新西蘭白兔嚴(yán)重凍傷模型實(shí)驗(yàn)觀察

付金鑫， 段 峰， 張金龍， 袁 冰， 張 恒， 閻潔羽， 管 陽(yáng)， 王 燕，袁 凱， 王茂強(qiáng)

凍傷是人體處于寒冷環(huán)境引起的局部或全身性損傷。目前研究?jī)鰝膭?dòng)物模型主要有大鼠和兔模型，建模方法包括液氮致凍法、乙醇浸泡冷凍法及模擬高原低氧復(fù)合冷凍法［1-3］。凍傷的病理生理學(xué)變化過(guò)程可分為相互重疊的預(yù)凍期、凍融期、血液淤滯期和缺血期［4］。凍傷組織損傷機(jī)制主要包括直接損傷和間接損傷［5］，前者指組織凍結(jié)直接引起細(xì)胞內(nèi)外液冰晶形成，冰晶破壞細(xì)胞膜造成細(xì)胞死亡，此外細(xì)胞外滲透壓增加導(dǎo)致細(xì)胞脫水，細(xì)胞內(nèi)代謝紊亂，后者指冷凍引起血管強(qiáng)烈收縮、血管內(nèi)皮細(xì)胞受損、基底膜通透性增加，血小板聚集、血栓形成、紅細(xì)胞外滲、組織水腫，此外內(nèi)皮細(xì)胞合成和分泌前列環(huán)素（prostacyclin，PGI2）功能受損。PGI2有抗血小板聚集及舒張血管作用，與血栓素A2（thromboxane A2，TXA2）拮抗處于動(dòng)態(tài)平衡中，但PGI2釋放減少加速血栓形成，氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡，類似于缺血-再灌注損傷。目前部分研究報(bào)道了新西蘭白兔嚴(yán)重凍傷模型的病理生理學(xué)變化，但缺乏影像學(xué)、病理學(xué)及PGI2-TXA2、氧化-抗氧化平衡狀態(tài)研究。本研究使用乙醇浸泡冷凍法建立新西蘭白兔嚴(yán)重凍傷模型并進(jìn)行大體、影像學(xué)、血液學(xué)及病理學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

取經(jīng)隔離檢疫合格的普通級(jí)新西蘭白兔（北京市維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司提供）12只，雌雄各半，12～15周齡，體質(zhì)量3.0～4.0 kg。采用單籠飼養(yǎng)，保持安靜環(huán)境，防止動(dòng)物驚嚇，每日喂食2次（上午9時(shí)，下午3時(shí)），顆粒飼料供應(yīng)量為130～150 g，并給予充足的纖維素供應(yīng)，飲水不限。本實(shí)驗(yàn)已獲解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格遵守動(dòng)物福利倫理3R原則。

1.2 兔嚴(yán)重凍傷模型建立及復(fù)溫

新西蘭白兔前足充分剃毛，在平第4指骨粗隆處劃一冷凍線，自冷凍線中點(diǎn)上方插入針狀熱電偶監(jiān)測(cè)第2、3跖趾關(guān)節(jié)交界處組織溫度，將左前肢端浸泡于-20℃95%乙醇中，凍傷至監(jiān)測(cè)組織溫度下降至-5℃后再繼續(xù)冷凍7 min即完成左前肢嚴(yán)重凍傷模型構(gòu)建。將嚴(yán)重凍傷模型受累肢端置于加有聚維酮碘的37～39℃恒溫循環(huán)水槽中復(fù)溫治療25～35 min，復(fù)溫終點(diǎn)為肢端變紅或肢端柔軟易彎折。

1.3 兔嚴(yán)重凍傷模型實(shí)驗(yàn)觀察

大體觀察：分別于凍傷前、凍傷后復(fù)溫前、復(fù)溫后即刻，和復(fù)溫后6 h、12 h、24 h、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d進(jìn)行受累肢端外觀觀察及拍照記錄，觀察記錄組織腫脹程度及顏色變化。

