]采用DM130大孔吸附樹脂法粗提柚皮中的柚皮苷后，經3次不同條件的重結晶后，得到柚皮苷精制品純度為85.07%。試驗精制品中柚皮苷純度與上述報道的純度對比略低，但相對于多次重結晶，該精制過程步驟簡潔，純度較高。相比于大孔樹脂純化或大孔樹脂與重結晶相結合精制黃酮類化合物，該工藝操作簡單、省時高效、無污染，提取的黃酮純度與其他方法無大差別，適用于工業化生產。

3 結論

通過響應面法優化了乙醇重結晶精制黃酮工藝。結果表明，精制黃酮粗品的最優工藝方案為液料比10∶1 (mL/g)、乙醇體積分數24%、pH值3.75、結晶時間24 h。此條件下蜜柚黃酮重結晶率為8.76%，結晶產物主要為柚皮苷，純度為83.38%。研究尚未更深入地鑒定結晶產物，后續將采用紅外光譜、質譜和核磁共振等技術手段作進一步探究，明確細化結晶產物中的黃酮種類。