烏飯樹樹葉藍黑色素對大米蛋白理化性質的影響

趙佳佳 王 夢 李 言 錢海峰 樊銘聰 王 立

烏飯樹是一種歷史悠久的藥用植物資源，是天然的植物色素來源。中國烏飯樹資源蘊藏量豐富，東部沿海地區居民利用其樹葉汁將大米著色蒸煮制成藍黑色的烏米飯，食用習俗已流傳千年[1]。在烏米飯食用地區調研發現，常食用烏米飯可顯著改善2型糖尿病患者血糖水平，與精制大米相比，其表面的藍黑色素對外觀特征和營養特性起著重要作用[2]。

烏飯樹樹葉中含有多種活性成分，目前已發現超過200種化合物，主要成分是類黃酮、酚酸和環烯醚萜類化合物[3]。中國有很多學者對烏米飯表面的色素成分進行了相關研究，對烏飯樹樹葉進行浸提純化等操作，并將制得的黑色濃縮物統稱為“黑色素”。顧文秀等[4]、胡志杰等[5]、王立等[6]分別利用超聲波法、復合酶法輔助提高了色素的得率，最高可達到3.3%。同時，研究者[7-8]通過分析烏飯樹樹葉和果實中色素的化學組成，推測其中的色素成分可能是花色苷等黃酮類物質。但是在烏米飯染色過程中，經烏飯樹樹葉提取物浸泡的米粒表面呈現藍黑色。課題組[9]前期針對該藍黑色物質研究后發現，烏飯樹樹葉中環烯醚萜苷類物質可以作為前體物質經水解、聚合后生成有色物質，環烯醚萜苷元與蛋白質的—NH2殘基發生共價反應轉化為以碳—氮鍵為主要特征骨架的吡啶類雜環有色化合物。烏米飯表面藍黑色素的著色穩定性較強，染色完成后色素不易直接提取分離，推測在染色過程中色素與大米組分發生了較強的結合作用。然而，基于該呈色反應機理利用呈色前體物質與游離氨基酸反應制備藍黑色素的方法可以克服傳統染色方法提取難度的缺陷，為藍黑色素與大米組分相互作用的表征奠定了基礎[10]。因此，研究擬以烏飯樹樹葉為原料分離呈色前體物并制備藍黑色素，研究其與大米蛋白組分的結合作用，探討藍黑色素對大米蛋白理化性質的影響，以期為促進烏飯樹天然色素的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與設備

烏飯樹樹葉：采自江蘇溧陽；

大米蛋白(蛋白含量80%，以干基計)：西安天之露生物科技有限公司；

β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)：100 U/mg，上海百靈威公司；

無水乙醇、乙酸、氫氧化鈉等試劑：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

冷凍干燥機：FreeZone-6型，美國Labconco公司；

手持色差計：CR-410型，日本柯尼卡美能達公司；

紫外可見分光光度計：T9雙光束型，北京普析通用儀器有限責任公司；

全自動圓二色光譜儀：Chirascan V100型，英國Applied Photophysics公司；

分散乳化機：ULTRA-TURRAX型，德國IKA公司；

熒光分光光度計：日立F-7000型，日本Hitachi公司；

恒溫水浴鍋：HWS-24型，上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 烏飯樹樹葉藍黑色素的制備 按Fan等[11]的方法，將烏飯樹樹葉洗凈后，按料水比1∶5 (g/mL)破碎勻漿10 min，紗布過濾出雜質后離心15 min (4 ℃，8 000 r/min)，將上清液濃縮后真空冷凍干燥，得到棕黃色的烏飯樹樹葉水提物粉末，取適量粉末分散于去離子水中至質量濃度2 mg/mL，添加β-葡萄糖苷酶使其質量濃度為8 μg/mL，在37 ℃下恒溫水解1～2 h，在水解液中加入0.1 g/100 mL甘氨酸[10]，50 ℃恒溫水浴3 h，至溶液顏色呈藍黑色，過濾沉淀后真空旋轉蒸發濃縮后冷凍干燥，初步得到粗制藍黑色素粉末。采用葡聚糖凝膠Sephadex G-15進行柱層析(層析柱長度25 cm，直徑4.0 cm)，以質量濃度為2 mg/mL的粗制藍黑色素溶液上樣，利用去離子水洗脫，收集每個洗脫級分(1～2個柱體積為一個級分)。藍黑色素的吡啶雜環結構在585 nm處有特征吸收峰，因此將在585 nm處有吸收峰的洗脫液合并為純化的藍黑色素溶液。最后，將溶液在55 ℃條件下進行真空旋轉蒸發濃縮后繼續冷凍干燥，得到藍色絮狀色素粉末。

