柴胡三參膠囊通過調控PI3K/Akt 和p38MAPK通路抑制阿霉素誘導的心臟毒性

譚 彩，曹 蛟，張杼惠，劉建和*

（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208）

近年來，隨著抗腫瘤治療新型化療藥、靶向藥、免疫藥物[1]等治療方法的不斷改進，腫瘤患者生存期延長，帶瘤生存者越來越多，但抗腫瘤治療導致急性或長期的心血管毒性成為影響患者生存的一個主要因素[2]，加上近些年來人口老齡化趨勢越來越明顯，因此抗腫瘤治療導致的心血管毒性問題越發凸顯，其中以蒽環類化療藥物引起的心臟毒性為甚。研究表明，阿霉素誘導DNA 損傷，抑制DNA 和蛋白質合成，促進肌纖維變性，抑制特定基因的轉錄，并通過Caspase 3 依賴性機制導致心肌細胞凋亡[3]。 心力衰竭時心肌細胞主要以凋亡細胞死亡的形式丟失，導致心臟收縮功能惡化和左心室重構。Akt 的激活可能通過抑制細胞凋亡[4]從而保護心功能，而p38 絲裂原激活的蛋白激酶（p38MAPK）的抑制可以減弱細胞的炎癥反應。 柴胡三參膠囊是我院針對心律失常療效顯著的經驗方，由小柴胡湯化裁而來，前期研究證實其可緩解癥狀、減少急性發作次數，對心肌急性損傷具有保護作用[5-6]。 此外，其含藥血清在一定條件下能激活p38MAPK 信號通路[7]。 然而柴胡三參膠囊能否改善化療引起的心臟毒性尚不清楚。 故本實驗通過建立阿霉素誘導的新生大鼠心肌細胞損傷模型和小鼠心力衰竭模型，從磷脂酰肌醇3 激酶(PI3K)/Akt 和p38MAPK 通路入手，探討柴胡三參膠囊對阿霉素誘導的心臟毒性保護作用及可能的機制。

1 材料

1.1 實驗動物

1～3 日齡的SD 大鼠10 只，雌性3 只，雄性7只，體質量6～10 g；SPF 級健康C57BL/6 小鼠，60只，6～8 周齡，雄性，體質量20～25 g，采購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司；動物合格證批號：20170005050155。 飼養在（20±5） ℃的無病原體環境中，自由進食和飲水，喂養1 周。 本研究取得湖南中醫藥大學倫理委員會批準，編號ZYFY20210506。

1.2 藥物

阿霉素由索萊寶公司提供，批號D8740。柴胡三參膠囊由湖南中醫藥大學第一附屬醫院制劑中心提供，藥物組成：北柴胡、黃連、法半夏、丹參、苦參、青蒿、黨參、甘草，藥物劑量比例為15∶6∶10∶10∶10∶10∶15∶6，各藥物購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院，由湖南中醫藥大學第一附屬醫院劉紹貴教授鑒定均為正品，符合2015 年版《中華人民共和國藥典》規范。 制劑符合膠囊劑項下有關的各項規定（《中華人民共和國藥典》2015 年版四部通則0103）。

1.3 試劑

30%聚丙烯酰胺（上海生工生物工程有限公司，批號：CAS.9003-05-8）；二氧化碳細胞培養箱（賽默飛世爾科技公司，批號：BB150-2TCS）；DMEM-High glucose 基礎培養基（批號：JXS0101）；0.25%胰酶消化液(含EDTA)（批號：JXS0101）；青鏈霉素混合液（批號：JXS0201） 均購自蘇州君欣生物科技有限公司；HE染液（武漢塞維爾生物科技有限公司，批號：G1005）；水合氯醛（批號：30037517-250 g）；二甲苯（批號：10023418）國藥集團化學試劑有限公司；caspase 3、cleaved Caspase 3、p-p38MAPK、p-Akt、PI3K 抗 體（英國Abcam 公司，批號分別為ab184787、ab214430、ab178867、ab8805、ab32089）；Akt 蛋白（ABways，批號：CY5561）；TUNEL 凋亡檢測試劑盒（上海羅氏制藥有限公司，批號：43260100）；DHE 染色活性氧檢測試劑盒（北京索萊寶科技公司，批號：C01201）；血清肌酸激酶（creatine kinase, CK）檢測試劑盒、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase, LDH）檢測試劑盒、丙二醛（malondialdehyde, MDA）檢測試劑盒（北京索萊寶科技公司，批號分別為BC1140、BC0680、BC0025）；CCK-8 細胞活力檢測試劑盒（上海東寰生物科技有限公司，批號：C00901）。

