邊銷茶中“金花菌”檢測方法優化及DNA測序結果分析研究

向麗萍，吳金春，覃宇，張祖文，李霞，王蘭蘭

遵義市產品質量檢驗檢測院，貴州 遵義 563000

邊銷茶作為銷往邊疆少數民族地區的緊壓茶,其生產成品主要為茯磚、康磚、青磚、金尖、花磚、黑磚等。黑磚、茯磚、花磚作為邊銷茶中的主要幾種茶葉類別，在加工過程中會進行“人工發花”，其原理是讓微生物在濕熱等條件下大量繁殖發生特殊的反應形成“金花”，俗稱金花菌[1-2]。金花菌能使茶葉轉化多酚類物質，改善茶葉的品質，有清除自由基、降脂、降壓以及調節糖類代謝的功效[3]?！敖鸹ň钡臄盗亢唾|量對于判定茯磚茶品質好壞起重要作用[4]。

現階段針對“金花菌”開展的研究有感官質量評價、ITS通用引物測序分析、微生物菌落形態特征等方面?！敖鸹ň蓖ǔＲ饬x上主要是指冠突散囊菌，但邊銷茶中散囊菌屬有很多類，包含冠突散囊菌（Eurotium cristatum）、匍匐散菌（Eurotium repens）、間型散囊菌（Eurotium intermedius）、謝百散囊菌（Eurotium chevalieri）、阿姆斯特丹散囊菌（Eurotium amstelodami）、赤散囊菌（Eurotium rubrum）和一種未定名的散囊菌（Eurotiumsp），其中前5 個菌是優勢種類[5]。許多文獻表明，ITS 通用引物分析鑒定“金花菌”只能鑒別到真菌門類曲霉屬子囊菌綱，到具體哪一種真菌存在一定不確定性，通過NCBI網站Blastn比對分析，同源性高達99%以上的真菌種類有多種[6]。篩選Score得分最高的和相似性最強的前十幾條目錄，可以知道“金花菌”中散囊菌的范圍，優勢真菌群為哪幾類。本研究從收集的15組邊銷茶茶樣中檢測其“金花菌”菌落數量，ITS 通用引物測序分析測出各茶樣之間親緣性強弱，篩選優化出一種快速提取其“金花菌”DNA的方法，為后續開展“金花菌”的研究，提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試茶樣來自10 家邊銷茶生產企業（貴州省9家、湖南省1家），生產于2012—2021年間。

供試藥品：氯化鈉（分析純），天津科密歐生化試劑有限公司生產；孟加拉紅瓊脂，廣州陸橋檢測技術有限公司生產；Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR（細菌真菌直接裂解液）、Premix TaqTM、瓊脂糖（Agarose）、DL1000 DNA Maker、6*Loading Buffer 均由寶日醫生物技術（北京）有限公司生產；GeneGreen 核酸染料，天根生化科技（北京）有限公司生產。

主要儀器設備：生物安全柜，蘇凈安泰空氣技術有限公司生產；隔水式霉菌培養箱、全自動立式壓力滅菌器均由上海博訊醫療生物儀器股份有限公司生產；CFX96 熒光定量pcr 儀Bio-Rad、電泳儀及電泳槽Bio-Rad、核酸蛋白分析儀均由美國伯樂生物技術有限公司生產。

1.2 試驗方法

1.2.1 “金花菌”的菌落數量

將15 組茶葉樣品分別編號為G1～G15，按照《緊壓茶 第3 部分：茯磚茶》（GB/T 9833.3—2013）[7]、《黑 茶 第5 部 分：茯 茶》（GB/T 32719.5—2018）[8]中規定的冠突散囊菌按《食品安全國家標準食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數》（GB 4789.15—2016）[9]進行檢測計數，具體步驟和方法如下。

稱取25 g樣品→加入225 mL無菌生理鹽水→充分振搖，拍擊式均質器均質2 min→10倍系列梯度稀釋→每個稀釋度2個無菌平皿，分別加入1 mL稀釋液→傾注20～25 mL 的孟加拉紅瓊脂→28 ℃培養5 d→菌落計數。