血管造影：分別于凍傷前、凍傷后復(fù)溫前、復(fù)溫后即刻，和復(fù)溫后6 h、12 h、24 h、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d進(jìn)行患肢動(dòng)脈造影：經(jīng)耳緣靜脈按0.1 mL/kg劑量注射速眠新進(jìn)行麻醉（麻醉前12 h禁食水），兔仰臥位固定于自制小木板上，剔除右后肢內(nèi)側(cè)和腹股溝區(qū)兔毛，常規(guī)消毒、鋪巾，沿右股動(dòng)脈鞘區(qū)切開(kāi)皮膚2～3 cm，分離皮下組織，暴露并剪開(kāi)股動(dòng)脈鞘，分離出長(zhǎng)1.5～2 cm股動(dòng)脈，遠(yuǎn)端用絲線結(jié)扎，近端穿絲線并將其稍提緊使股動(dòng)脈血流暫時(shí)阻斷；用眼科鑷夾起股動(dòng)脈壁外側(cè)，眼科剪在股動(dòng)脈壁內(nèi)側(cè)剪一小口，將引導(dǎo)導(dǎo)絲沿破口插入股動(dòng)脈，順導(dǎo)絲置入4 F動(dòng)脈鞘，緩慢推入股動(dòng)脈內(nèi)約2 cm；用絲線將動(dòng)脈鞘固定于股動(dòng)脈，拔出導(dǎo)絲及動(dòng)脈鞘內(nèi)套管，將剪短的4 F導(dǎo)管置入動(dòng)脈鞘內(nèi)，導(dǎo)入2.2 F微導(dǎo)管；DSA導(dǎo)引將微導(dǎo)管頭端超選擇插管至肱動(dòng)脈遠(yuǎn)端，使用彈力繃帶于股動(dòng)脈處固定動(dòng)脈鞘及微導(dǎo)管，防止撕咬及導(dǎo)管移位；經(jīng)動(dòng)脈推注小劑量硝酸甘油，注入對(duì)比劑（速率0.5～1 mL/s，注射壓力200 psi，總量1.5～3 mL）。造影術(shù)后連續(xù)5 d肌內(nèi)注射青霉素80萬(wàn)U。

血常規(guī)、生化、凝血及纖溶活性指標(biāo)檢測(cè)：于凍傷前、復(fù)溫后即刻，和復(fù)溫后6 h、12 h、24 h、2 d、3 d經(jīng)耳緣靜脈抽取靜脈血3 mL，離心分離血漿（3 000 r/min，15 min），保存于-80℃冰箱，采用全自動(dòng)分析儀檢測(cè)白細(xì)胞（WBC）、紅細(xì)胞（RBC）、血紅蛋白（HGB）、紅細(xì)胞比容（HCT）、血小板（PLT）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、血尿素氮（BUN）、血清肌酐（SCr）、凝血酶原時(shí)間（PT）、活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）、纖維蛋白原（FIB）。

血漿血栓素B2（TXB2）和6-酮-前列腺素F1α（6-keto-PGF1α）檢測(cè)：于凍傷前、復(fù)溫后即刻、6 h、12 h、24 h、2 d、3 d經(jīng)耳緣靜脈抽取靜脈血1.5 mL，顛倒混勻，分離血漿（4℃，3 500 r/min，15 min），保存于-80℃冰箱，采用TXB2及6-keto-PGF1α放射免疫分析藥盒（北京普爾偉業(yè)生物科技公司）進(jìn)行檢測(cè)。

血漿丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）檢測(cè)：于凍傷前、復(fù)溫后即刻，和復(fù)溫后6 h、12 h、24 h、2 d、3 d經(jīng)耳緣靜脈抽取靜脈血1.5 mL，離心分離血漿（3 000 r/min，15 min），保存于-80℃冰箱。血漿MDA含量通過(guò)TBA比色法測(cè)定，血漿SOD含量使用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定。

