雙黃連凍干粉成分分析及其與頭孢拉定合用對人肝細胞功能的影響

徐大志，溫如燕，李相玲*,余浚龍*

（1.大慶市人民醫院，黑龍江 大慶 163316；2.廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530200）

雙黃連具有清熱解毒功效，臨床上常用來與其他藥物合用。 如雙黃連口服液聯合雷尼替丁治療口腔潰瘍，其臨床療效和安全性優于單獨使用雷尼替丁，且療效持久、復發率低[1]。 臨床上，雙黃連凍干粉聯合頭孢替安治療兒童上呼吸道感染的效果亦優于頭孢替安單獨使用[2]。 雙黃連注射劑是中醫醫院治療上呼吸道感染性疾病的首選藥之一，其療效已被肯定[3]。然而，2016 年國家食品藥品監督管理總局通報的中藥不良反應報告中，中藥注射劑占比53.7%[4]，不良反應發生比例較高[5]。 肝臟是藥物代謝的主要器官，谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase, ALT)和谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase, AST)是常用的肝功能檢測指標[6]。 二磷酸腺苷（adenosine diphosphate, ADP）和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）的含量檢測可以反映細胞的生長狀態，同時也能部分地反映組織細胞內能量代謝狀態和藥物的作用[7]。環氧化酶（cyclooxygenase, COX）是花生四烯酸合成前列腺素(prostagalnadina, PGs)過程中一個重要的限速酶。 在肝癌組織中COX-2 呈高表達，可以促進腫瘤細胞增殖及腫瘤轉移，抵抗細胞凋亡，參與血管形成，在包括肝癌的多種腫瘤發生中起重要作用[8]。 血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1, HO-1）是一種誘導酶，以其抗炎、抗氧化和神經保護作用而聞名[9]。 HO-1 也是肝臟應急后誘生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)介導保護的另一種有效介體[10]。由此推測，雙黃連凍干粉與頭孢類抗生素合用對肝臟有影響。前期研究認為，高濃度的雙黃連注射液對體外培養的肝細胞有一定損傷，且與頭孢拉定聯合應用可增加肝細胞毒性[11]。為了進一步探討雙黃連注射液的不良反應，以及與頭孢類抗生素聯合用藥之后對肝臟的影響，本研究選擇雙黃連凍干粉中各成分與頭孢拉定合用，檢測人肝細胞（HL-7702）中ALT、AST、ADP、ATP、COX-2 及HO-1 的表達量，進一步研究雙黃連凍干粉單獨或者與頭孢拉定合用對肝細胞的影響，為臨床上雙黃連注射液的應用以及與其他抗生素合用提供理論支持。

1 材料

1.1 主要儀器

高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography, HPLC）（型號：Dionex Summit， 美國Dionex 公司）；分析天平（型號：AUM220D，日本Shimadzu 公司）；低速大容量離心機（型號：LXJ-IIB，上海安亭科學儀器廠）；高速低溫離心機（型號：5810 型，美國Eppendorf centrifuge 公司）；細胞培養箱（型號：MCO175，日本SANYO 公司）；倒置顯微鏡（型號：IMT-2，日本奧林巴斯公司）；PCR 儀（型號：PCR System2400，美國PerkinElmer 公司）；凝膠成像儀（型號：GDS7600，英國Ultra-violet products公司）。

1.2 試藥

綠原酸對照品（批號：110753-200413，純度＞97%）、連翹苷對照品（批號：110821-200711，純度＞98%）、黃芩苷對照品（批號：110715-201016，純度為99%）、漢黃芩素對照品（批號：110821-200711，純度＞98%）均購自中國藥品生物制品檢定所；雙黃連凍干粉（哈藥集團有限公司，批號：1005006）；ADP 對照品（美國Sigma 公司，批號：75431-54-8，純度≥98%）；ATP 對照品（美國Amersco 公司，批號：Amersco-220，純度≥98%）。