1.2.2 “金花菌”的DNA提取及方法優化

傳統真菌DNA 提取方法需要刮取真菌菌絲，液氮研磨，費事費力；而選擇某些商業試劑盒提取DNA又耗時長，提取效果不佳，經過篩選，本試驗選用細菌真菌直接裂解液進行提取。但在實驗中按照DNA提取試劑盒使用說明書進行時，出現DNA提取失敗現象，因此對于試驗步驟進行優化，設計2 組不同培養時間對照試驗，通過PCR電泳結果篩選出一種適合的“金花菌”DNA快速提取的方法。

處理1：15 組樣品，按照GB 4789.15—2016標準方法培養5 d（120 h）后，使用細菌真菌直接裂解液試劑盒，取50 μL細菌真菌直接裂解液于滅菌的Micortube中，用滅菌槍頭挑取單菌落，置于Micortube中攪動幾下后取出，80 ℃熱變形15 min，5 000 r/min離心15 min，取1～5 μL裂解后上清液作為PCR反應模板。

處理2：15 組樣品，按GB 4789.15—2016 方法培養3 d（72 h）后，使用細菌真菌直接裂解液試劑盒，剩余步驟同處理1。

1.2.3 “金花菌”系統發育樹構建

ITS 通用引物序列對于提取15 組“金花菌”進行PCR 反應，PCR 產物送至上海生工生物技術有限公司測序，并在NCBI 網站Blastn 比對分析，根據同源性最高的比對序列，了解此次“金花菌”中優勢散囊菌種群分類，然后用MEGA7軟件構建系統發育樹，了解其親緣性。

PCR 反應擴增體系：ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG- 3'） 和ITS4 （5'- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'），預混液使用Premix TaqTM（Ex TaqTM Version 2.0 plus dye）體系，反應體系總體積25 μL（12.5 μL Premix TaqTM、2 μL 樣品提取

DNA、0.5 μL ITS1、0.5 μL ITS4、9.5 μLddH2O）。

PCR 反應條件程序為：94 ℃預變性5 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環30 次，最后72 ℃延伸8 min 后得PCR 產物。擴增結束后的PCR產物進行凝膠電泳查看DNA提取及擴增效果。然后將其送至上海生工生物技術有限公司測序。

2 結果與分析

2.1 “金花菌”菌落數量及ITS測序分析菌群范圍

“金花菌”菌落數量根據GB 4789.15—2016檢測方法檢驗結果及ITS 測序分析鑒定，通過NCBI網站Blastn 比對分析[10]，同源性前20 組的序列進行比對，得出子囊菌綱，曲霉菌屬，及“金花菌”鑒定優勢菌群范圍。此次15 組樣品ITS 序列在NCBI數據庫進行比對，顯示該菌ITS序列與蒙地曲霉(Ascomycetes montevidensis）、阿姆斯特丹曲霉（Ascomycetes amstelodami）、赤曲霉（Ascomycetes ruber）、謝瓦曲霉（Ascomycetes chevalieri）、冠突曲霉（Ascomycetes cristatum）、雪花曲霉（Ascomycetes niveoglaucus）具有極高的同源性，且期望值均為0。ITS 序列分析對于“金花菌”只能鑒別到曲霉菌屬，子囊菌綱。試驗表明此次試驗的15組“金花菌”中優勢菌種為6種。

“金花菌”的菌落形態在孟加拉紅瓊脂上培養120 h 后，菌株周圍呈金黃色，中心變為黑色（圖1）。

圖1 “金花菌”孟加拉紅瓊脂培養120 h生長圖

從“金花菌”的菌落數量（表1）可知，15組樣品中生產日期最早的G11為2012年1月壓制，其菌落數量1.4×106CFU/g；生產日期最晚的G5為2021年4月壓制，其菌落數量為3.5×105CFU/g，均超過其產品標準規定的≥20×104CFU/g，表明“金花菌”在合適的儲存環境下，其菌落數量較為穩定，對生長環境要求不高，適合長期保存。比較同一廠家不同年份生產的茶葉金花菌數量，G2和G11 為貴州FJ 茶葉有限公司間隔約8年生產的茶葉，其“金花菌”數量均超過標準規定值的5倍以上，表明該公司發花工藝穩定、成熟；G7和G13為鎮寧自治縣JP農產品開發有限公司間隔約1年生產且至今年份較近的產品，其“金花菌”數量未達到產品標準規定，生產工藝需改進。

