預測類固醇抵抗性哮喘的生物標志物

武娟娟 李建強

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是一種氣道慢性炎癥性疾病,糖皮質激素尤其是吸入激素聯合長效β2受體激動劑是目前治療哮喘的一線療法,大部分患者通過規范化治療可獲得哮喘控制，但有5%～10%的患者對這些藥物的反應不滿意，導致哮喘癥狀難以控制，類固醇抵抗(SR)被認為是糖皮質激素治療反應不佳的最重要原因，它們對醫療保健造成了不成比例的巨大負擔。SR定義為在適當劑量的類固醇治療2周后，1秒內用力呼氣量 (FEV1)改善<15%[1]。

臨床上目前缺乏準確預測哮喘患者類固醇反應性的生物標志物，診斷基于充分類固醇治療后的臨床病史和肺功能，這導致患者長時間接受高劑量的類固醇，直到認識到這對治療無效。事實上，這些患者發病的一個關鍵原因來自長期高劑量類固醇的毒副作用。這些包括對感染、骨質疏松癥、高血糖癥和心血管疾病的易感性增加[2-3]，因此尋找能夠預測類固醇抵抗性哮喘(SRA)的無創性生物標志物已成為研究熱點。早期識別SRA患者有助于提供更有效的抗炎治療，并避免與長期皮質類固醇治療相關的潛在副作用。本文簡要總結了目前預測SRA的幾種生物標志物，例如：維生素D結合蛋白 (VDBP)，微RNA-21(miRNA-21)，磷酸化的p38絲裂原活化蛋白激酶(p-p38 MAPK)和應激活化蛋白激酶1(p-MSK1)，血清OX40配體(OX40L)和胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)。

VDBP

最近，人們對維生素D軸在肺病中的作用非常感興趣，其中包括維生素D(VitD)、維生素D受體(VDR)和維生素D結合蛋白(VDBP)。許多研究表明哮喘和維生素 D 之間存在聯系。維生素D是一種脂溶性維生素，除了對鈣和磷酸鹽的體內平衡有影響，越來越多的研究表明它還是一種復雜的免疫調節分子。維生素 D 水平通常通過血清25-羥基維生素D3 (25-(OH)-D3)水平來衡量；因為這種形式的維生素 D 更穩定，而維生素 D 的活性形式 1,25-二羥基維生素D3(1,25(OH)2-D3)的半衰期較短。維生素D需要通過VDR介導發揮免疫調節作用[4]。多項研究發現1,25(OH)2-D3聯合糖皮[]質激素不僅可以有效改善患者癥狀，還可以與糖皮質激素聯合發揮抗炎效果，并能在較大程度上降低糖皮質激素的用藥量[5]。在Bassam Mahboub等人[6]的實驗中強調了 VitD 在SRA中的作用，類固醇抗性與糖皮質激素受體 (GR-β)的表達增加有關，糖皮質激素(GC)與細胞質中GR結合以及 GC/GR 復合物易位到細胞核中，在細胞核中GC/GR 復合物通過直接 DNA 結合或轉錄因子失活來修飾特定基因的轉錄。GR有兩種變體，GR-α和GR-β，在 C 末端結構域有細微的剪接差異。GR-β不能與 GC 結合，因此不能轉導GC誘導的功能。我們評估了維生素 D 缺乏的哮喘患者補充維生素 D 前后糖皮質激素受體GR-α和GR-β的表達水平。有趣的是，校正 VitD 水平通過上調 GR-α水平而不影響 GR-β水平來提高 GR-α/GR-β比率。總之，恢復 VitD 水平可通過增強 GR-α的表達來改善哮喘患者對類固醇治療的反應。