1.3 細胞株來源

HL-7702 細胞（批號：BFN608006124），來自中國科學院上海細胞生物學研究所。

2 方法

2.1 HPLC 檢測雙黃連凍干粉含量[12]

根據文獻中HPLC 條件[13]，應用HPLC 波長轉換法同時檢測雙黃連凍干粉中綠原酸、連翹苷、黃芩苷及漢黃芩素4 種成分的含量。

2.2 分組與給藥

取對數生長期的HL-7702 細胞，胰酶消化后用新鮮培養基制成細胞懸液，按5×104cells/mL 接種于6 孔板中，每孔3 mL，實驗分為對照組（只加細胞液）、頭孢拉定組、DMSO 組、雙黃連組、綠原酸組、連翹苷組、黃芩苷組、漢黃芩素組、綠原酸+頭孢拉定組(0.046 mg/mL)、連翹苷+頭孢拉定組(0.046 mg/mL)、黃芩苷+頭孢拉定組(0.046 mg/mL)以及漢黃芩素+頭孢拉定組(0.046 mg/mL)。 靜置培養48 h 后，對照組加入空白溶劑RPMI 1640，頭孢拉定組加入頭孢拉定0.046 mg/mL，DMSO 組加入0.2%的DMSO。其余分為高劑量組和低劑量組，其中低劑量組中各組分濃度相當于雙黃連組濃度為0.5 mg/mL，高劑量組中各組分濃度相當于2 mg/mL 的雙黃連凍干粉培養液，具體為：綠原酸組低劑量濃度為0.009 84 μg/μL、高劑量濃度為0.039 34 μg/μL，連翹苷組低濃度為0.001 388 μg/μL、高濃度為0.005 549 μg/μL，黃芩苷組低劑量濃度為0.129 5 μg/μL、高劑量濃度為0.517 7 μg/μL， 漢黃芩素組低劑量濃度為0.000 223 μg/μL、高劑量濃度為0.000 89 μg/μL。其余各組為綠原酸+頭孢拉定組(0.046 mg/mL)、連翹苷+頭孢拉定組(0.046 mg/mL)、黃芩苷+頭孢拉定組(0.046 mg/mL)、漢黃芩素+頭孢拉定組(0.046 mg/mL)。 每個劑量組重復6 孔，培養箱中培養后進行觀察、處理和取樣。

2.3 培養液中ALT、AST 的含量測定

將細胞每孔3 mL 接種于6 孔板，按照“2.2”項下方法給藥細胞，培養箱培養24 h，收集細胞懸液，離心（800 r/min，5 min，半徑8.9 cm），吸取上清液，試劑盒檢測ALT、AST 的含量。

2.4 肝細胞中的ATP、ADP 的含量測定

將細胞接種于6 孔板，每孔3 mL，按照“2.2”項下方法給藥細胞，培養箱孵育48 h 后收集細胞懸液，用無菌PBS 洗3 次，0.5 mL 胰蛋白酶消化，離心（800 r/min，5 min，半徑8.9 cm），棄上清液，向離心管中加入100 ℃的磷酸緩沖鹽（50 mmol/L）1 mL，搖勻，沸水浴中放置10 min，在冰浴中冷卻，離心（800 r/min，5 min，半徑8.9 cm），取上清液，0.45 μm濾膜過濾，取濾液，流動相：甲醇-磷酸鹽緩沖液溶液（pH 5.8），流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進樣器溫度4 ℃，檢測波長260 nm，進樣10 μL，HPLC 方法檢測肝細胞中的ATP、ADP 的含量。

2.5 RT-PCR、瓊脂糖凝膠電泳檢測COX-2、HO-1的表達

取對數生長期的HL-7702 細胞懸液，以5×104個/孔接種于6 孔板，每孔3 mL。 培養48 h 待細胞貼壁后，對照組加入10%的胎牛血清的RPMI1640培養液；頭孢拉定組加入含有0.046 mg/mL 的頭孢拉定和含有10%胎牛血清的RPMI1640 培養液；其余各組加入不同濃度的雙黃連凍干粉和不同濃度的雙黃連粉針劑與0.046 mg/mL 頭孢拉定的培養液，每組3 個復孔。 藥物作用1 d 后，棄上清液，用無菌PBS 洗3 次，按照Total RNA 提取試劑盒的說明提取總RNA。 參照文獻[14]設計引物（見表1），經BLAST 確認引物特性，由生工生物工程（上海）有限公司合成。