常規(guī)組織病理學(xué)檢查：取材時(shí)點(diǎn)為凍傷前、凍傷后即刻、復(fù)溫后即刻，和復(fù)溫后6 h、12 h、24 h、2 d、3 d、4 d、5 d，切取待檢測(cè)組織放入4%甲醛固定48 h以上，組織樣本取材厚3 mm，梯度乙醇脫水70%、80%、95%、100%各30 min，二甲苯2瓶各20 min，石蠟浸蠟兩缸各12 min，包埋，切片4 μm，烤片；二甲苯3瓶脫蠟，每瓶8 min，100%乙醇2瓶，每瓶8 min，90%、80%、60%乙醇每瓶各8 min；蘇木精-伊紅（HE）染色4 min，鹽酸乙醇分化2～3 s，0.5%氨水20 s，上鏡觀察，0.5% HE染色1 min，80%、90%乙醇各分化3～5 s，95%乙醇5 min，100%乙醇3瓶，每瓶5 min，二甲苯2瓶，每瓶5 min；中性樹脂膠封片；顯微鏡觀察并圖像采集分析。

自然預(yù)后截肢率統(tǒng)計(jì)：采用趾端截肢率和得分法統(tǒng)計(jì)計(jì)算模型的自然預(yù)后截肢率，趾端截肢率＝趾肢指端數(shù)/受累趾端數(shù)，得分法即人為定義各趾端及關(guān)節(jié)平面分?jǐn)?shù)，根據(jù)截趾范圍得出最終截趾分?jǐn)?shù)，最終截趾分?jǐn)?shù)＝A、B、C、D四縱向趾端截肢平面的分?jǐn)?shù)總和［6］。趾端及關(guān)節(jié)平面截趾分?jǐn)?shù)定義圖示見(jiàn)圖1。

圖1 趾端及關(guān)節(jié)平面截趾分?jǐn)?shù)定義圖示

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大體觀察及血管造影

新西蘭白兔嚴(yán)重凍傷模型左前肢在實(shí)驗(yàn)各時(shí)間點(diǎn)的大體觀察及血管造影變化情況，見(jiàn)圖2。

圖2 兔嚴(yán)重凍傷模型左前肢大體觀察及血管造影變化

2.2 血液學(xué)檢測(cè)

兔嚴(yán)重凍傷模型在實(shí)驗(yàn)各時(shí)間點(diǎn)的血液學(xué)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。WBC水平在復(fù)溫后即刻～3 d持續(xù)升高，6 h、12 h、24 h、2 d、3 d時(shí)較凍傷前基線顯著升高（P＜0.05）；RBC、HGB、HCT變化趨勢(shì)基本保持一致，復(fù)溫后即刻始升高，12 h達(dá)高峰，RBC水平于復(fù)溫后12 h明顯高于基線水平（P＜0.05），HGB、HCT水平于6 h、12 h明顯高于基線水平（P＜0.05），24 h恢復(fù)基線水平，2 d、3 d下降，RBC水平于3 d明顯低于基線水平（P＜0.05），HGB、HCT水平于2 d、3 d明顯低于基線水平（P＜0.05）；PLT水平于復(fù)溫后即刻～2 d下降，24 h達(dá)低谷，6 h、12 h、24 h、2 d明顯低于基線水平（P＜0.05），3 d恢復(fù)升高。復(fù)溫后即刻、6 h、12 h、24 h、2 d、3 d血 清ALT、AST、BUN、SCR值較基線值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。復(fù)溫后即刻～3 d PT水平持續(xù)下降，2 d、3 d較基線顯著降低（P＜0.05）；APTT水平于6 h～3 d持續(xù)降低，24 h、2 d、3 d較基線顯著下降（P＜0.05）；FIB水平于復(fù)溫后即刻～3 d持續(xù)升高，12 h、24 h、2 d、3 d較基線顯著升高（P＜0.05）。復(fù)溫后即刻～12 h血漿6-keto-PGF1α水平持續(xù)升高，12 h達(dá)高峰，復(fù)溫后即刻、6 h、12 h、24 h較基線顯著升高（P＜0.05），24 h～3 d開(kāi)始下降，2 d、3 d較基線顯著下降（P＜0.05）；復(fù)溫后即刻～3 d血漿TXB2水平持續(xù)升高，復(fù)溫后即刻、6 h、12 h、24 h、2 d、3 d較基線顯著升高（P＜0.05）。復(fù)溫后即刻～3 d血漿MDA水平持續(xù)升高，6 h、12 h、24 h、2 d、3 d較基線顯著升高（P＜0.05）；復(fù)溫后即刻～24 h血漿SOD水平持續(xù)升高，24 h達(dá)高峰，6 h、12 h、24 h較基線顯著升高（P＜0.05），2 d、3 d開(kāi)始下降，較基線顯著下降（P＜0.05）。

