甘藍型油菜Bn WRKY41的理化性質分析及BnWRKY41-2在花青素合成中的功能解析

于芮蘆魏澤樓郭 媛劉子金陳明訓

(國家楊凌農業生物技術育種中心,陜西省作物雜種優勢研究與利用重點實驗室,西北農林科技大學農學院,陜西楊凌 712100)

油菜(Brassica napusL.)不僅能為人類提供食用油,而且可作為生物燃料和動物飼料的來源[1]。在中國油料作物中,油菜的種植范圍廣、面積大,占油料作物總種植面積的一半以上,其中冬油菜種植面積占油菜總種植面積的九成以上[2]。花青素屬于黃酮類化合物,具有較強的抗氧化特性,能夠增強植物抵御生物和非生物脅迫的能力[3-7],同時也能被人體所吸收,進而提高機體免疫力[8-10]。冬油菜的抗寒性決定了其能否在北方地區安全過冬并獲得豐收[11]。研究表明油菜的抗寒性與花青素的含量息息相關[12-14],然而目前關于油菜花青素代謝調控的研究報道尚不多見。因此,挖掘調控油菜花青素合成的關鍵基因,有助于利用分子育種手段培育花青素含量高、對非生物逆境具有較強抵抗力的優異油菜種質資源。

WRKY 家族成員眾多,目前在擬南芥中報道的WRKYs有72個[15],是高等植物中最大的轉錄因子家族之一,通常在其N 端有WRKY 結構域,該結構域包含一段保守氨基酸序列WRKYGQK 和結合鋅離子的鋅指蛋白結構[16-17]。大量研究表明,WRKY 家族轉錄因子參與調控植物逆境脅迫[18-20]、根系發育[21]、葉片發育[22]、毛狀體形成[23]、種子發育[24]和衰老[25-26]等生理生化過程。近年研究表明WRKY 轉錄因子也參與花青素的生物合成。葡萄Vv WRKY26正調控色素的積累,在矮牽牛ph3突變體中過量表達Vv WRKY26后,色素含量也得到顯著提高[27]。Md WRKY11轉化蘋果愈傷組織后,類黃酮和花青素的含量顯著高于對照組,并且類黃酮通路中相關基因的表達量顯著上升[28]。WRKY41在植物響應非生物逆境中也發揮關鍵作用。比如:在煙草中過量表達棉花Gh-WRKY41基因,可顯著增強其耐鹽抗旱能力[29];在番茄中,Sp WRKY41參與調控番茄的抗逆響應過程,其表達模式受外源水楊酸、赤霉素和乙烯等激素影響[30]。在擬南芥中過量表達辣椒CaWRKY41基因可降低鎘的耐受性,增強鎘和鋅的吸收以及過氧化氫的積累[31]。在擬南芥中,At WRKY41促進種子休眠[32],但抑制葉片花青素的生物合成[33]。盡管科研工作者對WRKY41轉錄因子研究較多,但對甘藍型油菜中該基因在花青素合成中的調控功能仍不清楚。

在甘藍型油菜品種‘中雙11’(ZS11)中,WRKY41有兩個拷貝,分別為Bn WRKY41-1和Bn WRKY41-2。西北農林科技大學油菜生物育種理論與技術創新團隊前期研究發現,Bn-WRKY41-1顯著抑制擬南芥葉片中花青素的積累[33]。但是,Bn WRKY41-2 在葉片花青素合成中的生物學功能尚不清楚。本研究對油菜Bn-WRKY41-1和Bn WRKY41-2兩個拷貝進行生物信息學比較分析,并在擬南芥中初步分析Bn-WRKY41-2 在花青素合成過程中的調控作用。

1 材料與方法

1.1 植物材料與培養

植物材料包括擬南芥野生型(Col-0)、擬南芥At WRKY41基因的功能缺失突變體wrky41-2(SALK_028449)、甘藍型油菜‘中雙11’(ZS11)和以wrky41-2突變體為遺傳背景的T3代轉基因株系(wrky41-2 35S:Bn WRKY41-2-6HA)。所有材料均種植于人工培養箱中,溫度為22 ℃,光照周期為16 h光照和8 h黑暗,光照強度為160 μmol·m-2·s-1。