1.4 儀器

熒光定量PCR 儀（上海力康生物醫療科技有限公司，型號：CG-05）；熒光顯微鏡（日本OCYMPUS公司，型號：CKX53）；酶標儀（芬蘭THERMO 公司，型號：117123001）；病理切片機（上海徠卡儀器有限公司，型號：RM2016）；超聲心動圖（加拿大：Fujifilm VisualSonics，型號：VEVO LAZR-X）；離心機（上海菲恰爾分析儀器有限公司，型號：SF-TGL-20R）；正置光學顯微鏡及成像系統（日本尼康公司，型號：Nikon Eclipse E100）；電子天平（深圳市無限量衡器有限公司，型號：FA1004）。

2 方法

2.1 大鼠心肌細胞的分離培養

用胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶聯合消化法從10 只1～3 日齡SD 大鼠分離出新生大鼠心室肌細胞(NRVM)[8]。 無菌條件下取SD 大鼠心尖部組織，使用預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3 次，將心肌組織剪成約1 mm3大小后移入離心管中，加入0.08%胰蛋白液進行反復吹打，動作輕柔，然后置于37 ℃水浴消化10 min，棄去上清液，再加入0.08%胰蛋白液和0.05%膠原酶，反復吹打后置于37 ℃水浴消化8 min，取上清液移入新離心管中，加入等體積含10%新生牛血清的DMEM 培養液終止消化，將混合液以1500 r/min 離心10 min 后棄去上清液，加入培養液混懸細胞沉淀，放置于37 ℃、5% CO2培養箱中進行細胞培養。

2.2 CCK-8 法測定最佳含藥濃度

將制備好的細胞懸液（10 000 個細胞/孔）接種到96 孔板中，每孔約100 μL 細胞懸液，分別加入含藥血漿5、10、20 μL，使終濃度分別為5%、10%、20%，每一濃度同時設3 個復孔；空白血漿對照組按上述操作加入無藥血漿。 隨后將培養板置于5%CO2，37 ℃環境中孵育48 h。 然后每孔加入10 μL CCK-8 溶液，培養板在培養箱內孵育2 h，用酶標儀測定在450 nm 處的吸光度（OD 值）。 以細胞數量為橫坐標（即X 軸），以吸光度為縱坐標（即Y 軸）制作曲線，并據此標準曲線測定細胞數量。采用心肌細胞生存率最高的血漿濃度作為干預度，心肌細胞存活率=[(實驗孔-空白孔)/(對照孔-空白孔)]×100%。由CCK-8 法檢測細胞活力，初步實驗結果顯示阿霉素(1 μmol/L)及5%含藥血漿濃度更適于后續實驗。

2.3 實驗分組、造模及給藥

細胞實驗：用不同濃度的阿霉素(0、0.1、0.5、1、3、5、10、20 和30 μmol/L)培養NRVM 24 h 后備用。柴胡三參膠囊溶解在PBS 中至10 mg/mL，然后用含有10%不同濃度FBS 的DMEM 培養基稀釋。 以相同體積的磷酸緩沖鹽溶液無胎牛血清DMEM 作為對照。再進一步將細胞分為對照（NT)組、阿霉素處理（Model）組、柴胡三參膠囊預處理后再用阿霉素處理(CHSSC)組。

動物實驗：將60 只SPF 級C57BL/6 小鼠按隨機數字表分為正常對照（NT）組、模型（Model）組、柴胡三參膠囊預處理(CHSSC)組，每組20 只。Model：單次腹腔注射溶解于生理鹽水的阿霉素(15 mg/kg)[9]，并口服等劑量生理鹽水。 CHSSC 組：給予柴胡三參膠囊（0.728 g/kg），給藥劑量參考徐叔云教授主編的《藥理實驗方法學》（第三版）[10]人鼠等劑量換算，以成人體質量60 kg 為標準獲得，灌胃體積為0.3 mL，灌胃3 d 后，腹腔注射與模型組組相同劑量的阿霉素后再予以柴胡三參膠囊3 d。 NT 組：等劑量生理鹽水灌胃。 造模時間1 周。