將各引物管瞬時離心，慢慢打開管蓋，加入適量的無RNA 水稀釋成10 mmol/L 的引物儲備液，蓋上管蓋，充分混勻，瞬時離心于-20 ℃儲存備用。 RTPCR 反轉錄，PCR 擴增。 其中，HO-1、β-actin PCR條件為94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30 個循環后于72 ℃再延伸10 min。COX-2 的PCR 條件為95℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個循環，72 ℃最終延伸10 min。 RT-PCR 法檢測HO-1、COX-2 基因的表達。 取上述PCR 產物每管5 μL，Marker 1 μL 充分混勻上樣。 電泳電壓100 V、60 min。 凝膠成像分析，以HO-1、COX-2 與β-actin的灰度之比判斷mRNA 的相對表達水平。

表1 引物序列

2.6 統計學分析

各實驗組數據使用SPSS 20.0 統計軟件進行分析，各組數據以“±s”表示，兩組樣本均數間比較采用t 檢驗進行統計分析，多組之間比較用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 雙黃連凍干粉含量測定

HPLC 檢測，按照各組分標準品的標準曲線計算雙黃連凍干粉中各組分含量，從結果可知在雙黃連凍干粉中，黃芩苷含量最高，其次為綠原酸、連翹苷，漢黃芩素含量最低。 詳見表2。

表2 雙黃連凍干粉主要成分含量(n=6，μg)

3.2 培養液中ALT、AST 的含量

與對照組相比，高劑量組中黃芩苷組、連翹苷組、漢黃芩素組人肝細胞（HL-7702）中ALT、AST 表達均下降（P＜0.05，P＜0.01）；綠原酸+頭孢拉定組（0.046 mg/mL）與連翹苷+頭孢拉定組（0.046 mg/mL）中ALT 表達增加（P＜0.05，P＜0.01），AST 差異無統計學意義（P＞0.05）。 詳見表3。

表3 高劑量組各組分對HL-7702 細胞ALT、AST 的作用(n=6，±s，IU/L)

表3 高劑量組各組分對HL-7702 細胞ALT、AST 的作用(n=6，±s，IU/L)

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別對照組頭孢拉定組DMSO 組綠原酸組連翹苷組黃芩苷組漢黃芩素組綠原酸+頭孢拉定組(0.046 mg/mL)連翹苷+頭孢拉定組(0.046 mg/mL)黃芩苷+頭孢拉定組(0.046 mg/mL)漢黃芩素+頭孢拉定組(0.046 mg/mL)ALT 5.086±0.154 4.449±0.400 3.106±0.195**5.539±0.406 3.823±0.208*3.109±0.172*2.648±0.181**5.839±0.108*6.325±0.216**3.470±0.405*3.445±0.387*AST 4.611±0.001 3.406±0.013*3.001±0.006*3.091±0.007*3.060±0.004*3.423±0.008*3.255±0.006*3.895±0.003 3.838±0.001 5.084±0.006 4.784±0.017

與對照組相比，低劑量組中黃芩苷組、連翹苷組、漢黃芩素組人肝細胞（HL-7702）中ALT 表達下降（P＜0.05），AST 表達差異無統計學意義（P＞0.05）；漢黃芩素+頭孢拉定組（0.046 mg/mL）與連翹苷+頭孢拉定組（0.046 mg/mL）中ALT 表達增加（P＜0.05），AST 差異無統計學意義（P＞0.05）。 詳見表4。

表4 低劑量組各組分對HL-7702 細胞ALT、AST 的作用(n=6，±s，IU/L)

表4 低劑量組各組分對HL-7702 細胞ALT、AST 的作用(n=6，±s，IU/L)

