新疆柳樹花變葉植原體分子鑒定

李 豐賴剛剛趙志慧張 萍朱天生

(塔里木大學植物科學學院,南疆農業有害生物綜合治理兵團重點實驗室/南疆特色果樹高效優質栽培與深加工技術國家地方聯合工程實驗室,新疆阿拉爾 843300)

柳樹(Willow)是楊柳科(Salicaceae),柳屬(Salix)的總稱,屬喬木或灌木,全世界約520種,柳樹在中國栽培歷史悠久,全國各地均有分布,主要栽培品種250多種[1]。柳樹分布范圍廣,用途廣泛,不僅可以作為木材資源,還可用于園林綠化、防風固沙和醫藥等領域,特別是對于干旱地區荒漠化治理有重要作用。此外,由于近年來全球能源短缺,柳樹生長速度快,生物量積累較多,對于一些短輪伐期速生柳來講,具有潛在的開發潛力[2]。

植原體(Phytoplasma)是一類專性寄生于植物韌皮部或半翅目昆蟲體內,目前尚難以人工體外純培養的原核微生物,主要由刺吸式口器昆蟲(飛虱、葉蟬等)傳播[3]。植原體已經在全球引起1 000多種病害,中國已報道的有100多種[4],主要包括園藝作物、花卉、林業和農業經濟作物,嚴重威脅世界農林業發展安全。近年來,柳樹叢枝病在我國西北部分地區普遍發生,甘肅、內蒙和新疆已見報道。1992年王純利等[5]通過電子顯微鏡對新疆柳樹叢枝病病原進行初步觀察鑒定,認為該病原為類菌原體(Mycoplasma-like Organism,簡稱MLO)。2005 年朱天生[6]對采自塔里木大學校園內的柳樹花變葉植原體病害進行了分子鑒定,確定了其分類地位,并將其命名為柳樹花變葉植原體(Willow phyllody phytoplasma)。李巖峰等[7]報道了甘肅酒泉柳樹也表現出叢枝、小葉和枝條增殖等癥狀,并對其進行防治試驗研究。Zhang等[8]對內蒙鄂爾多斯市表現增殖和叢枝的柳樹進行了分子檢測和鑒定,并首次將中國柳樹植原體病害鑒定到16Sr VI組[8]。國內報道的柳樹植原體病害除叢枝、花變葉和增殖外,Wei等[9]報道的陜西柳樹植原體病害為典型的黃化癥狀。此外,Mou等[10]在云南省元謀縣發現了小葉柳(Salix tetradenia)叢枝與畸形。前期通過對新疆烏魯木齊、伊犁、五家渠、阿克蘇、和田、阿拉爾、巴州和喀什等地區調查發現,柳樹花變葉和叢枝在新疆各地州普遍發生。本研究擬通過分子生物學手段鑒定新疆柳樹花變葉病病原,利用16S r RNA 和tuf基因一致性分析,構建系統發育樹將其分類到亞組水平,并分析不同地區柳樹花變葉植原體16S r RNA 基因的差異性,以期為柳樹植原體病害防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

采自和田市、阿拉爾市、喀什莎車縣、克州阿圖什市、巴州輪臺縣、阿克蘇溫宿縣和圖木舒克市的表現花變葉和叢枝癥狀的柳樹。取發病枝條韌皮部,經滅菌水處理后,吸水紙吸干水分,自封袋分裝后置于-80 ℃冰箱,備用。陽性對照棗瘋病(‘Jujubew Witches’-broom Phytoplasma)樣品,由山東省果樹研究所高瑞副研究員提供。Taq DNA Polymerase、d NTPs(2.5 mmol/L)和10×PCR buffer購自北京全式金生物技術有限公司,DNA Marker 2000、DiaSpin膠回收試劑盒及引物均購自上海生物工程有限公司。

1.2 DNA提取

取0.1～0.2 g柳樹韌皮部組織,采用CTAB法提取總DNA[11-12]。采用Thermo ND-2000微量分光光度計檢測DNA 濃度,瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 完整性,將檢測合格的DNA 置于-20 ℃保存,備用。

