結腸癌中鐵死亡相關蛋白GPX4的表達及其與預后的相關性

藍煒強，陳光文，楊依昂，周香圓，吳海波，章毓廳，孫紫洋，2,3，金 玉，2,4，樸俊杰，2,3

鐵死亡(ferroptosis)是近年來新發現的，區別于細胞凋亡和細胞自噬的一種程序性死亡方式[1]。細胞鐵死亡過程伴隨著大量鐵離子的累積和脂質過氧化[2]。近年來，越來越多的研究證實鐵死亡相關蛋白在腫瘤的發生、發展中起重要作用，被認為可預測多種腫瘤的預后，如FTH1[3]、NCOA4[4]、SLC7A11[5]、HMOX1[6]等。GPX4屬于磷脂過氧化氫谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GPX)，是鐵死亡的關鍵蛋白之一[7]。GPX4蛋白在細胞中具有清除脂質過氧化物的作用，GPX4失活可導致氧化平衡被打破，脂質過氧化物破壞膜結構，從而激發鐵死亡[8]。有研究[9]顯示GPX4與腫瘤的發生、發展密切相關，在乳腺癌[10]、淋巴瘤[11]、肝癌[12]等腫瘤中GPX4蛋白表達高于正常組織。目前尚未見GPX4表達與結腸癌患者預后關系的研究報道。本文采用免疫組化SP法檢測GPX4在結腸癌及癌旁正常組織中的表達及其與臨床病理特征和預后的關系，探討GPX4蛋白及GPX4和GNL3蛋白的聯合作用在結腸癌患者預后中的臨床價值。

1 材料與方法

1.1 臨床材料人類結腸癌組織芯片購自上海芯超生物公司。該芯片有149個位點，包括82例原發結腸癌標本和67例癌旁標本。82例結腸癌中，男性40例，女性42例；患者年齡27～90歲，其中年齡<60歲25例，≥60歲57例；依據國際AJCC分期標準：Ⅰ+Ⅱ期51例，Ⅲ+Ⅳ期31例；有淋巴結轉移者30例，無淋巴結轉移者52例；有遠處轉移者4例，無遠處轉移者78例。82例結腸癌患者手術時間為2007年6月至2008年4月，并對所有患者進行隨訪，每3個月進行電話隨訪1次，隨訪截至2015年7月。

1.2 總RNA提取和qRT-PCR實驗8例新鮮結腸癌和癌旁正常組織由延邊大學醫學院腫瘤組織庫提供。組織樣品置于研缽磨中磨碎，利用TRIzol等試劑提取組織中的總RNA。采用PrimeScriptTM RT Master Mix試劑盒反轉錄為cDNA。以β-actin為內參，利用SYBR qPCR Master Mix試劑盒檢測GPX4基因表達情況。GPX4引物序列如下GPX4-F：5′-GAGGCAAGACCGAAGTAAACTAC-3′；GPX4-R：5′-CCGAACTGGTTACACGGGAA-3′。反應程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s(合計40個循環)，利用2-ΔΔCt法計算各樣本mRNA的相對表達量。

1.3 免疫組化免疫組化染色采用SP法。組織芯片60 ℃烤箱脫蠟，常溫烘干，二甲苯脫蠟，PBS洗3次；應用檸檬酸鹽高溫修復抗原，BSA封閉，PBS洗3次；3%過氧化氫封閉內源性過氧化物酶的活性；加入一抗GPX4(稀釋比1∶100，Proteintech，美國)4 ℃孵育過夜；加入二抗(北京中杉金橋公司)37 ℃孵育20 min，PBS洗3次；滴加DAB顯色劑，蘇木精復染，脫水、透明、封固。

1.4 結果判定邀請3位病理學專家分別評估結腸癌組織中GPX4蛋白表達水平：(1)以細胞質中出現褐色顆粒視為GPX4蛋白陽性；(2)根據陽性染色強度按未著色、淡褐色、褐色、棕褐色分成4個等級，分別判為0、1、2、3分；(3)將陽性面積占比按≤5%、6%～25%、26%～50%、51%～75%、>75%分成5個等級，分別判為0、1、2、3、4分。將兩項評分相乘記為總評分：0～3分為陰性(-)，4～6分為弱陽性(+)，7～9分為陽性()，10～12分為強陽性()。

1.5 細胞培養結腸癌細胞SW620由延邊大學腫瘤研究中心組織庫提供。SW620細胞常規培養于含10%胎牛血清、10 μg/mL鏈霉素和100 μg/mL青霉素的DMEM培養液，于5%CO2、37 ℃細胞培養箱中培養，隔2天換液，34天傳代。