1.2 生物信息學分析

利用在線網站了解Bn WRKY41-1 和Bn-WRKY41-2 兩個蛋白質的基本理化性質、結構和功能,預測它們在細胞內的功能,相關網站及其網址如表1所示。

1.3 RNA提取與cDNA第一鏈合成

利用RNA 提取試劑盒(Steady Pure Plant RNA Extraction Kit,Cat:AG21019)提取擬南芥和油菜葉片中的總RNA。使用Naon Drop(NanoDrop ND-1000)測定RNA 濃度。使用反轉錄試劑盒Evo M-MLV RT for PCR Kit(Accurate Biotechnology,Cat:AG11603)合成cDNA,儲存在-20 ℃,供后續試驗使用。

1.4 基因克隆和植物表達載體構建

依據NCBI數據庫中Bn WRKY41-2基因的CDS序列,利用PrimerBLAST 程序設計特異性引物(表2),以‘ZS11’幼嫩葉片的cDNA 為模板,利用高保真DNA 聚合酶(TaKaRa,Cat:R010A)通過PCR 技術擴增目的基因。PCR 反應程序如下:98 ℃預變性30 s,98 ℃變性10 s,58 ℃退火5 s,72℃延伸1 min 30 s,35個循環,72℃延伸5 min,12 ℃保存。切膠,使用凝膠回收試劑盒(OMEGA,Cat:D2500-02)對膠條中的目的DNA 片段進行回收。利用限制性內切酶XmaⅠ和SpeⅠ對純化后的目的片段以及載體p Green-6HA、p Green-GFP進行酶切處理,使用T4連接酶(Ta KaRa,Cat:2011A)連接酶切后的目的片段和載體并轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α,隨機篩選6個陽性單克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。這6個陽性克隆的測序結果完全一致,并與目標序列完全一致,表明從‘ZS11’中成功克隆Bn WRKY41-2基因的CDS序列,并成功構建該基因的植物表達載體35S:Bn-WRKY41-2-6HA和35S:Bn WRKY41-2-GFP。

1.5 煙草葉片的亞細胞定位

利用農桿菌侵染法[34]將35S:Bn WRKY41-2-GFP載體轉入到煙草(Nicotiana benthamiana)葉片細胞中表達,分析油菜BnWRKY41-2在煙草葉片細胞中的亞細胞定位。步驟如下:將35S:Bn WRKY41-2-GFP載體轉染煙草幼嫩葉片,培養72 h后,將DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)染液(1 mol· L-1Tris,p H 7.4,5 mol·L-1NaCl,1μg·L-1DAPI)注入上述煙草葉片中,30 min后用激光共聚焦顯微鏡(ZEISS LSM700,Germany)觀察熒光信號并拍照。

1.6 轉基因株系的篩選與鑒定

將35S:Bn WRKY41-2-6 HA轉化農桿菌感受 態 細 胞 (Agrobacterium tumefaciensGV3101),隨后在LB 培養基(含50μg·m L-1Kanamycin和25μg·m L-1Rifampicin)上挑取單克隆進行PCR 鑒定。采用花序浸染法[35],轉化擬南芥突變體wrky41-2。將收獲的種子均勻撒在營養土上,待其長出真葉時,每隔2～3 d噴施草銨膦(Basta),將篩選的抗性苗移至新的營養土上,單株進行DNA 水平和RNA 水平鑒定,確定是否成功轉入目的基因,鑒定結果為陽性的株系即為T1代轉基因株系,將收獲的種子置于MS培養基(含10μg·m L-1草銨膦)上繼續篩選,直至獲得T3代純合轉基因株系。

1.7 葉片花青素含量測定

參考Chory等[36]方法測定擬南芥葉片花青素的含量,簡要步驟如下:準確稱取0.1 g擬南芥葉片,用液氮研磨至粉末狀加入300μL 提取液[鹽酸∶甲醇=1∶99(W/V)],混合均勻后4 ℃避光過夜。加入200μL的蒸餾水和500μL的氯仿,上下搖晃1 min,12 000 r·m L-1離心8 min。利用多功能酶標儀(TECAN Spark,Austria)測定溶液在波長為530 nm 和657 nm 處的吸光值。各樣品花青素相對含量=(A530-A657)/鮮質量,鮮質量單位為g。

1.8 基因表達分析

利用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)技術分析基因表達情況。使用SYBR○R Premix Ex TaqTMⅡ(TakaRa,Cat:DRR820A)試劑盒進行熒光定量試驗。試驗每個樣品設置3個技術重復和3個生物學重復,參照試劑盒說明書,反應體系為20μL,反應程序為:94 ℃預變性5 min,94 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,40個循環,72 ℃延伸5 min,12 ℃保存。以管家基因At Actin7為內參基因,各個基因的相對表達量根據2-△△Ct法[37],RT-qPCR 試驗所用引物見表2。