1.2.2 色素—大米蛋白復合物的制作 稱取5 g大米蛋白溶解于50 mL去離子水中，分別制備不同烏飯樹樹葉藍黑色素添加量的蛋白溶液，分別加入0，75，150，250，350，450 mg的藍黑色素后在60 ℃下攪拌30 min，在50 ℃ 條件下進行真空旋轉蒸發濃縮后繼續冷凍干燥，得到藍黑色素添加量分別為0.0，1.5，3.0，5.0，7.0，9.0 g/100 g的蛋白樣品，4 ℃下保存備用。

1.2.3 色度 利用柯尼卡美能達(CR-410)手持色差計對染色前后大米蛋白的色度進行測定，數據結果用L*、a*和b*表示。其中白色L*值的大小代表顏色由黑到白的程度(L*值=100為白色，L*值=0為黑色)，紅綠色度a*值代表顏色由綠到紅的程度(正值為紅，負值為綠)，黃藍色度b*的大小代表顏色由黃到藍的程度(正值為黃，負值為藍)。

1.2.4 溶解性 取100 mg大米蛋白樣品溶于10 mL去離子水中，用0.1 mol/L的氫氧化鈉或鹽酸溶液調節pH至2.0～12.0，室溫下磁力攪拌1 h后，5 000 r/min離心20 min，取上清液測定其中蛋白質含量，按式(1)計算蛋白樣品的溶解性。

(1)

式中：

C——溶解率，%；

m1——上清液中蛋白含量，g；

m2——原料中總蛋白含量，g。

1.2.5 吸水性 取1 g大米蛋白樣品溶于10 mL去離子水中，振蕩搖勻2 min以保證蛋白樣品充分分散，在室溫下靜置30 min左右，5 000 r/min離心20 min，棄去上清液，將沉淀稱重，按式(2)計算蛋白樣品的吸水性。

(2)

式中：

W——吸水性，%；

m1——沉淀物質量，g；

m2——蛋白質質量，g。

1.2.6 持油性 取1.0 g蛋白與10 mL大豆油均勻混合，室溫下靜置30 min，5 000 r/min離心20 min，將上層大豆油移入干燥的10 mL量筒中，記錄體積，按式(3)計算蛋白樣品的持油性。

(3)

式中：

O——持油性，%；

v——最終體積，mL；

m——蛋白質質量，g。

1.2.7 二級結構相對含量 利用圓二色光譜(CD)測定染色前后大米蛋白的二級結構[12]。配制質量濃度為0.4 mg/mL 的大米蛋白溶液，用Chirascan V100圓二色光譜儀在室溫下檢測圓二色譜，石英比色皿的光線路徑長度為0.1 cm，掃描范圍190～260 nm，光譜帶寬1.0 nm，掃描速度為100 nm/min，以去離子水的圓二色光譜圖作為基線校正，每組樣品平行掃描3次得到CD譜圖，然后將光譜數據導入CD-Pro軟件計算出每組蛋白樣品中二級結構(α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規則卷曲)的相對含量。

1.2.8 起泡性和起泡穩定性 取0.5 g蛋白溶于50 mL去離子水中，磁力攪拌30 min后均質2 min，轉入100 mL量筒分別測量均質后0 min和30 min泡沫體積，分別按式(4)和式(5)計算蛋白樣品的起泡性和起泡穩定性。

(4)

(5)

式中：

F——起泡性，%；

v0——0 min時的泡沫體積，mL；

FS——起泡穩定性，%；

v30——30 min時的泡沫體積，mL。

1.2.9 乳化性和乳化穩定性 取8 mL的大豆油與24 mL 0.1% 的蛋白溶液混合，10 000 r/min均質1 min，形成均勻乳液。在試管中加入5 mL濃度為0.1%的SDS溶液，分別移取50 μL均質后0 min和10 min的乳液，測定其在500 nm處的吸光度，分別按式(6)和式(7)計算蛋白樣品的乳化性和乳化穩定性。

(6)

(7)