2.4 標本采集

末次給藥后次日，小鼠在氧氣中用10%水合氯醛輕度麻醉，直到心率穩定到400～500 次/min，超聲心動圖測量EF、LVIDS、LVIDd、ESV、EDV。 超聲心動圖測量完成后，收集血清，頸椎脫位安樂死小鼠，摘取心臟，快速于冰臺上取心臟。 一部分心臟組織置于4%多聚甲醛固定24 h，脫水、石蠟包埋；另一部分組織置于凍存管中，過液氮，-80 ℃冰箱保存備用。

2.5 指標檢測

2.5.1 CCK-8 法檢測細胞活力 在制備好的NRVM 細胞懸液96 孔板每孔中加入10 μL CCK-8 溶液，將培養板在培養箱內孵育2 h，用酶標儀測定細胞在450 nm 處的吸光度值。

2.5.2 超聲心動儀檢測小鼠心功能 用小動物超聲心動儀在小鼠乳頭肌水平進行二維定向M 型示蹤，測 量 和 計 算EF、LVIDS、LVIDd、LVESV、LVEDV,所有小鼠由一位專業超聲人員進行檢測，每項測量平均連續3 次心動周期。

2.5.3 試劑盒檢測氧化應激指標 各組心肌細胞經過相應處理后，6-磷酸葡萄糖脫氫酶法檢測CK 含量，硫代巴比妥酸法檢測MDA 含量，2,4-二硝基苯肼顯色法檢測LDH 含量，均嚴格按照試劑盒說明書進行操作，并通過分光光度計比色法進行檢測。

2.5.4 TUNEL 細胞凋亡檢測 將吸附細胞的載玻片在4%多聚甲醛中固定25 min；PBS 浸洗2 次，每次5 min；制備TUNEL 反應混合液；加入50 μL TUNEL 反應混合液，暗濕盒中反應37 ℃×1 h；PBS漂洗3 次；加入50 μL converter-POD，暗濕盒中反應37 ℃×30 min；PBS 漂洗3 次；加入50～100 μL DAB底物，反應（15～25） ℃×10 min；PBS 漂洗3 次；加1滴PBS 在視野下，用光學顯微鏡觀察凋亡細胞并拍照。

2.5.5 Western blot 法檢測c-Caspase 3、p-p38MAPK、p-PI3K、p-Akt 蛋白表達 稱取心肌組織50 mg，加入RIPA 裂解液，在冰上研磨離心，電泳、轉膜、3%BSA搖床1 h 封閉、一抗孵育（β-actin、1∶1000 稀釋）4 ℃搖床過夜，二抗孵育（兔抗、1∶8000 稀釋）室溫2 h、洗膜，進行蛋白免疫印跡分析，用ECL 化學發光試劑盒顯像，凝膠圖像系統分析各蛋白條帶灰度值，以目的蛋白/β－actin 表示目的蛋白的相對表達量。

2.6 統計學分析 應用SPSS 22.0 統計軟件進行分析，計量資料用“±s”表示。滿足正態分布者，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊者用最小顯著性差異法（LSD）檢驗，方差不齊者用Dunnet's T3 法檢驗；不符合正態分布者用秩和檢驗，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 小鼠一般狀況

喂養期間，NT 組小鼠活動正常，皮毛光滑柔順，進食及二便正常，無死亡。Model 組及CHSSC 組第4天開始小鼠活動減少，毛發不光澤或干枯，進食減少，各組皆無死亡。

3.2 細胞活力結果

Model 組用不同濃度的阿霉素（0、0.1、0.5、1、3、5、10、20 和30 μmol/L)培養NRVM 24 h 后，用CCK-8法測定細胞活力，顯示阿霉素以劑量依賴性方式降低NRVM 細胞活力，而用柴胡三參膠囊預處理的NRVM 組提高了阿霉素誘導的細胞活力(P＜0.01)。詳見表1 和圖1。

3.3 細胞凋亡結果

用不同濃度的阿霉素培養NRVM 24 h 后以TUNEL 法檢測細胞凋亡，顯示Model 組以阿霉素劑量依賴性方式觸發細胞凋亡，差異有明顯統計學意義(P＜0.01)，而用柴胡三參膠囊預處理后凋亡細胞數明顯減少(P＜0.01)。 詳見圖2。 在心肌組織檢測中同樣顯示與NT 組比較，Model 組細胞凋亡明顯增加(P＜0.01)；與Model 組比較，CHSSC 組細胞凋亡減輕(P＜0.01)。 詳見圖3。