表1 兔嚴(yán)重凍傷模型凍傷前后血液學(xué)檢測(cè)結(jié)果 （±s）

表1 兔嚴(yán)重凍傷模型凍傷前后血液學(xué)檢測(cè)結(jié)果 （±s）

*與凍傷前相比，P＜0.05

?

2.3 組織病理學(xué)檢查

兔嚴(yán)重凍傷模型凍傷前后左前肢血管病理學(xué)變化過(guò)程見(jiàn)圖3。

圖3 兔嚴(yán)重凍傷模型凍傷前后左前肢血管病理學(xué)變化過(guò)程

2.4 截肢率

兔嚴(yán)重凍傷模型受累趾端160個(gè)，最終截趾132個(gè)，截趾率為82.5%，得分法結(jié)果為（20.6±3.8）分。

3 討論

本研究采用乙醇浸泡冷凍法建立新西蘭白兔嚴(yán)重凍傷模型，通過(guò)觀察建模前后左前肢大體及血管造影變化發(fā)現(xiàn)，凍傷后微循環(huán)變化可大致分為兩個(gè)階段：血管開(kāi)通階段（復(fù)溫后即刻～12 h）和血管閉塞階段（復(fù)溫后12 h至截肢）。在血管開(kāi)通階段，凍傷后肢端皮膚蒼白，肢端血管閉塞，復(fù)溫后即刻～12 h皮膚顏色由紫藍(lán)色轉(zhuǎn)為粉紅色，腫脹程度加重，肢端血流逐漸恢復(fù)；血管閉塞階段，受累肢端皮膚顏色由粉紅色轉(zhuǎn)變?yōu)樽纤{(lán)色至最后變?yōu)楹谏?，腫脹程度減輕至干癟，肢端血管逐漸閉塞，血流逐漸消失，皮膚顏色紫藍(lán)及暗黑區(qū)域可大致對(duì)應(yīng)血管閉塞區(qū)。既往研究發(fā)現(xiàn)，冷凍傷后微循環(huán)變化過(guò)程：血流停滯、再通、再次惡化，最終結(jié)局為無(wú)復(fù)流或好轉(zhuǎn)［7-8］。本研究結(jié)果提示，嚴(yán)重凍傷后血流變化規(guī)律與上述研究基本一致，初步發(fā)現(xiàn)皮膚顏色與血管閉塞的大致對(duì)應(yīng)關(guān)系。

本研究觀察到，兔嚴(yán)重凍傷模型復(fù)溫后即刻～3 d WBC水平持續(xù)升高，復(fù)溫后RBC、HGB、HCT變化趨勢(shì)基本保持一致，RBC、HGB、HCT水平于復(fù)溫后即刻始升高，12 h達(dá)到高峰，24 h恢復(fù)凍傷前基線水平，2 d、3 d下降；PLT水平于復(fù)溫后即刻～2 d持續(xù)下降，24 h到達(dá)低谷，3 d恢復(fù)升高。劉志洲等［9］報(bào)道，嚴(yán)重凍傷后WBC、RBC、HGB、HCT變化趨勢(shì)基本保持一致，認(rèn)為WBC持續(xù)升高主要由寒冷刺激作用及后期無(wú)菌性炎癥引起，RBC先期增加主要由于先期組織缺氧引起的代償性增加，后期由于血液稀釋及機(jī)械性溶血導(dǎo)致病理性減少，PLT前期由于血栓形成大量消耗而減少，后期由于機(jī)體代償性增加。