VDBP是一種糖基化的球蛋白，它是白蛋白基因家族的一部分，與白蛋白具有多個二硫鍵連接的三重結構域結構[7]。幾乎所有維生素 D 代謝物循環時都與 VDBP(對維生素 D 配體的高親和力)或血清白蛋白(對維生素 D 配體的豐度高但親和力低)結合。有研究發現，過量的VDBP會限制未結合的維生素D在細胞中的自由擴散，限制維生素D的活性，從而導致潛在的免疫后果。已有研究證明維生素D對哮喘患者具有抗炎和增強類固醇激素的作用，上述研究也表明維生素D不足可導致SRA的發生。另一方面，血清25-(OH)-D3的降低有可能會反過來影響血清VDBP，這可能會促進SRA患者血清VDBP的升高。目前機制尚不清楚，但這表明維生素D軸在SRA的發生和發展中發揮重要作用。

循環中只有5%的VDBP與維生素D代謝物復合，這使得相當數量的VDBP可用于其他功能。VDBP的另一主要功能與中性粒細胞趨化性和巨噬細胞活化有關[8]。最近的研究表明SRA的一種表型與中性粒細胞性炎癥有關。在重癥哮喘和SRA患者的血液循環和痰液中發現中性粒細胞增多。因此，我們推測血清VDBP升高誘導中性粒細胞募集，從而引起SRA患者中性粒細胞炎癥和類固醇耐藥性。此外，前期研究發現VDBP的另一重要功能是轉化為巨噬細胞活化因子后誘導巨噬細胞活化。肺泡巨噬細胞是哮喘氣道中最豐富的細胞類型，因此我們推測血清VDBP的增加可能通過激活SRA患者的巨噬細胞促進氣道炎癥的發生。由此我們推測，血清VDBP升高可能誘發SRA患者中性粒細胞炎癥和巨噬細胞活化，可能在SRA的發病機制中參與了慢性氣道炎癥和SR的發生。在江洪娟等[9]的一項研究中，評估了類固醇敏感性哮喘(SSA)和SRA患者血清蛋白質組的差異， 發現SRA組血清VDBP水平顯著高于SSA組和對照組，證實血清VDBP升高是SRA的危險預測因子。綜上，血清 VDBP 可能是一種有用的非侵入性生物標志物，可以預測哮喘患者的類固醇抵抗。盡管目前針對該指標開展的臨床實驗相對較少，其在 SRA 患者中的作用未完全明確，臨床尚未應用其評估哮喘患者是否存在類固醇抵抗，但有部分臨床研究已證實VDBP 對 SRA 患者具有潛在的臨床價值，故有必要進一步研究 VDBP 在 SRA 患者中的生物學機制。

miRNA-21

非編碼 RNA (ncRNA) 是非編碼蛋白質的 RNA 轉錄物，特別是微RNA (miRNA)，由于它作為基因表達的關鍵調節因子的多功能作用，最近受到越來越多的關注[10]。miRNA 通常在轉錄后階段，通過mRNA裂解和降解和/或通過抑制翻譯，以序列特異性方式負調控基因表達[11]。越來越多的證據表明，miRNAs對肺發育和維持肺無病狀態至關重要。在哮喘中研究最多的 miRNA 之一是 miRNA-21，對哮喘小鼠模型和哮喘患者的多項研究表明，miRNA-21 的上調負調節 IL-12p35、組蛋白去乙酰化酶 2 (HDAC2)，并正調節磷酸肌醇 3-激酶 (PI3K)，這可能會促進 Th2 細胞因子的表達增加并抑制 Th1 細胞因子的表達[12]。Th2/Th1失衡是哮喘重要的發病機制之一。