表2 引物序列Table 2 Sequences of primers

2 結果與分析

2.1 BnWRKY41-1 和BnWRKY41-2 蛋白質的生物信息學比較分析

2.1.1 理化性質分析 如表3 所示,Bn-WRKY41-1氨基酸殘基總數為330,分子質量為36 564.71 u,等電點為5.68,其中帶正電荷的氨基酸共有31個,占9.4%,帶負電荷的氨基酸共有37個,占11.2%,不穩定系數為45.50,平均親水性為-0.618;Bn WRKY41-2 氨基酸殘基總數為323,分子質量為35 948.9 6 u,等電點為5.90,其中帶正電荷的氨基酸共有32 個,占9.9%,帶負電荷的氨基酸共有36個,占11.1%,不穩定系數為46.42,平均親水性為-0.693。結果表明Bn WRKY41-1 和Bn WRKY41-2 均為不穩定、弱酸性的親水蛋白質。

表3 BnWRKY41蛋白質的基本理化特性Table 3 Physicochemical properties of BnWRKY41 proteins

2.1.2 蛋白質結構預測分析 在線網站SOPMA 預測表明,Bn WRKY41-1 和Bn WRKY41-2蛋白質的二級結構均以無規則卷曲為主,分別為62.73% 和59.44%,其次是α-螺旋,分別為21.21%和24.15%,β-轉角占比最少,分別為4.24%和2.79% (圖1-A、1-B)。在線網站SWISS-MODEL預測表明,BnWRKY41-1和Bn-WRKY41-2 蛋白質三級結構基本一致,均可形成一個單體,沒有配體的結合(圖1-C、1-D)。

圖1 BnWRKY41蛋白質的二級結構和三級結構Fig.1 The secondary and tertiary structuresof BnWRKY41 proteins

2.1.3 結構域預測分析 利用在線網站TMHMM Server對Bn WRKY41兩個蛋白質的跨膜結構、信號肽和結構域預測分析,結果表明Bn-WRKY41兩個蛋白質均沒有跨膜結構域(圖2-A、2-B),各項預測指標均低于閾值,沒有N 端信號肽(圖2-C、2-D),屬于非分泌性蛋白質,具有典型的WRKY 家族轉錄因子結構域(圖2-E)。

圖2 BnWRKY41蛋白質結構域預測分析Fig.2 Prediction of functional domains of BnWRKY41 proteins

2.1.4 氨基酸翻譯后磷酸化修飾位點和N-糖基化修飾位點預測分析 利用在線網站NetPhos 3.1 Server對Bn WRKY41兩個蛋白質的三類氨基酸殘基[絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)]進行翻譯后的磷酸化修飾位點預測。結果發現Bn WRKY41-1中磷酸化位點共有44個,其中絲氨酸磷酸化位點最多,有28個,其位置分別在:4、34、39、41、42、44、61、62、78、100、103、107、110、125、126、142、156、173、194、212、245、253、257、266、269、285、299、303。其次是蘇氨酸磷酸化位點,有13個位點,其位置分別在:49、54、94、178、182、204、210、223、224、261、291、298、300。酪氨酸磷酸化位點最少,僅3個,其位置分別在:63、160、288(圖3-A)。BnWRKY41-2 的磷酸化位點共有42 個,其中絲氨酸磷酸化位點最多,達26個,其位置分別在:4、34、42、44、61、62、77、92、95、99、102、117、118、134、148、165、186、204、237、246、250、259、262、281、292、296。其次是蘇氨酸磷酸化位點,有12個位點,其位置分別在:49、54、86、170、174、196、202、215、216、254、289、291。酪氨酸磷酸化位點最少,僅有4個,其位置分別在:63、152、264、277(圖3-B)。

通過在線網站Net NGlyc1.0 Server對Bn-WRKY41兩個蛋白質進行N-糖基化修飾位點預測,結果顯示,BnWRKY41-1 和BnWRKY41-2均含有5個天冬酰胺(Asn)翻譯后的N-糖基化修飾位點,分別位于第71、123、226、243、283位(圖3-C)和第71、115、218、235、276位(圖3-D)。

圖3 BnWRKY41蛋白質磷酸化修飾位點和N-糖基化修飾位點預測分析Fig.3 Prediction of phosphorylation and N-glycosylation modification sites of BnWRKY41 proteins