式中：

E——乳化性，m2/g；

t——時間，min；

A0——0 min時的吸光度；

r——稀釋倍數；

c——質量濃度，mg/mL；

v——油相體積，mL；

ES——乳化穩定性，min；

A10——10 min時的吸光度。

1.3 數據分析

使用SPSS 22.0(美國SPSS公司)的單因素方差分析(ANOVA)進行分析，以P<0.05來表示樣品平均值之間的顯著性差異。數據以平均數±標準差的形式表示。

2 結果與分析

2.1 藍黑色素對大米蛋白色度的影響

由表1可知，大米蛋白呈淡黃色，隨著色素質量分數的升高，色素—蛋白復合物的L*和b*值顯著降低，平均值分別從87.11，22.70下降到了70.03，7.85(P<0.05)，a*值略微降低，由正值變為負值。色度值的變化表明在染色過程中色素—蛋白復合物樣品的白度降低，并由偏黃轉為偏藍，二元復合體系的亮度變暗，色調向藍黑色轉變。

2.2 藍黑色素對大米蛋白結構性質的影響

2.2.1 溶解度 從圖1可以看出，隨著色素質量分數升高，色素—蛋白復合體系的溶解度先下降后緩慢上升。這可能是藍黑色素的主要成分是偏酸性的環烯醚萜類衍生物質，而大米蛋白的等電點在pH 4.0左右，且蛋白質在等電點處的溶解度最低，越偏離等電點溶解度越高[13]。因此，加入色素后的色素—蛋白復合物的分散液pH較純大米蛋白分散液更接近等電點，導致藍黑色素染色后的大米蛋白溶解度降低。在繼續升高藍黑色素的質量分數后，二元復合體系的溶解度又有所上升。這是因為在低pH值下，環烯醚萜類物質的親水基團能與水分子之間形成氫鍵，使得二元體系溶解度升高[14]。

表1 烏飯樹樹葉藍黑色素質量分數對大米蛋白色澤的影響?Table 1 Effects of concentration of VBLT dark blue pigment on color of rice protein (n=3)

圖1 烏飯樹樹葉藍黑色素對大米蛋白溶解度的影響Figure 1 Effects of concentration of VBLT dark blue pigment on solubility of rice protein

2.2.2 吸水性 圖2為大米蛋白的持水性隨色素質量分數的變化趨勢。由圖2可知，隨著色素質量分數升高，色素—蛋白復合體系的持水性先上升后下降。推測原因是：加入藍黑色素使二元復合體系內親水基團含量升高，導致色素—蛋白復合物持水性升高。而隨著色素質量分數持續增大，由于環烯醚萜類衍生物偏酸性，使色素—蛋白復合體系的pH偏離等電點時，蛋白所帶電荷減少，與水分子間作用力較弱，持水性降低[15]。與此同時，色素—蛋白復合體系的溶解度升高，導致持水性降低[16]。

2.2.3 持油性 圖3為大米蛋白的持油性隨色素質量分數的變化趨勢。由圖3可知，隨著色素質量分數升高，色素—蛋白復合體系的持油性持續下降。推測原因可能是：藍黑色素中的疏水鍵與大米蛋白表面的疏水鍵通過非共價作用結合，使得大米蛋白結構中原有的疏水鍵減少，降低了大米蛋白的持油性，同時加入色素使二元復合體系的親水基團數量增加，進一步降低了色素—蛋白復合物的持油性[17]。

2.2.4 二級結構 表2為不同質量分數烏飯樹樹葉藍黑色素染色前后色素—蛋白復合物的二級結構變化。由表2 可知，隨著烏飯樹樹葉色素質量分數的升高，二元復合體系中α-螺旋和β-折疊的含量顯著下降，β-轉角和無規則卷曲的含量有所上升，其中α-螺旋下降了14.1%，β-折疊下降了9.5%，而β-轉角和無規則卷曲的含量則分別增加了10.5%和13.3%(P<0.05)。推測出現這種情況的原因在于色素中含有大量的環烯醚萜類衍生物質，這些化合物有較多的極性基團[18]。而大米蛋白內部α-螺旋、β-折疊中存在大量氫鍵，與色素結合后大米蛋白內部的極性基團與色素中極性基團結合并形成氫鍵，對維持大米蛋白中α-螺旋和β-折疊結構的氫鍵造成破壞，致使其轉變成無規則卷曲的結構[19]。

圖2 烏飯樹樹葉藍黑色素對大米蛋白持水性的影響Figure 2 Effects of concentration of VBLT dark blue pigment on water-holding capacity of rice protein