1.3 16Sr RNA和tuf 基因PCR擴增

植原體16Sr RNA 基因擴增采用Lee等[13]和Gundersen 等[14]所報道的植原體通用引物R16mF2/R16m R1和R16F2/R16R2分別進行直接PCR 和巢式PCR,tuf基因擴增采用Schneider等[15]報道的引物對f Tuf/r Tuf,引物序列如下(表1)。反應體系均為25μL,其中10×PCR buffer 2.5 μL、10 μmol/L 引物各1 μL、10 mmol/L d NTPs 1 μL、TaqDNA 聚合酶(5 U/μL)0.5μL、模板DNA 1μL。直接PCR 結束后,將PCR 產物稀釋30倍,取1μL 作為巢式PCR 模板。16Sr RNA 基因直接PCR 擴增反應條件為:94 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s;55 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min;共30個循環,最后72 ℃延伸10 min;巢式PCR 條件將退火溫度設為57 ℃,其他均與第一次擴增相同。

表1 PCR 引物Table 1 Primer of PCRs in this study

tuf基因PCR 擴增反應條件為:94℃預變性3 min;94 ℃變性30 s;55℃退火30 s,72℃延伸1 min;共35個循環,最后72 ℃延伸10 min。以健康的柳樹總DNA 為陰性對照,栆瘋病DNA 為陽性對照,無菌雙蒸水為空白對照。PCR 產物在0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測,觀察結果。

1.4 PCR產物純化及測序

使用瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒將目標條帶進行切膠回收后,送上海生物工程有限公司進行測序。

1.5 序列比對和虛擬RFLP分析

利用DNAStar Seq Man 軟件對獲得的序列進行校正及拼接后,提交到GenBank中獲得基因序列號。在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中對獲得的基因序列Blast在線比對獲得同源序列,通過MEGA7.0 軟件構建系統進化樹,Boot strap重復數為1 000[16]。利用植原體在線分類工具(iPhyClassifier(https://plantpathology.ba.ars.usda.gov/cgi-bin/reso-urce/iphyclassifier.cgi)對獲得的16S r RNA 序列進行相似性系數分析和虛擬RFLP分析[17]。

2 結果與分析

2.1 感病柳樹表現癥狀

柳樹在初春時期,枝條頂端未展開,多表現為叢枝癥狀(圖1-A～1-C);4 月花期,柳樹花序畸形,表現為花變葉,隨著其生長,后期形成不規則疙瘩形狀(圖1-D～1-F);7-8月由于高溫枝條頂部水分及營養物質供應不足,導致病部及以上部分枝條干枯(圖1-G)。

圖1 新疆柳樹花變葉和叢枝病表現癥狀Fig.1 Symptoms of willow phyllody and witches’-broom disease in Xinjiang

對新疆7個地區表現花變葉和叢枝的柳樹植株總DNA 經PCR 擴增后,1%瓊脂糖電泳檢測結果表明,利用引物對R16F2/R16R2 經巢式PCR 擴增到約為1.2 kb的16S r RNA 片段;引物對f Tuf/r Tuf經PCR 擴增得到約800 bp特異性條帶,dd H2O 空白對照與健康對照均為擴增出特異性條帶(圖2)。

圖2 柳樹花變葉植原體16S r RNA 和tuf 基因PCR 檢測結果Fig.2 PCR detection results of 16S rRNA and tuf gene of willow phyllody phytoplasma

2.2 16S r RNA序列比對及系統進化樹分析

經測序結果表明,來自7個地區柳樹病樣擴增得到的11條16S r RNA 基因片段長為1 235～1 240 bp,將序列提交到GenBank登錄號分別為:MW411190、MW411193～MW411201、MW390640。利用Meg Align軟件對7個地區白柳花變葉植原體16S r RNA 基因序列一致性比較發現,G+C含量為45.6%,序列一致性為99.4%～100.0%(表2)。BLAST 分析表明,柳樹花變葉植原體16S r RNA 序列與榆樹黃化組(EY)植原體文冠果叢枝(‘Xanthoceras sorbifolia’Bunge witches’-broom phytoplasma,GenBank Accession No.KC331045)和桃黃化(‘Prunus persica’yellows phytoplasma,Accession No.KF523370)同源性為99.76%。初步確定柳樹花變葉植原體屬于16Sr V 組。系統進化樹顯示,柳樹花變葉植原體與榆樹黃化組(16Sr V)組植原體聚為一枝,親緣關系最近,進一步確定該植原體為16Sr V 組成員(圖3)。