1.6 Western blot法應用Western blot實驗檢測SW620細胞敲低GNL3后GPX4和GNL3蛋白的表達。RIPA裂解液裂解細胞，BCA法測定蛋白濃度。變性，上樣，SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉膜。5%牛奶封閉2 h，一抗孵育過夜。TBST洗膜，二抗孵育1 h。加入ECL化學發光液，凝膠成像儀曝光。

1.7 慢性毒轉染將SW620細胞按1×105個/孔接種到24孔板，過夜。第2天，用2 mL含6 mg/L polybrene的新鮮培養液替換原培養基，并加入適量慢病毒懸液。培養24 h后，用新鮮培養基替換，繼續培養72 h后，進行沉默效率的驗證。

1.8 統計學方法采用SPSS 26.0軟件對數據進行統計學分析，采用χ2檢驗計算分類變量的組間差異，運用Kaplan-Meier法和Cox回歸模型進行生存分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結腸癌組織中GPX4 mRNA的表達GEO數據庫(GSE74604)分析結果顯示：結腸癌組織中GPX4 mRNA表達水平高于癌旁組織(圖1A)。qRT-PCR檢測8例結腸癌組織及癌旁組織中GPX4 mRNA的表達，結果顯示結腸癌組織中GPX4 mRNA表達普遍高于癌旁組織(圖1B)。

圖1 結腸癌及癌旁組織中GPX4 mRNA的表達：A.GEO數據庫分析結腸癌組織中GPX4 mRNA的表達；B.qRT-PCR檢測結腸癌及癌旁組織中GPX4 mRNA的表達

2.2 結腸癌組織中GPX4蛋白的表達免疫組化結果顯示GPX4蛋白在結腸癌組織中主要定位于細胞質(圖2)。GPX4蛋白在結腸癌組織中的陽性率和強陽性率分別為91.5%(75/82)和43.9%(36/82)；在癌旁組織中的陽性率和強陽性率分別為32.8%(22/67)和3.0%(2/67)，差異均有統計學意義(P<0.01，圖2，表1)。以上結果說明，GPX4蛋白在結腸癌組織中的表達高于癌旁組織。

圖2 結腸癌及癌旁組織中GPX4蛋白的表達，SP法：A.GPX4蛋白在癌旁組織中呈陰性；B.GPX4蛋白在結腸癌組織中呈弱陽性；C.GPX4蛋白在結腸癌組織中呈陽性；D.GPX4蛋白在結腸癌組織中呈強陽性

表1 不同結腸組織中GPX4蛋白的表達

2.3 結腸癌中GPX4蛋白表達與臨床病理特征的關系結腸癌組織中GPX4蛋白表達與患者性別、年齡、病理分級、AJCC分期、淋巴結轉移、遠處轉移(χ2=0.610，P=0.627)均無相關性(P>0.05)。GPX4蛋白在腫瘤直徑≤6 cm和>6 cm結腸癌組織中的強陽性率分別為55.3%和31.0%，差異有統計學意義(P<0.05，表2)。

表2 結腸癌中GPX4蛋白表達與臨床病理特征的關系[n(%)]

2.4 GPX4蛋白表達與結腸癌患者生存率的關系Kaplan-Meier生存分析顯示：GPX4蛋白強陽性結腸癌患者的總生存率顯著低于GPX4蛋白非強陽性患者(P=0.03，圖3)。為進一步探尋GPX4蛋白表達對結腸癌患者預后的影響，分別將結腸癌浸潤深度、病理分級、遠處轉移情況分成亞組進行生存分析，結果顯示在浸潤深度T1～3、病理分級Ⅱ～Ⅳ、無遠處轉移亞組中GPX4蛋白強陽性者預后較非強陽性者差，差異有統計學意義(P<0.05，圖3)。

圖3 結腸癌中GPX4蛋白表達與患者生存率的關系：A.GPX4表達與結腸癌患者總生存率之間的關系；B.浸潤深度pT1～3結腸癌中GPX4表達與患者生存率的關系；C.病理分級Ⅱ～Ⅳ結腸癌中GPX4表達與患者生存率的關系；D.無遠處轉移結腸癌中GPX4表達與患者生存率的關系

單因素Cox回歸分析顯示：GPX4蛋白強陽性(P=0.035)、浸潤深度T4(P=0.001)、淋巴結轉移(P=0.001)、遠處轉移(P=0.002)、AJCC分期Ⅲ+Ⅳ期(P<0.001)是影響結腸癌患者預后的危險因素(表3)。將上述有統計學意義的因素進行多因素Cox回歸分析，結果顯示GPX4蛋白強陽性(P=0.019)和浸潤深度T4(P=0.035)是結腸癌患者預后的獨立影響因素(表3)。

