針刀對膝骨關節炎兔軟骨細胞氧化應激的影響*

張 茜 張 典 許 悅 陳烯琳 秦露雪 郭長青

（北京中醫藥大學，北京 100029）

膝骨關節炎（KOA）作為一種常見的慢性退行性骨關節炎疾病，以疼痛、活動受限為主要臨床表現，以軟骨退變、滑膜病變等為主要病理表現［1］。研究顯示，異常生物力學可參與KOA的發生，并造成關節軟骨活性氧（ROS）的異常升高及抗氧化酶的減少，誘發軟骨細胞的氧化應激［2］。氧化應激可通過損傷線粒體基因組（mtDNA），及喚醒絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等激酶，或激活c-Jun氨基末端激酶通路（JNK）和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路（PI3K/Akt）等通路，而誘導軟骨細胞凋亡，介導KOA的發病，并推動KOA的病理進程［3-6］。一系列研究已證實，針刀干預通過松解關節周圍軟組織，可幫助恢復膝關節力學平衡，且對軟骨細胞有一定的保護作用［7-9］。本實驗即在此基礎上，測定氧化應激相關標志物及軟骨細胞內DNA損傷標志物，觀察針刀干預對KOA兔軟骨細胞氧化應激的影響，進而探索針刀治療異常生物力學相關的KOA的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇28只健康清潔級6月齡雄性新西蘭兔，體質量2.0～2.5 kg，購自北京富龍騰飛實驗動物研究院有限公司（動物許可證號：SYXK京2018-0041）。動物均單籠飼養，室溫（20±2）℃，濕度40%～70%，標準飲食。

1.2 試劑與儀器 一氧化氮合酶（NOS）測試盒、丙二醛（MDA）測試盒、總超氧化物歧化（SOD）酶測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）測試盒（均購自江蘇省南京市建成生物工程研究所）；抗磷酸組蛋白H2AX抗體（05-636-1，購自 millipore）；HRP酶標記抗小鼠二抗（GB23301，購自Servicebio）；胃蛋白酶消化液、PBS緩沖液、組化試劑盒DAB顯色劑、高速組織研磨儀、渦旋混合器、脫色搖床（均購自Servicebio）；實驗室超純水機（AK-RO-C2型，艾肯水精靈）；酶標檢測儀（Epoch型，BioTeK）；臺式高速冷凍離心機、移液器（均購自Dragon）；組化筆（購自Gene tech）；顯微鏡（購自CIC）；電子天平（ME203E/02型，上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；立式冷藏陳列柜（LSC-316C型，星星生物科技有限公司）；臥式冷凍箱、-80℃冰箱（均購自中國中科美菱公司）；4℃冰箱（日本SANYO公司）。

1.3 分組及造模 按照隨機數字表法將28只兔隨機分為空白組、模型組、電針組及針刀組，每組7只。造模方法選擇Videman左后肢伸直位固定制動法，并經實際情況改良。造模前10～16 h停止喂食，使用3%戊巴比妥鈉溶液以耳緣靜脈注射方式麻醉，劑量按30 mg/kg確定，后固定動物，左后肢腹股溝至踝關節區域備皮，造模過程中使該肢膝關節伸直180°、踝關節背屈60°以保持完全伸直位，用65～85℃熱水浸泡高分子繃帶使其軟化，從腹股溝到足踝纏于兔腿，重點固定膝踝關節，腹股溝處墊棉以防皮膚磨損，后以硬度適中的紙板、布條及防啃咬繃帶進一步固定。留出足趾觀察血供，每日檢查固定情況，及時處理脫落及腫脹等問題，共制動6周。

1.4 干預方法 空白組常規飼養，不予其他處理。模型組造模之后同空白組，不予干預。電針組造模成功后選擇左膝部血海、梁丘、犢鼻及外膝眼穴，取穴參照《實驗針灸學》［10］結合動物比較法，上述穴位常規消毒后，以規格為0.2 mm×13 mm（環球牌，蘇州針灸用品有限公司）的一次性無菌針灸針進行針刺治療，后連接韓氏穴位神經刺激儀，分別連接血海與犢鼻，梁丘與外膝眼。波形疏密波，頻率2/100 Hz，強度3 mA，治療15 min，隔日1次，共治療4周。針刀組造模成功后選擇0.3 mm×30 mm的HZ系列一次性針刀（北京卓越華友醫療器械有限公司），以左下肢股內側肌肌腱、股外側肌肌腱、股直肌肌腱、股二頭肌肌腱止點及條索結節點為進針部位，在上述部位以龍膽紫定位，常規備皮、消毒，針刀刃與肌腱或條索結節點所在肌肉肌腱走向平行，針刀體與皮膚垂直，按四部規程進針刀，后分別松解各肌腱與骨連接處，及向條索和結節的縱軸方向進行上下松解2～3次，出針后按壓片刻。每周1次，治療4周。