圖3 基于新疆柳樹花變葉植原體16S r RNA(左)和tuf 基因(右)序列以及相關植原體株系構建系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S r RNA(left)and tuf (right)gene sequences of willow phyllody phytoplasma from Xinjiang and other related phytoplasma

表2 利用MegAlign對7個地區11條16S rRNA 序列一致性的分析Table 2 Analysis of sequence identity of eleven 16S r RNA in seven regions by use of MegAlign%

2.3 tuf 基因序列比對及系統進化樹分析

從和田白柳、龍爪柳、阿拉爾白柳和阿克蘇龍爪柳病樣中PCR 擴增出的4個tuf基因片段經測序得到824 bp的序列,GenBank登錄號分別為MW435399～MW435402。將該序列與NCBI數據庫的同源序列進行比對,結果表明,該序列與棗瘋病(GenBank 登錄號:GU137287)的tuf基因序列相似性為98.3%,采用鄰近法構建系統進化樹表明,柳樹花變葉植原體tuf基因序列與榆樹黃化組植原體聚為一枝,與中國櫻桃黃化致死(GenBank登錄號:KJ452549)親緣關系最近,屬于榆樹黃化組(EY)的tufV-B亞組。

2.4 16S r RNA虛擬RFLP分析

柳樹花變葉植原體16S r RNA 虛擬RFLP分析結果表明,該植原體16S r RNA 基因片段的限制性片段長度多態性與棗瘋病株系(Gen Bank登錄號:AB052876)有99.8%的相似性,虛擬RFLP模式與16Sr V-B亞組的參考模式相同,相似系數為1.00。進一步證明柳樹花變葉植原體為16Sr V-B亞組成員。

3 討論

本研究以在新疆發現的表現出叢枝和花變葉的柳樹為材料,通過16S r RNA 基因和tuf基因進行PCR 擴增、構建系統進化發育樹以及16S r RNA 虛擬RFLP分析,結果顯示,在新疆地區發現的柳樹花變葉屬于植原體病害16Sr V-B 亞組成員。

柳樹在新疆分布廣泛,品種較多。作為園林綠化和園藝觀賞樹種,對干旱地區防風固沙和水土保持有重要作用。近年來,柳樹植原體病害在國內外不斷被發現并報道,云南、陜西、內蒙、甘肅和新疆均已見報道,分別屬于16SrΙ-B、16SrΙ-C和16Sr VI-A 組,引起癥狀有黃化、小葉、叢枝、增殖和花變葉[18-20]。伊朗和印度也發現該病害,研究人員報道該病害與植原體有關[21-23]。這是首次報道柳樹花變葉病害與16Sr V-B 亞組植原體有關。

1992年王純利等[5]首次報道新疆柳樹植原體病害,并將其命名為柳樹叢枝病;朱天生[6]在山東對柳樹植原體病害進行了報道,將其命名為柳樹花變葉植原體;魏婷等[18]在陜西報道的柳樹植原體病害癥狀主要表現為黃化;自1992以來,該病害在新疆各地區不斷被發現,其發病不斷加重。Luan等[20]在2005 年對新疆柳樹花變葉植原體病害進行了調查,結果顯示,喀什及阿克蘇地區發病率達到60%,和田及阿拉爾地區近50%,巴州地區近10%。該病害在新疆不同地區、不同柳樹品種上發病程度有所差異,嚴重者則樹體頂枯,但尚未發現有整株死亡現象。植原體感染柳樹后,部分柳樹在不同時期癥狀表現也不同,如白柳,春季有花變葉、叢枝癥狀混合發生,夏秋兩季多表現為叢枝癥狀。經過研究發現,花變葉和叢枝癥狀植原體16S r RNA 和tuf基因序列間無差異,這與植原體能引起寄主植物多種癥狀的特性相符。但這是否與其他功能基因有關,仍需進一步研究。該病害自發現以來,一直未見其傳播介體的報道。由于其分布廣,防治困難,再考慮到柳樹的經濟效益較低,因此,該病害的研究較為滯后,目前亟待有效控制該病害的措施,以控制該病害傳播,減少林業損失。