表1 測試樣品ITSq測序分析菌落鑒定結果

2.2 “金花菌”DNA提取及擴增效果

由1.2.2不同培養時間對照試驗的PCR電泳結果可知，培養時間為120 h 的處理1 無電泳條帶（圖2），表示DNA 提取失敗；處理2 條帶清晰明顯（圖3），表示DNA提取成功，方法優化的效果較好。對15 組“金花菌”菌落使用處理2 即優化后的DNA提取方法提取DNA，使用核酸蛋白分析儀測定其純度，其在吸光度OD260/OD280的比值為1.6～1.9 之間，以及PCR 產物凝膠電泳查看DNA 提取和擴增效果。自左向右G1～G15，由電泳圖可知目的條帶大小約為500 bp，條帶清晰明顯，DNA提取及擴增效果良好。由此驗證出一種快速提取“金花菌”DNA的方法，選用細菌真菌裂解液，控制菌株生長時間，在孟加拉紅瓊脂上，培養72 h 最佳，通過接種環刮取菌絲，至裂解液中，最快20 min提取DNA成功，節約大量時間。

圖2 金花菌培養120 h后DNA提取及擴增效果凝膠電泳圖

圖3 金花菌培養72 h后DNA提取及擴增效果凝膠電泳圖

2.3 “金花菌”系統發育樹構建

對G1～G15 共15 組邊銷茶茶樣中“金花菌”的測序結果通過NCBI 分析選取Score 最高、同源性最大的1組。G1～G15的ITS序列比對結果如表2，據比對結果構建系統發育樹，知曉15 組邊銷茶的親緣性。對不同產地及不同年份出廠的茶葉中“金花菌”有預估性了解，對“發花”生產工藝所產生的“金花菌”菌群穩定性有所掌握。

以表2 中同源性最高的鑒定結果構建系統發育樹，由圖4 可見，此次篩選的15 組樣品，主要分為3 個分支。每個分支上遺傳距離極為接近，而G12 和G5，G2 和G11，G4 和G10 均屬于同一廠家不同年份生產的邊銷茶，都聚集在同一分支上，表示這些廠家的生產工藝比較穩定。G1為外省公司生產的邊銷茶和本省4 家公司的產品在同一分支上，表明邊銷茶中“金花菌”通過自然發花方式生產，其菌群比較穩定，優勢菌群明顯。

圖4 15株“金花菌”基于ITS序列比對Score最高的構建系統發育樹

表2 同源性及分值最高的ITS序列比對結果

3 小結與討論

ITS序列分析廣泛應用于真菌的鑒定，但是對于“金花菌”只能鑒定到散囊菌屬，對于下一步鑒定到種還需要結合其他鑒定手段。如真菌學中的形態分類學以孢子形態和子實體特征為主要分類依據，同時結合電子顯微鏡觀察菌絲的結構、生態等特征；也可以進行多基因系統發育分析或全基因分析。此次ITS序列分析對于15組測試樣品比對分析后，得出優勢菌群范圍為Ascomycetes montevidensis、Ascomycetes amstelodami、Ascomycetes ruber、Ascomycetes chevalieri、Ascomycetes cristatum、Ascomycetes niveoglaucus6種。

“金花菌”作為茯磚茶和黑磚茶等的一個特有的標志性特征，其菌落數量是衡量這一特征的關鍵性指標，生產工藝的穩定和成熟與否與該指標存在極大關系。本次試驗中，同一廠家相隔8年生產的G2和G11兩個茶樣“金花菌”是標準規定值的5 倍以上；15 組試驗茶葉據今生產日期最近的至少有2年時間，其中有7組茶葉“金花菌”數量均超過標準規定值，表明在合適的儲存條件下，“金花菌”數量保持一定的穩定性，下降趨勢不明顯。對于“金花菌”菌落數量的檢驗是必不可少的，在“金花菌”菌落數量試驗過程中，發現制樣環節也極為重要，應使用均質器充分震蕩搖勻，否則結果出入較大。

此次研究中也優化出一種快速提取“金花菌”DNA的方法，可以縮短提取時間，且提取效果良好。在此提取過程中一定要控制“金花菌”的培養時間，培養時間過長，易導致菌生長老化，使用試劑盒不易裂解其真菌細胞壁，導致其DNA提取失敗。因此培養時間選用72 h為宜，配合試劑盒操作方法，可以快速提取該菌DNA，為后續開展“金花菌”的分子生物學研究提供一定的技術基礎。