1.5 標本采集與檢測 各組動物于治療結束后，以過量麻醉方式處死，在無菌條件下以直徑為8 mm的環鉆垂直于關節軟骨面，在左下肢脛骨平臺內、外側中央負重區截取軟骨-軟骨下骨復合體圓柱形組織塊，鉆取深度為10 mm，用于免疫組化檢測；后快速刮取關節軟骨面上的剩余軟骨，予生理鹽水沖洗后封存，以備試劑盒檢測。1）將軟骨組織制備成10%的勻漿液，離心后取上清，采用bicincininic acid法（BCA）法測定上清液中的蛋白濃度，采用試劑盒測定勻漿中NOS、MDA、SOD及GSH-Px活性，按照說明書步驟進行操作。2）用比色法測定NOS及GSH-PX活力，用硫代巴比妥酸（TBA）法測定MDA活力，用羥胺法測定SOD活力。測定特定波長下有色產物的吸光度值（OD值），可據相應公式計算出以上物質活力。3）用免疫組化法測定γ-H2AX表達情況。將經多聚甲醛固定及脫鈣后的復合體新鮮組織制成切片以石蠟包埋，二甲苯及乙醇梯度脫水，胃蛋白酶消化液孵育修復抗原，磷酸緩沖鹽溶液多次沖洗，3%過氧化氫阻斷，血清封閉，一抗及二抗孵育，二氨基聯苯胺顯色，經蘇木素復染，再次進行梯度脫水及透明過程，后用中性樹膠封片。每張切片隨機取4個視野（200倍），用顯微成像系統拍片。圖片分析借助Image-ProPlus6.0（IPP）圖像分析系統，先測量每張圖片的累積光密度值（IOD），后以IOD/區域面積方式計算其平均光密度值（AOD），以4個視野的平均AOD值代表該切片的AOD值，以評估實驗兔軟骨細胞內γ-H2AX的表達水平。

1.6 統計學處理 應用SPSS22.0統計軟件進行數據處理。每組樣本數據符合正態以（）表示，予單因素方差分析進行組間比較，用LSD檢驗進行方差齊性的兩兩比較，用Games-Howell檢驗予方差不齊的兩兩比較。顯著性差異取P＜0.05，極顯著性差異取P＜0.01。

2 結果

2.1 各組兔膝軟骨細胞NOS及MDA活力比較 見表1。結果表明，模型組軟骨細胞NOS活力高于空白組（P＜0.01）；針刀組軟骨細胞NOS活力低于模型組（P＜0.05）；電針組與模型組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）；針刀組與電針組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。模型組軟骨細胞MDA活力高于空白組（P＜0.01）；針刀組軟骨細胞 MDA活力低于模型組（P＜0.05）；電針組與模型組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）；針刀組與電針組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組兔膝軟骨細胞NOS及MDA活力比較（±s）

表1 各組兔膝軟骨細胞NOS及MDA活力比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05。下同。

組別空白組模型組電針組針刀組n 7 7 7 7 NOS活力（U/mg）0.90±0.19 1.36±0.38*1.09±0.24 0.99±0.13△MDA活力（nmoL/mg）3.73±0.87 6.09±1.43*5.08±1.24 4.69±1.09△

2.2 各組兔膝軟骨細胞SOD及GSH-Px活性比較見表2。結果表明，模型組軟骨細胞SOD活力低于空白組（P＜0.01）；針刀組及電針組軟骨細胞SOD活力均高于模型組（P＜0.05）；針刀組與電針組相比，無明顯差異（P＞0.05）。模型組軟骨細胞GSH-Px活力低于空白組（P＜0.01）；針刀組及電針組軟骨細胞GSH-Px活力與模型組相比，均無明顯差異（P＞0.05）；針刀組與電針組相比，無明顯差異（P＞0.05）。

表2 各組兔膝軟骨細胞SOD及GSH-Px活性比較（U/mg，±s）

表2 各組兔膝軟骨細胞SOD及GSH-Px活性比較（U/mg，±s）

組別空白組模型組電針組針刀組n 7 7 7 7 SOD活力22.98±6.54 14.29±4.19*21.06±1.80△20.33±4.43△GSH-Px活力37.09±9.66 24.29±8.74*27.26±5.35 28.22±5.75

2.3 各組兔膝軟骨細胞γ-H2AX的表達水平比較見圖1。光鏡下觀察結果，空白組軟骨表面完整，軟骨細胞未見明顯γ-H2AX表達；模型組可見表層軟骨撕脫，軟骨細胞γ-H2AX表達較密；針刀組及電針組較模型組軟骨損傷程度輕，可見少量軟骨細胞γ-H2AX表達。各組γ-H2AX的AOD值比較見表3。其中，模型組軟骨細胞γ-H2AX表達強于空白組（P＜0.01）；針刀組及電針組軟骨細胞γ-H2AX表達均弱于模型組（P＜0.05）；針刀組與電針組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖1 各組兔膝軟骨細胞γ-H2AX表達（200倍）