3.4 心肌細胞氧化應激指標結果

與NT 組相比，Model 組中CK、LDH、MDA 含量明顯增加（P＜0.01），與Model 組比較，CHSSC 組CK（P＜0.05）、LDH、MDA 含量降低（P＜0.01）。 詳見圖4。

3.5 超聲心動圖檢測結果

與NT 組比較，Model 組中左室EF 值明顯下降，差異有統計意義（P＜0.01），LVIDs、LVIDd、LVESV、LVEDV 值增加，差異有統計意義（P＜0.01）；與Model組比較，CHSSC 組中小鼠心臟彩色超聲情況都有不同程度的改善，其中EF 升高明顯（P＜0.05），LVESV降低（P＜0.05），LVIDs、LVIDd、LVEDV 皆明顯下降（P＜0.01）。 詳見圖5。

表1 各組心肌細胞OD 值及心肌細胞生存率

圖1 柴胡三參膠囊對NRVM 細胞活力影響（±s，n=4）

圖2 不同濃度阿霉素（A）及柴胡三參膠囊（B）對NRVM 細胞凋亡影響（±s，n=4）

圖3 柴胡三參膠囊對心肌組織細胞凋亡（±s，n=9）

圖4 柴胡三參膠囊對心肌細胞氧化應激指標的影響（±s，n=20）

3.6 NRVM 及心肌組織中c-Caspase 3、p-p38MAPK、p-PI3K、p-Akt 蛋白表達結果

在NRVM中與NT組比較，Model組中p-p38MAPK、p-PI3K 和c-Caspase 3 蛋白表達水平升高，且以阿霉素濃度劑量依賴性方式增加(P＜0.01），與Model 組比較，CHSSC 中p-p38MAPK、p-PI3K 和c-Caspase 3表達降低（P＜0.01）。 詳見圖6。

在心肌組織中，與NT 組比較，Model 組中p-PI3K、p-p38MAPK 蛋白（P＜0.01）和c-Caspase 3（P＜0.05）蛋白表達水平升高，與Model 組相比，CHSSC 組中p-PI3K、p-p38MAPK 蛋白(P＜0.01）和c-Caspase 3（P＜0.05）蛋白表達降低。 詳見圖7。

4 討論

圖5 各組小鼠心臟超聲結果比較(±s，n=20)

圖6 柴胡三參膠囊對NRVMc-Caspase3、p-P38MAPK、p-PI3K、p-Akt 蛋白表達水平的影響（n=3）

蒽環類化療藥物是臨床常用的一類抗腫瘤藥物，但其通過累積和劑量依賴方式引起的心臟毒性使其臨床應用受到限制[11]。 現代醫學對抗腫瘤治療相關心血管毒性并無特殊有效方法，主要依靠右丙亞胺、β 受體阻滯劑或他汀類等心血管藥物來減輕不良反應。 但由于右丙亞胺可能干擾蒽環類抗生素的抗癌活性，并增強阿霉素的骨髓抑制作用，而且價格相對昂貴，臨床應用受到限制[12]。柴胡三參膠囊是本院針對心律失常療效顯著的經驗方。 方中柴胡為君，達肝經入少陽，疏泄肝郁，升發肝氣，調暢氣機，和解少陽之邪；臣以法半夏化痰燥濕、消痰下氣；丹參活血通經、涼血消腫、清心除煩；苦參清火燥濕，兼通利小便；黃連大苦大寒，燥濕清熱；青蒿辛開苦泄，宣可去壅，善開痰結，并能定悸；黨參補氣健脾，益氣以扶其正；甘草補脾益氣、滋咳潤肺、緩急解毒、調和百藥為佐使。 在前期研究中發現，柴胡三參膠囊能明顯減少缺血性心律失常大鼠心肌中PKA、PKC 的表達及血清CRP 水平，對心肌急性損傷具有保護作用，此外，其含藥血清在一定條件下能激活p38MAPK信號通路和PI3K/Akt 通路[13]。 但該藥是否通過PI3K/Akt 及p38MAPK 通路的活化而發揮心肌保護作用尚不明確，因此，很有必要從蛋白分子水平上進一步深入探討其保護心肌的作用機制，為蒽環類藥物所致心臟毒性的中醫藥防治提供科學可靠的理論依據。