注：與對照組比較，*P＜0.05。

組別對照組頭孢拉定組DMSO 組綠原酸組連翹苷組黃芩苷組漢黃芩素組綠原酸+頭孢拉定組(0.046 mg/mL)連翹苷+頭孢拉定組(0.046 mg/mL)黃芩苷+頭孢拉定組(0.046 mg/mL)漢黃芩素+頭孢拉定組(0.046 mg/mL)ALT 8.407±0.685 8.257±0.591 7.447±0.334*7.819±0.406 5.535±0.429*6.304±0.634*7.302±0.332*8.557±0.789 8.929±0.393*7.891±0.889 8.929±0.391*AST 4.613±0.362 4.449±0.279 4.410±0.351 5.055±0.592 3.871±0.614 4.160±0.898 4.324±0.389 5.528±0.393 5.080±0.234 5.024±0.487 4.612±0.200

3.3 肝細胞中ATP、ADP 的含量

與對照組比較，高劑量組中綠原酸組、綠原酸+頭孢拉定組(0.046 mg/mL)以及連翹苷+頭孢拉定組(0.046 mg/mL)中ATP 表達顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；各組對ADP 表達影響差異均無統計學意義（P＞0.05）。詳見表5。

與對照組比較，低劑量組中黃芩苷組ATP 與ADP表達明顯增加（P＜0.05），漢黃芩素組ATP 與ADP 表達明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）；黃芩苷、漢黃芩素與頭孢拉定合用后細胞中ATP、ADP 的含量顯著降低（P＜0.01）。 詳見表6。

表5 高劑量組中各組分對HL-7702 細胞ATP、ADP 的作用(n=6，±s，μg)

表5 高劑量組中各組分對HL-7702 細胞ATP、ADP 的作用(n=6，±s，μg)

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別對照組頭孢拉定組DMSO 組綠原酸組連翹苷組黃芩苷組漢黃芩素組綠原酸+頭孢拉定組(0.046 mg/mL)連翹苷+頭孢拉定組(0.046 mg/mL)黃芩苷+頭孢拉定組(0.046 mg/mL)漢黃芩素+頭孢拉定組(0.046 mg/mL)ATP 0.127±0.009 0.110±0.021*0.129±0.004 0.118±0.010*0.126±0.006 0.128±0.005 0.130±0.005 0.116±0.017*0.096±0.009**0.123±0.007 0.123±0.012 ADP 0.389±0.043 0.285±0.068 0.325±0.032 0.305±0.030 0.337±0.046 0.355±0.004 0.275±0.046 0.293±0.037 0.240±0.030 0.314±0.068 0.251±0.056

表6 低劑量組各組分對HL-7702 細胞ATP、ADP 的作用(n=6，±s，μg)

表6 低劑量組各組分對HL-7702 細胞ATP、ADP 的作用(n=6，±s，μg)

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別對照組頭孢拉定組DMSO 組綠原酸組連翹苷組黃芩苷組漢黃芩素組綠原酸+頭孢拉定組(0.046 mg/mL)連翹苷+頭孢拉定組(0.046 mg/mL)黃芩苷+頭孢拉定組(0.046 mg/mL)漢黃芩素+頭孢拉定組(0.046 mg/mL)ATP 0.126±0.014 0.121±0.006 0.148±0.011 0.119±0.007 0.127±0.008 0.196±0.015*0.086±0.002*0.096±0.013*0.127±0.008 0.066±0.023**0.052±0.011**ADP 0.294±0.005 0.232±0.008 0.297±0.042 0.244±0.068 0.321±0.030 0.481±0.065*0.148±0.009**0.223±0.013 0.277±0.011 0.142±0.120**0.101±0.026**

3.4 HO-1、COX-2 瓊脂糖電泳及相對表達量

與對照組比較， 頭孢拉定組HO-1、COX-2 相對表達量增加，但差異無統計學意義（P＞0.05）；雙黃連不同劑量組均能增加HO-1、COX-2 的表達，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；雙黃連各劑量組與頭孢拉定0.046 mg/mL 合用組均能顯著促進HO-1、COX-2 的表達，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。 詳見圖1-2。