最近的一項研究表明，T淋巴細胞分泌的一種重要細胞因子IL-12，可能在哮喘發病機制中起重要作用。IL-12是一種來自巨噬細胞和樹突狀細胞的由IL-12p35和IL-12p40亞基組成的異二聚體細胞因子，也是先天免疫和適應性免疫之間的重要聯系。有研究證實IL-12p35是miRNA-21的一個分子靶點，miRNA-21可以顯著抑制IL-12轉錄后的翻譯過程[13]。隨著miRNA-21的表達增加會導致IL-12表達降低。IL-12在過敏原激發之前和期間阻止了過敏原誘導的氣道嗜酸性粒細胞增多、氣道高反應性、Th2細胞因子的產生和過敏原特異性血清IgE的產生，而它增加了干擾素-γ以及過敏氣道浸潤中CD4+T細胞凋亡增強。多項研究發現，miRNA-21 的上調可以負調節 IL-12p35，導致IL-12水平降低，限制其發揮免疫調節作用。

解釋哮喘患者相對皮質類固醇耐藥性的最重要機制之一是HDAC2降低。HDAC2屬于HDAC家族，它主要位于細胞核內，可以阻止RNA聚合酶Ⅱ及轉錄因子與其上的轉錄位點相結合，在抑制炎性基因的轉錄和炎性蛋白的表達中起重要作用。之前的研究表明，糖皮質激素通過將HDAC2招募至炎性基因轉錄起始位點，使乙酰化的組蛋白去乙酰化，從而抑制炎性基因轉錄，使炎性因子表達降低。John A. Marwick等人[14]研究發現類固醇不敏感和HDAC2活性降低都與異常的PI3K活性有關。PI3Ks是參與調節細胞生長、代謝、增殖、葡萄糖穩態和囊泡運輸的蛋白家族。miRNA-21可以下調磷酸酶和緊張素同源物(PTEN)的表達， PTEN通過催化磷脂酰肌醇3,4,5-二磷酸的去磷酸化，轉化為磷脂酰肌醇4,5-二磷酸來拮抗PI3K活性，所以哮喘患者miRNA-21增加，PI3K活性增強，它的靶蛋白是AKT，AKT是一類高強度保守性的絲氨酸蛋白激酶物質及蘇氨酸蛋白激酶物質。PI3K介導AKT的磷酸化和核易位，從而抑制HDAC2水平導致GR過度磷酸化，降低了由糖皮質激素誘導的各種抗炎基因的表達，從而降低了糖皮質激素的敏感性。Richard Y. Kim等人[15]研究中發現 miRNA-21 通過放大 PI3K 介導的 HDAC2 抑制來驅動嚴重的、類固醇不敏感的實驗性哮喘，因此，抑制增加的 miRNA-21 或 PI3K 反應可抑制疾病并恢復類固醇敏感性。由此我們認為哮喘患者血清中高的miRNA-21可以預測類固醇不敏感。Elbehidy等人[16]的研究中同樣發現，與SSA患者相比，SRA哮喘患者血清定量表達miRNA-21水平顯著升高。Logistic回歸分析評估miRNA-21是否能預測哮喘患者的吸入皮質類固醇(ICS)反應，結果示miRNA-21是ICS反應的獨立預測因子。由此得出結論，miRNA-21 可以成為跟蹤吸入性皮質類固醇治療反應的有前途的生物標志物。