表3 單因素和多因素Cox回歸分析結腸癌患者預后的風險因素

2.5 聯合評估GPX4與GNL3蛋白表達對結腸癌患者預后的預測作用χ2檢驗結果顯示結腸癌組織中GPX4蛋白表達與GNL3蛋白表達呈正相關(χ2=4.367，P=0.037，表4)。Western blot實驗結果顯示：在SW620細胞中敲低GNL3表達可誘導GPX4蛋白表達減少(圖4)。Kaplan-Meier生存分析結果顯示：GPX4和GNL3均強陽性患者的生存率低于GPX4強陽性、GNL3非強陽性患者(P=0.007，圖5)。

圖4 Western blot法檢測敲低GNL3后GPX4蛋白表達的改變

圖5 GPX4和GNL3表達水平與結腸癌患者生存率的關系

表4 結腸癌組織中GPX4與GNL3蛋白表達的相關性

3 討論

結直腸癌是全球常見的惡性腫瘤，其發病率及病死率與日俱增[13]。結直腸癌常用的治療方式為手術治療，術后輔以放、化療，然而疾病治療的前提是早期準確診斷[14]。結腸癌的腫瘤標志物在結腸癌的診斷中具有重要意義。腫瘤標志物是在腫瘤細胞或細胞膜表面，或機體對腫瘤的免疫反應產生，分泌或釋放到人體體液或組織中的物質[15]。腫瘤標志物在腫瘤患者的早期診斷、制定治療計劃、預后評估、復發監測等方面具有重要的參考價值[16]。因此，尋找有效的腫瘤標志物是提高結腸癌患者生存率的重要途徑。

GPX4是GPX的亞型之一，相比其他亞型，GPX4的作用是將脂質氫過氧化物還原為無毒脂質醇，從而限制了脂質過氧化物在細胞膜內的傳播，具有特異性催化細胞膜脂質過氧化物降解的能力[17-18]。有研究表明，GPX4在腫瘤的發生、發展中起重要作用，如Peng等[19]發現GPX4通過調控活性氧(reactive oxygen species, ROS)影響腫瘤上皮-間質轉化過程。此外，GPX4還可以通過介導非小細胞肺癌的鐵死亡過程來降低其對放療的耐藥[20]。除了通過調節鐵死亡，GPX4還可以通過維持腫瘤干細胞特性，進而促進肺腺癌及胰腺癌的增殖和轉移能力[18-19]。說明GPX4在多種惡性腫瘤的發生發展、侵襲轉移等過程中發揮著關鍵作用。

本實驗采用免疫組化法檢測82例結腸癌組織和67例癌旁組織中GPX4蛋白表達，結果發現GPX4蛋白在結腸癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，且其表達與結腸癌腫瘤直徑密切相關，這一發現與最近其它研究結果一致。例如，王首寒等[21]發現，與正常胃組織相比，胃癌組織中GPX4表達增加；Zhao等[22]同樣發現GPX4蛋白在膠質瘤中異常高表達。Kinowaki等[11]報道GPX4過表達可抑制ROS介導的腫瘤細胞死亡。眾所周知，腫瘤細胞因其代謝活躍，產生大量的代謝產物及氧化物，而GPX4高表達有利于腫瘤細胞應對氧化應激，使得癌細胞增殖能力增強，抵抗凋亡，進而促進疾病的發展。生存分析結果顯示，GPX4蛋白強陽性患者的生存率與GPX4蛋白非強陽性患者相比明顯降低，提示GPX4蛋白高表達與結腸癌患者預后不良有關。另外，有學者發現GPX4能夠與mTOR信號通路相互作用[23]，然而該通路是否在結腸癌中發揮調控作用有待進一步探究。

GNL3是一種多功能蛋白，在細胞自我更新、細胞增殖、凋亡、維持細胞基因組穩定性和端粒完整性等多種細胞生物學功能中發揮重要作用。本實驗發現GPX4蛋白表達水平受GNL3蛋白的調控，說明GPX4、GNL3蛋白在結腸癌中共同作用參與調控腫瘤的發生、發展。另外，結腸癌組織中GPX4表達異常增高可能與GNL3蛋白的異常表達有關。然而，GNL3通過何種途徑調控GPX4蛋白表達，以及兩者在結腸癌中的具體作用機制有待進一步探究。

綜上，GPX4高表達與結腸癌的發生發展及不良預后密切相關，GPX4可作為結腸癌潛在的分子標志物以及預后評估指標。然而，GPX4在結腸癌中的分子機制尚未明確，有待進一步深入探究。