圖7 柴胡三參膠囊對心肌組織中c-Caspase 3、p-P38MAPK、p-PI3K、p-Akt 蛋白表達水平的影響（n=8）

阿霉素被認為會誘導心臟毒性，因其自由基會引起線粒體損傷[2]。 鑒于一系列研究報告活性氧清除劑未能有效預防心臟毒性，這一假設不足以解釋阿霉素的心臟毒性[14]。 研究表明，阿霉素可通過Caspase 3 依賴性機制誘導DNA 損傷，抑制DNA 和蛋白質合成，促進肌纖維變性，抑制特定基因的轉錄，導致心肌細胞凋亡[3]。 而在心力衰竭過程中，心肌細胞主要以細胞凋亡和自噬形式導致細胞損失，從而引起心臟收縮功能惡化和左心室重構。在此過程中,多種凋亡因子共同發揮作用，而PI3K/Akt 信號通路可以通過直接或間接的方法抑制凋亡因子發揮效應[15]。 PI3K/Akt 信號通路是一條廣泛存在的信號通路，已被認為參與多種細胞生物學過程[16]。這一信號通路在各種病理或應激刺激下被激活， 如炎癥、缺血、缺氧和氧化應激等[17]。 Akt 是PI3K 的關鍵下游調節因子之一，活化的PI3K 將膜結合的磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(PIP2)轉化為磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸(PIP3)，PIP3 作為重要的第二信使招募磷酸肌醇依賴激酶1(PDK1)在蘇氨酸308(Thr308)處磷酸化Akt。因此，Akt 的激活形式可以進一步與多種凋亡和生存相關的調控因子相互作用，從而促進細胞存活，抑制細胞凋亡[18]。MAPK 已被報道為最重要的信號通路蛋白激酶，作為MAPK 家族的一員，p38MAPK可以被化學和物理應激激活，促進生長，導致氧化應激、凋亡和血管收縮[19]。 眾所周知，氧化應激通過調節炎癥信號通路和促凋亡信號通路來誘導細胞凋亡，從而導致人類和心力衰竭動物模型的心室擴張[20-21]。 氧化應激被認為可引起p38MAPK 的激活，p38MAPK 是氧化應激所致心臟損傷的主要靶點，在氧化應激或缺血再灌注等應激狀態下，p38MAPK 的激活促進心肌細胞凋亡，從而導致心肌收縮功能和左心室的惡化。 相關研究證明，p38MAPK 已被證明在DOX 誘導的心臟毒性中起重要作用[22-23]。

本研究顯示，阿霉素在體外和體內觸發心臟毒性，柴胡三參膠囊可保護心肌細胞免受阿霉素誘導的氧化應激和細胞凋亡。 研究表明，PI3K/Akt 信號通路提供了心肌細胞中必不可少的細胞存活信號[24]。在本研究中，發現柴胡三參膠囊可以激活PI3K/Akt信號通路并減少阿霉素誘導的心肌細胞凋亡。 阿霉素誘導Akt 磷酸化增加，這與SWAIN 等人的發現相似[25-26]，并被認為是一種補償性保護性上調。 然而，本實驗表明，經過柴胡三參膠囊預處理后，磷酸化的Akt 降低，這可能與阿霉素誘導的Akt 磷酸化的時間過程相關，阿霉素治療可以在短時間內誘導補償性Akt 磷酸化增加，但隨著時間推移，磷酸化量逐漸較少[27]，因本研究暫時未做時間梯度的對比，在進一步實驗中可以完善這部分驗證。柴胡三參膠囊預處理后，促凋亡蛋白，如活化的Caspase 3 和pp38MAPK 在體外和體內均減少，表明柴胡三參膠囊可以通過激活Akt 通路抑制細胞凋亡。 既往研究顯示，阿霉素可誘導p38MAPK 的激活，導致炎癥反應和細胞損傷[28]。 本研究中，發現阿霉素導致p38MAPK激活增加，而柴胡三參膠囊治療后大大降低了蛋白激活，鑒于氧化應激可以激活p38MAPK 信號通路，柴胡三參膠囊可以有效地降低p38MAPK 磷酸化并減輕細胞炎癥，從而抑制心肌細胞凋亡和損傷。

綜上所述，柴胡三參膠囊可保護心臟免受阿霉素誘導的氧化應激和細胞凋亡損傷，其機制可能與調節PI3K/Akt 和p38MAPK 通路有關，但是否與劑量存在密切關系需進一步探索。