P-P38 MAPK和P-MSK1

絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是一組絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。在哺乳動物細胞中，有三個明確的MAPK通路:細胞外信號調節激酶(ERK)通路，JUN N-末端激酶(JNK)途徑和p38途徑。p38 MAPK與哮喘的氣道炎癥相關[17]。研究報道p38 MAPK的激活與皮質類固醇的反應性降低有關，糖皮質激素(GC)與糖皮質激素受體 (GR) 結合，后者從細胞質轉移到細胞核中。GR與糖皮質激素反應元件 (GRE) 結合，并調節相關基因的轉錄，包括絲裂原活化激酶磷酸酶 (MKP-1)。MKP-1 是一種磷酸酶，可選擇性地滅活磷酸化 p38 絲裂原活化激酶 (p-p38 MAPK)，從而抑制促炎細胞因子的產生[18]。據報道，在SRA患者中，IL-2和IL-4氣道表達增強，IL-2和IL-4可誘導p-p38 MAPK。活躍的p38 MAPK造成過度 GR 絲氨酸 226 磷酸化，從而破壞GR的核易位和DNA結合，降低GR的活性，從而導致相對糖皮質激素抵抗[19]。此外，先前的研究表明，使用p-p38 MAPK 抑制劑，抑制p38 MAPK 通路激活可顯著增強地塞米松 (DEX) 誘導的 SRA患者對 GC 的反應性。另一方面多項研究證實SRA的一種表型與中性粒細胞性炎癥有關，p38 MAPK可上調多種促炎細胞因子(如IL-8、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等)和趨化因子的表達， IL-8 是一種中性粒細胞趨化劑[20]。p38 還可通過上調肺血管內皮細胞細胞間粘附分子-1(ICAM-1)的表達，促進中性粒細胞釋放TNF-α[21]，引起中性粒細胞流入哮喘患者氣道，從而導致激素不敏感。最近的證據也支持p38 MAPK在嚴重哮喘患者SR中的關鍵作用。與激素敏感性哮喘相比，激素抵抗性哮喘患者外周血單個核細胞(PBMC)中p-p38 MAPK水平顯著升高，導致直接p38 MAPK下游激酶應激激活蛋白激酶-1(MSK1)的磷酸化水平也升高。

MSK1是一種直接位于 p38 下游的激酶，可介導不同炎癥基因啟動子絲氨酸上組蛋白H3的磷酸化, 導致局部染色質松弛，誘導炎癥基因轉錄。然而，糖皮質激素會抵消炎癥基因啟動子處激活的 MSK1 的募集，從而抑制 NF-κβp65反式激活和同時發生的組蛋白 H3 磷酸化。核因子 κB (NF-κB) 是參與免疫和炎癥反應的多種基因轉錄的關鍵調節因子之一。NF-κB 是一種二聚體，包含一個 p65 和一個 p50 亞基，其中前者具有反式激活功能。NF-κβp65在S276位點被MSK1磷酸化對炎癥基因表達的正常啟動至關重要。GR 和 MSK1 相互作用的一個例子是 MSK1 主要定位在細胞核中，然而，激活的 GR 可以將MSK1從細胞核轉移到細胞質中，從而抑制 MSK1 對其下游靶標的作用。有研究檢測到激活的 MSK1 的增加與 SRA外周血單核細胞(PBMC)中p-p38 的增加平行，表明 MSK1 可能參與調節細胞類固醇反應。Ling-bo Li等人[22]研究也發現，與SSA患者相比，在來自SRA患者的PBMC裂解物中檢測到顯著更高的p-p38 和p-MSK1 水平。而SRA患者的 PBMC 中的 ERK 和 JNK 磷酸化并不顯著或呈陰性，該數據表明p-p38和p-MSK1可作為預測類固醇抵抗性哮喘的生物標志物。

OX40L和TSLP

OX40 配體 (OX40L) 及其受體 OX40是腫瘤壞死因子受體超家族的成員[23]。OX40L主要表達于B淋巴細胞、樹突細胞、朗格漢斯細胞和巨噬細胞。OX40、OX40L在哮喘患者氣道固有層表達增加，促進幼稚T細胞極化，產生大量Th2細胞因子，如IL-4、IL-5、IL-13。這些細胞因子誘導 B 細胞 (IL-4)、嗜酸性粒細胞浸潤 (IL-5) 和杯狀細胞增生 (IL-13) 的 IgE 類別轉換。這些機制促使維持高IgE水平、炎癥細胞組織浸潤、嗜酸性粒細胞增多、粘液釋放和平滑肌收縮，導致嚴重過敏癥狀[24]。哮喘患者外周血單核細胞 (PBMCs) OX40 和 OX40L 蛋白水平顯著升高, 與 T 細胞增殖能力增強有關。氣道固有層和 PBMC 中升高的 OX40L 可以釋放到循環中，所以哮喘患者的血清 OX40L 升高。Su-li Ma等人研究[25]得出，哮喘患者的血清 OX40L 水平顯著高于健康對照組，而SRA的血清 OX40L 水平高于SSA。ICS治療降低了血清 OX40L 水平，SSA 中血清 OX40L 的降低比 SRA 更顯著。研究證實了血清 OX40L 是 SRA 的獨立風險預測因子。因此我們推測OX40L可能參與了糖皮質激素抵抗的發病機制。這些結果表明，血清OX40L可能是一種有用的無創便捷指標，可作為識別皮質類固醇耐藥哮喘患者的生物標志物。但其中存在一些問題，針對該指標的大部分的臨床研究為回顧性的，依賴于冷凍血清和醫療記錄。目前需要進行大量的前瞻性研究來進一步證實血清 OX40L在SRA患者中的臨床應用價值。