圖3 烏飯樹樹葉藍黑色素對大米蛋白持油性的影響Figure 3 Effects of concentration of VBLT dark blue pigment on oil-holding capacity of rice protein

表2 大米蛋白與烏飯樹樹葉藍黑色素復合物二級結構的變化情況?Table 2 Changes on secondary structures of rice protein complex with different concentrations of VBTL dark blue pigment (n=3) %

2.3 藍黑色素對大米蛋白乳化性質的影響

2.3.1 起泡性和起泡穩定性 由圖4可知，隨著藍黑色素質量分數升高，大米蛋白起泡性先下降再上升。而大米蛋白的起泡穩定性的趨勢相反，隨著色素質量分數升高，起泡穩定性先上升后下降。在加入藍黑色素后，色素—蛋白復合體系的pH先偏向蛋白質等電點，蛋白質的溶解度降低，不利于界面上蛋白質分子之間的相互作用和形成黏稠的膜，導致了色素—蛋白復合物起泡性的降低。而隨著色素質量分數升高，二元復合體系中親水基團的含量升高，色素—蛋白復合物的溶解度上升，溶液的表面張力減少，對泡沫的形成比較有利。且色素—蛋白復合物的極性更強，更易與水分子相互作用形成氫鍵，促使了蛋白質擴散到空氣—水界面并展開，有助于產生更多的氣泡[20]。

而隨著色素質量分數升高，大米蛋白的起泡穩定性先上升后下降。這是因為加入烏飯樹樹葉藍黑色素后，色素—蛋白復合體系的pH首先偏向等電點，蛋白所帶電荷減少，界面與蛋白質分子之間的排斥力減少，有助于維持泡沫的穩定。但是繼續加入色素會提高蛋白質的溶解度，促進蛋白質分子與水分子相互作用，同時產生更多的氣泡，導致蛋白質膜強度和溶液黏度降低，最終影響色素—蛋白復合體系的起泡穩定性[21]。

2.3.2 乳化性及乳化穩定性 從圖5可以看出，隨著色素質量分數升高，色素—蛋白復合體的乳化性和乳化穩定性均呈先下降再上升的趨勢。結合前面2.3.1的分析結果推測：加入藍黑色素后，色素—蛋白復合體系的pH偏向等電點，蛋白所帶電荷減少，分子之間的靜電斥力減小，因此乳化性下降。而隨著色素質量分數繼續增大，大米蛋白的溶解度提高，此時界面排斥力減小，有利于蛋白質分子擴散并吸附在油/水界面上，并最終使色素—蛋白質二元體系的乳化性上升。

圖4 烏飯樹樹葉藍黑色素對大米蛋白起泡性和起泡穩定性的影響Figure 4 Effects of concentration of VBLT dark blue pigment on foaming capacity and foam stability of rice protein

圖5 烏飯樹樹葉藍黑色素對大米蛋白乳化性和乳化穩定性的影響Figure 5 Effects of concentration of VBLT dark blue pigment on emulsifying capacity and emulsion stability of rice protein

色素—蛋白二元復合體系的乳化穩定性的趨勢與乳化性相似，加入藍黑色素后，色素—蛋白復合體系的乳化穩定性有所上升。蛋白質分子在乳化體系中的穩定性取決于界面膜的穩定性，而蛋白的溶解度能顯著影響界面膜的形成[22]。加入色素后的二元復合體系的親水性增強，溶解度增大，有助于界面膜流變性質的改善，從而改善了乳化穩定性。

3 結論

通過研究烏飯樹樹葉藍黑色素對大米蛋白色度、結構特性和乳化特性的影響，發現烏米飯染色過程中藍黑色素與大米蛋白會發生非共價結合，造成二級結構中的α-螺旋和β-折疊含量降低、β-轉角和無規卷曲含量增加，使大米蛋白結構發生伸展、變性，內部氫鍵遭到破壞迫使其向無規卷曲變化，因此，色素—蛋白二元復合體系的乳化性質得到改善。隨著色素質量分數的增加，色素—蛋白二元復合體系的持水性、起泡穩定性隨色素質量分數升高呈先升高后下降趨勢，起泡性、乳化性和乳化穩定性隨色素質量分數升高呈先下降后升高趨勢。后續將繼續探討藍黑色素在染色過程中與大米蛋白的結合規律及其在加工食用過程中的變化規律。