表3 各組兔膝軟骨細胞γ-H2AX的表達水平比較（U/mg，±s）

表3 各組兔膝軟骨細胞γ-H2AX的表達水平比較（U/mg，±s）

組別空白組模型組電針組針刀組n 7 7 7 7 AOD 2.27±1.85 24.17±4.15*10.06±0.90△12.22±2.15△

3 討論

KOA在中醫屬學“痹證”范疇，受異常應力影響的KOA往往存在膝關節內部組織間解剖位置的改變，在中醫可以用“筋骨失衡”來概括這一變化，即以關節周圍肌肉、韌帶等軟組織為代表的“筋”和以軟骨、骨為代表的“骨”之間產生位置的異常變動及由此引發的一系列失衡狀態。《素問·調經論》［11］載“病在筋，調之筋；病在骨，調之骨”，強調了筋骨疾病治療過程中對病位的看重。膝痹的筋骨失衡中，異常應力多直接作用于膝關節周圍軟組織，故需選擇對軟組織病變針對性強的療法。針刀作為一種軟組織松解術，可通過對膝關節周圍的“筋”進行切開、牽拉及機械刺激，調整“筋”與“骨”的異常位置關系，故適合治療異常機械應力誘發的KOA［12］。本課題組前期已從對膝周伸屈肌群生物力學的調整、肌肉萎縮的延緩及韌帶功能的恢復等方面證實針刀對膝周軟組織異常生物力學的調節作用［7-9］。

異常生物力學與軟骨細胞的氧化應激關聯緊密。一方面，軟骨細胞是軟骨的唯一細胞，對機械負荷較敏感。研究表明，異常機械載荷作用于關節軟骨，經細胞外基質、細胞周基質及Ⅵ型膠原、跨細胞膜表面受體等的傳輸和調節，可完成力學信號與電信號間的轉化，誘導軟骨細胞線粒體扭曲變形，產生并釋放ROS［13-14］。過量的ROS可造成mtDNA的脂質過氧化，加速軟骨退變［3］。另一方面，機械負荷可提高與超氧化物歧化酶2（SOD2）下調相關的細胞水平，引起SOD2下調，這一現象尤其體現于OA軟骨中，而SOD2是線粒體中唯一存在的SOD同種型［2，15］。

氧化應激的本質是氧化水平和抗氧化水平的失衡，故以ROS的異常增多及抗氧化物的持續下調為主要表現，并伴隨氧化產物的產生［16］。NO是軟骨細胞中ROS的主要類型，主要由NOS調節生成，在NOS催化下易與超氧化物（O2）結合形成過氧亞硝酸鹽，該物質通過損害蛋白質及mtDNA而破壞軟骨細胞［17］。MDA為脂質過氧化產物，是氧化應激過程中氧自由基攻擊生物膜上的不飽和脂肪酸形成的，其升高常被視為細胞損傷的重要標志［18-20］。SOD及GSH-Px為細胞中存在的抗氧化酶，二者均可通過對氧化物及氧化產物加以轉化，維護細胞內的氧化還原平衡［15，21］。其中SOD偏重于清除氧自由基，GSH-Px擅長抑制脂質過氧化［18-19］。

本研究表明，造模后各組兔軟骨細胞與正常兔相比，NOS及MDA活力均升高，SOD及GSH-Px活力均下降。證明了異常生物力學可造成KOA兔軟骨細胞的氧化應激。軟骨細胞氧化應激既是KOA發病和進展的關鍵因素，又可能成為KOA治療的新靶點［17］。已有多項研究證實，中藥、艾灸等療法可通過其抗氧化作用治療KOA［22-24］。本實驗結果顯示，針刀干預可降低KOA兔膝軟骨細胞的NOS及MDA活力，升高SOD活力。提示我們：針刀干預可能基于其對膝周軟組織異常生物力學的調整作用，進而影響氧化物合成酶及抗氧化防御酶，發揮抗氧化效應。

另外，氧化應激可直接造成軟骨細胞內DNA的損傷，主要表現為DNA雙鏈斷裂（DSBs），DSBs可使組蛋白H2AX的139位絲氨酸磷酸化為γ-H2AX，故γ-H2AX被視為DNA損傷的直接指標［25-26］。本實驗中，模型組兔膝軟骨細胞內γ-H2AX表達較空白組明顯增多，針刀組較模型組表達下降，提示針刀干預可能通過抗氧化作用減少軟骨細胞內DNA的損傷，從而保護軟骨細胞，延緩KOA的病理進展。

值得一提的是，機械力學等刺激可激活MAPKs，通過其內部信號轉導通路促進軟骨細胞中的誘導性一氧化氮合酶（iNOS）和基質金屬蛋白酶（MMPs）的表達，且iNOS本身即可促進MMPs增加而加速KOA中的軟骨降解［27-28］。有研究顯示，針刀干預可抑制MMP-3及MMP-13的基因和蛋白表達［29］。故本實驗中針刀對KOA兔軟骨細胞NOS活力的下調作用，可能同樣是通過抑制MAPKs來實現，有待進一步研究。針刀及電針干預對軟骨細胞GSH-Px活力的影響雖無統計學差異，但有上升趨勢，考慮可能與治療時間較短有關。本實驗不足之處還在于樣本量較少，且缺乏干預過程中更多時間點上的指標檢測，將在之后研究中進一步完善。