圖1 不同濃度雙黃連單獨以及與頭孢拉定合用對HL-7702 肝細胞HO-1、COX-2 的RT-PCR 產物電泳圖（n=3，±s，mg/mL）

圖2 不同濃度雙黃連單獨以及與頭孢拉定合用對HL-7702肝細胞HO-1、COX-2 的mRNA 表達的影響（n=3，±s，mg/mL）

4 討論

雙黃連凍干粉中含有綠原酸、咖啡酸、蘆丁、金絲桃苷、連翹酯苷、野黃芩苷、黃芩苷、連翹苷、木犀草素、黃芩素和漢黃芩素等多種成分[15]。 2020 版《中華人民共和國藥典》中規定，注射用雙黃連（凍干）質量檢測的指標成分就是：綠原酸8.5～11.5 mg/支、黃芩苷128～173 mg/支、連翹苷1.4～2.1 mg/支。本研究中，選擇應用HPLC 波長轉換法同時檢測以上3 種成分，并增加了漢黃芩素的含量測定。 檢測結果顯示，注射用雙黃連凍干粉中黃芩苷含量最高，其次為綠原酸、連翹苷，漢黃芩素含量最低。

前期研究發現，雙黃連凍干粉單用以及與頭孢拉定合用，對人肝細胞生長、增殖、細胞形態都有比較明顯的抑制作用，且高濃度雙黃連凍干粉（2 mg/mL）體外對人肝細胞有一定的損傷[11]，說明隨著注射用雙黃連給藥量的加大，其對肝細胞的毒性相應加大，進一步說明雙黃連主要有效成分合用后可能發生相互作用，產生不良反應。本研究低劑量組中，與對照組相比，連翹苷組、黃芩苷組、漢黃芩素組的實驗結果顯示此3 種成分單獨使用能顯著降低HL-7702 細胞ALT 表達，而綠原酸單獨應用對ALT的表達無影響；高劑量組中綠原酸、連翹苷、漢黃芩素對HL-7702細胞AST、ALT 含量影響與對照組相比差異顯著，這與文獻報道[16-18]的其均有保肝作用相一致。 在ATP、ADP 檢測結果中，與對照組相比，高劑量組中各組對ADP 表達無影響，綠原酸組、綠原酸與頭孢拉定合用組以及連翹苷與頭孢拉定合用組能顯著抑制ATP 表達；而低劑量組中黃芩苷、漢黃芩素單獨以及與頭孢拉定合用對ATP、ADP 表達均有顯著影響。

COX-2 被認為是一種炎癥反應基因，主要分布在核膜，在炎癥組織中高表達[19]。 研究發現，在高分化的肝細胞癌中COX-2 表達增強，參與肝癌的早期形成階段，在進展期中表達呈現降低[20]。本實驗結果表明，單獨給予不同濃度的雙黃連注射液的細胞，COX-2 mRNA 的表達量與給藥濃度呈正相關，但是當雙黃連濃度達到2.0 mg/mL 時，其表達量有所下降。 這可能與注射液中含有脂多糖類物質有關，當低劑量給藥時，雙黃連注射劑中含有的脂多糖類物質具有內毒素活性，隨著給藥濃度的增加，對細胞的刺激性增加，所以藥物作用后COX-2 表達上調。本實驗結果發現，HO-1 mRNA 與COX-2 mRNA的表達趨勢相一致，說明HO-1 mRNA 與COX-2 mRNA的表達具有相關性。這可能與給藥后，藥物刺激肝細胞產生應激反應，消耗細胞內的抗氧化劑，造成細胞損傷,并調節細胞內的信號轉導途徑[21]。

本研究發現，雙黃連凍干粉及其組分與頭孢拉定合用對肝細胞功能以及能量代謝有一定的影響，對環氧化物酶和血紅素加氧酶的表達存在影響。 其中，對劑量的探索為后續動物實驗的研究奠定基礎。其合用之后，所造成的肝細胞損害的作用機制還有待進一步研究，尤其是動物在體實驗的研究。