氨基酸殘基修飾位點預測結果表明,Bn-WRKY41-1和Bn WRKY41-2 主要通過絲氨酸的磷酸化修飾發揮生物學功能。

2.1.5 蛋白質共表達網絡預測分析 利用在線網站STRING 預測BnWRKY41 兩個蛋白質的共表達網絡(圖4-A、4-B),結果表明Bn-WRKY41-1 和Bn WRKY41-2 均能夠與含有WRKY 結構域、B3結構域、WD-repeat序列的蛋白質形成互作網絡,在DNA 結合、轉錄調控、信號轉導等過程中發揮作用。此外,與Bn WRKY41-1互作的蛋白質還參與細胞壁修飾(表4),與Bn WRKY41-2 互作的蛋白質參與細胞組分構成(表5)。

表4 BnWRKY41-1共表達網絡中的蛋白質信息Table 4 The protein information in the coexpression network of BnWRKY41-1 protein

表5 BnWRKY41-2 共表達網絡中的蛋白質信息Table 5 The protein in formation in the coexpression network of the BnWRKY41-2 protein

圖4 BnWRKY41-1(A)和BnWRKY41-2(B)蛋白質的共表達網絡Fig.4 The coexpression network of BnWRKY41-1(A)and BnWRKY41-2(B)proteins

2.2 油菜Bn WRKY41-2定位于煙草葉片細胞的細胞核中

通過瞬時轉化使重組載體35S:Bn-WRKY41-2-GFP在煙草葉片細胞中表達,在激光共聚焦顯微鏡下,根據熒光信號判斷Bn-WRKY41-2 的亞細胞定位情況。如圖5 所示,Bn WRKY41-2 蛋白質定位于細胞核中,因此推斷Bn WRKY41-2 蛋白質在細胞核中發揮功能,可能具有轉錄因子特性。

圖5 BnWRKY41-2 在煙草葉片細胞中的亞細胞定位Fig.5 Subcellular localization of the BnWRKY41-2 protein in N.benthamiana leaf cells

2.3 油菜BnWRKY41-2抑制擬南芥葉片花青素的積累

為探究Bn WRKY41-2 對花青素積累的影響,構建植物過量表達載體35S:Bn WRKY41-2-6HA,并轉入到擬南芥突變體wrky41-2(圖6-A),利用草銨膦除草劑篩選獲得10個以上T1代轉基因單株,本研究隨機選取2個轉基因株系,并用特異性引物對其進行PCR鑒定(圖6-B)。利用RT-qPCR 技術檢測野生型、突變體和2 個獨立的擬南芥轉基因株系wrky41-2 35S:Bn-WRKY41-2中油菜Bn WRKY41-2基因的轉錄水平(圖6-C),結果顯示Bn WRKY41-2在擬南芥轉基因株系中均有大量表達,在野生型和突變體wrky41-2中沒有表達。利用酶標儀檢測野生型、突變體和2個獨立的擬南芥轉基因株系wrky41-2 35S:Bn WRKY41-2-6HA發芽20 d葉片中的花青素含量,結果顯示過量表達Bn WRKY41-2基因能夠使突變體葉片中高花青素含量的表型完全恢復至野生型水平(圖6-D),由此說明,Bn-WRKY41-2 在擬南芥葉片花青素積累過程中起負調控作用。

圖6 轉基因株系wrky41-2 35S:BnWRKY41-2-6HA 的分子鑒定及花青素含量分析Fig.6 Molecular characterization and quantitative assay of anthocyanin content of wrky41-2 35S:BnWRKY41-2-6HA transgenic plants

2.4 油菜Bn WRKY41-2抑制花青素積累相關基因的表達

前期研究表明擬南芥At WRKY41通過抑制At MYB75、At MYB111、At MYBD、AtGSTF12和At1G68840基因的表達,負調控花青素的積累[33]。為進一步探究Bn WRKY41-2 對花青素積累的影響,本研究利用RT-qPCR 技術檢測了以上5個基因在Col-0、wrky41-2和wrky41-2 35S:Bn WRKY41-2-6HA轉基因株系蓮座葉中的表達量。在突變體wrky41-2中At MYB75、At MYB111、At MYBD、AtGSTF12和At1G68840基因的表達量均顯著高于Col-0,而在wrky41-2 35S:Bn-WRKY41-2-6HA轉基因株系中,這些基因的表達量得到顯著抑制,其水平與Col-0相比并無顯著差異(圖7)。這些結果表明,BnWRKY41-2 與At WRKY41功能類似,均通過負調控At MYB75、At MYB111、At MYBD、At1G68840和AtGSTF12基因的表達,抑制擬南芥葉片花青素積累。