除此之外，在上述研究中，與 SSA 和對照組相比，SRA 患者的血清胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)水平顯著更高，并且與血清 OX40L 呈正相關。TSLP 是一種由受損上皮細胞產生的細胞因子，可刺激樹突細胞成熟并誘導 Th2 介導的炎癥[26]。OX40L 參與 TSLP 驅動的特應性炎癥和病理性 Th2 免疫反應。TSLP 可以激活樹突細胞(DCs)并促進 T 濾泡輔助細胞從幼稚 CD4+T 細胞分化，這取決于OX40L[27]。因此，形成了 TSLP-DC-OX40L 通路，通過增加炎癥細胞因子和減少 CD4+CD25+Treg 細胞來促進氣道炎癥和哮喘發病[28]。TSLP 可以誘導嗜酸性粒細胞趨化和延遲凋亡，表明其在過敏性炎癥中的潛在作用。除了嗜酸性粒細胞炎癥，TSLP還在中性粒細胞氣道炎癥中發揮作用[29]。最近的一份報告表明，TSLP 可能是哮喘皮質類固醇抵抗的重要因素。與健康對照相比，哮喘患者支氣管肺泡灌洗液 (BAL) 中的 TSLP 升高， TSLP 可消除地塞米松對 ILC2 細胞中 2 型細胞因子產生的抑制作用誘導類固醇抵抗[30]。此外，Kabata H.等人[31]的研究也發現TSLP 可通過控制 STAT5 磷酸化和 BCL-XL 表達，在自然輔助細胞(NH細胞)中發揮皮質類固醇抵抗作用。同時，鑒于TSLP還位于OX40L的上游，我們推測TSLP也可作為預測哮喘患者類固醇反應性的血清標志物。

展望和總結

哮喘是研究最多的類固醇難治性疾病。SRA患者通常有持續的氣道炎癥、長時間的高劑量 ICS 治療和不必要的副作用[32]。由于全球哮喘患病率的增加，SR 已成為一個具有挑戰性的健康問題，從而導致高成本的哮喘護理。因此，尋找敏感的無創性生物標志物來早期識別 SRA 患者對于提供有效的個性化治療和避免哮喘患者的相關副作用非常重要。本文總結了VDBP、miRNA-21、p-p38 MAPK和p-MSK1、OX40L和TSLP這些生物標志物作為哮喘患者ICS反應的預測因子，有助于決策和確定可能或不可能接受ICS治療的患者。它會減少無效治療，并使患者免受治療失敗的失望。

總之，雖然在一小部分哮喘患者中觀察到糖皮質激素抵抗，但它代表了一個嚴重的臨床和社會經濟問題。在其他炎癥性疾病(如慢性阻塞性肺疾病、類風濕性關節炎和炎癥性腸病)中同樣觀察到類似的不敏感，發生率更高。因此需要有早期識別和篩選不敏感性的生物標志物，這樣才能更好地研究哮喘中 GC 不敏感相關的多種機制可以為其他炎癥性疾病提供可轉移的知識。針對不同的機制盡早為類固醇反應不佳的患者找到有效的最佳治療方案。