有研究通過(guò)凍傷大鼠凝血系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，APTT、PT于凍傷后縮短，F(xiàn)IB升高［10］。本研究中APTT、PT水平于復(fù)溫后持續(xù)下降，F(xiàn)IB水平于復(fù)溫后即刻～3 d持續(xù)升高。凍傷后機(jī)體凝血系統(tǒng)發(fā)生紊亂，機(jī)體處于高凝狀態(tài)，F(xiàn)IB復(fù)溫后持續(xù)升高表明血栓形成。

嚴(yán)重冷凍傷可導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷，血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)功能之一是合成及釋放具有強(qiáng)烈抑制PLT聚集及擴(kuò)血管作用的PGI2［11-12］。6-keto-PGF1α是PGI2代謝產(chǎn)物，因此血漿6-keto-PGF1α含量變化可反映PGI2變化。本研究中觀察到兔嚴(yán)重凍傷模型血漿6-keto-PGF1α水平于復(fù)溫后即刻～12 h持續(xù)升高，12 h達(dá)高峰，24 h～3 d開(kāi)始下降。TXA2是一種由PLT合成及釋放的具有強(qiáng)烈PLT聚集及縮血管作用的生物活性物質(zhì)，TXB2是其代謝產(chǎn)物。本研究中觀察到血漿TXB2水平于復(fù)溫后即刻～3 d持續(xù)升高。Lorentzen等［12］研究中也出現(xiàn)類似的凍傷后血漿6-keto-PGF1α和TXB2水平變化趨勢(shì)，認(rèn)為前期血漿6-keto-PGF1α水平升高是由于內(nèi)皮細(xì)胞受損、細(xì)胞膜破裂、大量PGI2釋放入血引起，后期由于內(nèi)皮細(xì)胞壞死合成PGI2能力下降，因此導(dǎo)致后期血漿6-keto-PGF1α水平大幅度下降；血漿TXB2水平于復(fù)溫后持續(xù)升高可能是由于凍傷后血管內(nèi)皮損傷引起PLT黏附、聚集，PLT進(jìn)一步釋放促進(jìn)凝血的生物活性物質(zhì)，進(jìn)而促進(jìn)血栓形成。

機(jī)體在正常情況下存在氧化與抗氧平衡系統(tǒng)，但本研究發(fā)現(xiàn)兔嚴(yán)重凍傷模型血漿反映脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的MDA水平于復(fù)溫后即刻～3 d持續(xù)升高，血漿清除氧自由基的SOD水平于復(fù)溫后即刻～24 h持續(xù)升高，24 h達(dá)高峰，復(fù)溫后2 d、3 d較基線顯著下降。這表明凍傷后氧化-抗氧化平衡系統(tǒng)被打破，氧化過(guò)程增強(qiáng)，抗氧化能力減弱，因此加重凍傷損害；血漿SOD水平先升高后下降可能是由于前期血漿MDA增加引起的代償性增加，后期過(guò)氧化物大量堆積超過(guò)機(jī)體代償能力，SOD又被大量消耗，進(jìn)而出現(xiàn)SOD大幅下降至凍傷前。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，新西蘭白兔嚴(yán)重凍傷模型左前肢血管于復(fù)溫后即刻～24 h大量擴(kuò)張淤血或充血，未見(jiàn)明顯血栓，復(fù)溫后2～5 d可見(jiàn)混合血栓，這與血管造影結(jié)果對(duì)應(yīng)一致，進(jìn)一步證明嚴(yán)重凍傷復(fù)溫后受累肢端血流停滯-再通-再次惡化-最終無(wú)復(fù)流或好轉(zhuǎn)的變化過(guò)程。