圖7 過量表達油菜BnWRKY41-2 基因后花青素合成相關基因的表達Fig.7 Expression of anthocyanin biosyn thesis genes under BnWRKY41-2 overexpression

3 討論

前期研究表明擬南芥At WRKY41除調控種子休眠[32]、逆境響應外[38],還顯著抑制葉片花青素的積累[33]。甘藍型油菜Bn WRKY41 有兩個拷貝,序列同源性高,其中Bn WRKY41-1通過負調控At MYB75、At MYB111、At MYBD、AtGSTF12和At1G68840等花青素合成相關基因的表達,顯著抑制擬南芥葉片花青素的積累,并與擬南芥At WRKY41在調控葉片花青素生物合成方面功能相似[33],但Bn WRKY41兩個拷貝蛋白質結構及Bn WRKY41-2 在調控葉片花青素生物合成方面的功能尚不清楚。本試驗旨在對Bn-WRKY41兩個拷貝進行生物信息學分析,并研究Bn WRKY41-2 在調控葉片花青素生物合成中的功能。結果表明Bn WRKY41-1和Bn WRKY41-2分別編碼330 和323 個氨基酸殘基,均含有WRKY 轉錄因子家族典型結構域WRKYGQK,兩個蛋白質均屬于親水性、不穩定(表3)、非分泌蛋白質(圖2-A、2-B),不具備信號識別功能(圖2-C、2-D),二級結構主要由無規則卷曲組成(圖1-A、1-B),蛋白質磷酸化主要集中在絲氨酸殘基上,N-糖基化位點有5 個(圖3),推測Bn-WRKY41-1和BnWRKY41-2 蛋白質功能相似;亞細胞定位結果表明Bn WRKY41-2 定位在細胞核中(圖5),說明可能作為轉錄因子發揮作用,這與前期研究的Bn WRKY41-1的亞細胞定位結果一致[33]。在擬南芥突變體wrky41-2中過量表達Bn WRKY41-2基因能夠完全恢復突變體蓮座葉花青素含量高的表型(圖6-D)。因此,以上研究結果表明,Bn WRKY41兩個拷貝不僅在蛋白質結構及理化性質方面相似,而且均可抑制擬南芥葉片花青素積累。以往研究顯示,高等植物中存在大量結構類似,功能保守的拷貝,例如亞麻中Lu FAD25 個拷貝均能促進亞油酸的生物合成[39]。

前人研究表明,At MYB75、At MYB111 和At MYBD 屬于MYB轉錄因子,在花青素合成過程中發揮重要作用。At MYB75基因參與調控植物體內花青素的積累,調控類黃酮物質生物合成相關基因的表達[40-41]。At MYB111 調控子葉中類黃酮的合成[42-43]。At MYBD 是花青素生物合成過程中的正向調控因子[44]。At1G68440 參與苯丙烷代謝途徑[45],生成花青素生物合成的關鍵底物香豆酰-輔酶A[46-47]。At GSTF12基因編碼谷胱甘肽-S-轉移酶,將花青素從胞質轉運到液泡中,促進花青素積累[48-50]。前期研究表明,At-WRKY41突變以后,At MYB75、At MYB111、At MYBD、AtGSTF12和At1G68840等基因在葉片中的表達量顯著提高,而在wrky41-2突變體中過量表達Bn WRKY41-1則能夠顯著抑制這些基因的表達[33]。本研究發現,在擬南芥wrky41-2突變體中過量表達Bn WRKY41-2也顯著抑制了這些基因的表達(圖7)。以上結果表明油菜BnWRKY41-1 和Bn WRKY41-2 與At-WRKY41在抑制擬南芥葉片花青素積累方面功能相似。

油菜作為中國第一大油料作物,栽培歷史悠久,多功能利用價值高。葉片花青素在抵御各種生物和非生物脅迫方面發揮著重要作用[6],本研究初步分析了油菜Bn WRKY41兩個拷貝蛋白質結構以及Bn WRKY41-2 在花青素積累過程中的調控作用,不僅為深入揭示其作用機制奠定了基礎,而且為油菜的品質改良育種提供了優異基因資源。