三陰型乳腺癌中Galectin-9和FGL1的表達及意義

蔡小波，王小佩，曹學全，楊朝暉

乳腺癌是影響女性健康的常見疾病[1]，隨著乳腺癌診療水平的提高，患者生存期明顯提高，但一些特殊類型亞型如三陰型乳腺癌(triple-negtive breast cancer, TNBC)，預后不佳[2]。腫瘤免疫治療已成為惡性腫瘤治療的重要手段之一[3]。PD-1藥物在TNBC治療中展現了積極的治療效果[4-5]。但PD-1/PD-L1在TNBC患者中的陽性率低，約20%[6]。因此，探索新的免疫逃逸通路及調控路徑，有望增強免疫治療在TNBC治療中的效果。

研究發現，FGL1/LAG-3是另一條腫瘤免疫逃逸通路[7]，阻斷該通路可刺激腫瘤微環境中T細胞的活化和增殖來提高機體對腫瘤的免疫與清除。Galectin-9/Tim-3通路能增加效應性T細胞的抗腫瘤免疫功能[8]。然而，上述通路在TNBC中的研究報道較少，因此，檢測TNBC中Galectin-9和FGL1的表達情況，有助于為TNBC的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 一般資料選取2016年1月～2019年12月臺州市中心醫院(臺州學院附屬醫院)行手術治療的108例TNBC患者，同時選取108例非TNBC患者作為對照。以上患者臨床資料均完整，符合入組標準。

1.2 方法通過生物信息學數據庫TIMER檢索Galectin-9、FGL1在乳腺癌中的表達及免疫浸潤狀態。收集上述標本，提取組織總RNA，經逆轉錄后熒光定量PCR檢測Galectin-9、FGL1的mRNA表達水平。免疫組化染色采用EnVision法，經BENCHMARK平臺(Roche公司)檢測Galectin-9和FGL1的蛋白表達水平。抗體Galectin-9購自Cell Signaling Technology公司，FGL1購自Abcam公司，二抗及顯色試劑購自Roche公司。Galectin-9和FGL1陽性結果判讀參照文獻[9-10]。免疫組化結果經兩位病理醫師獨立閱片和診斷，綜合判定結果。收集上述患者的臨床資料，分析Galectin-9、FGL1表達水平與臨床病理特征的相關性。

1.3 觀察指標(1)觀察Galectin-9、FGL1在免疫浸潤中的調節模式；(2)對比各組Galectin-9、FGL1 mRNA和蛋白的表達差異情況；(3)觀察Galectin-9、FGL1蛋白表達與臨床病理特征的相關性。

1.4 統計學分析所有數據采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 生物信息學分析TCGA數據庫檢索結果顯示，Galectin-9(圖1A)和FGL1(圖1B)在乳腺癌中均呈高表達。Galectin-9表達與B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和中性粒細胞呈正相關，FGL1表達與B細胞、CD4+T細胞、樹突狀細胞呈負相關，與CD8+T細胞、巨噬細胞和中性粒細胞呈正相關(圖2)。

圖1 TCGA數據庫分析乳腺癌中Galectin-9(A)和FGL1(B)的表達水平

圖2 乳腺癌中Galectin-9(A)和FGL1(B)的免疫浸潤水平

2.2 TNBC組織和非TNBC組織中Galectin-9、FGL1的表達TNBC組中Galectin-9、FGL1 mRNA陽性率分別為55.55%和26.85%，與正常組織相比差異有統計學意義(P<0.05)，非TNBC組中Galectin-9、FGL1 mRNA陽性率分別為47.22%和12.96%，與正常組織相比差異有統計學意義(P<0.05)。

TNBC組Galectin-9在腫瘤細胞和間質腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocyte, TIL)中的陽性率分別為50.93%、52.78%；FGL1在腫瘤細胞和間質TIL中的陽性率分別為27.78%、30.56%。非TNBC組Galectin-9在腫瘤細胞和間質TIL中的陽性率分別為39.81%、38.89%，FGL1在腫瘤細胞和間質TIL中的陽性率分別為14.81%、13.89%。TNBC組相對非TNBC組Galectin-9、FGL1表達水平更高(表1，圖3)。

圖3 A.Galectin-9在正常乳腺組織中的表達，EnVision法；B.Galectin-9在TNBC中的表達，EnVision法；C.Galectin-9在非TNBC中的表達，EnVision法；D.FGL1在正常乳腺組織中的表達，EnVision法；E.FGL1在TNBC中的表達，EnVision法；F.FGL1在非TNBC中的表達，EnVision法

表1 TNBC組織和非TNBC組織中Galectin-9、FGL1蛋白的表達[n(%)]

相關性分析結果顯示，TNBC腫瘤細胞和間質TIL中Galectin-9表達與患者年齡、腫瘤直徑和腫瘤分化程度無關(P>0.05)，與組織學分級和淋巴結轉移相關(P<0.05)；TNBC腫瘤細胞和間質TIL中FGL1表達與患者年齡和腫瘤分化程度無關(P>0.05)，與腫瘤直徑、組織學分級、淋巴結轉移相關(P<0.05，表2)。

表2 TNBC中Galectin-9及FGL1在腫瘤細胞和間質TIL中的表達及與臨床病理特征的關系

在組織學類型中，統計標本有浸潤性導管癌、浸潤性小葉癌和浸潤性微乳頭癌三種類型，在非TNBC組中，Galectin-9和FGL1表達與組織學類型無關(P>0.05)，且各組間相比差異無統計學意義(P>0.05，表3)。Galectin-9和FGL1在TNBC浸潤性導管癌和非TNBC浸潤性導管癌中的表達差異有統計學意義(P<0.05)，而在浸潤性小葉癌和浸潤性微乳頭癌中差異無統計學意義(P>0.05，表4)。

表3 Galectin-9及FGL1在非TNBC不同組織學類型中的表達

表4 Galectin-9及FGL1在TNBC和非TNBC不同組織學類型中的表達

3 討論

乳腺癌中TNBC占乳腺癌腫瘤的10%～20%，因其缺乏明確的靶向治療位點，進而影響患者的生存期[11]。隨著乳腺癌精準治療和分子分型的研究推進，目前認為TNBC可以分為4個亞型，分別為免疫調節型(mmunomodulatory, IM)、腔面雄激素受體型(luminal androgen receptor, LAR)、基底樣免疫抑制型(basal-like immune-suppressed, BLIS)和間質型(mesenchymal, MES)，其中IM亞型間質TIL顯著增多，具有高免疫原性特性，具有腫瘤免疫治療的應用前景，并且能夠對腫瘤免疫有效應答[12]。

腫瘤免疫治療是TNBC的一個突破口，近年來，通過阻斷PD-1/PD-L1通路來調節機體免疫狀態，抑制免疫逃逸的“免疫正常化”[13]治療策略，已經成功的在非小細胞肺癌、黑色素瘤、腎細胞癌、霍奇金淋巴瘤等疾病中開展臨床治療。針對TNBC的PD-1/PD-L1研究和聯合治療等策略[14]，已經有多項策略在臨床試驗中開展，并獲得積極進展。PD-1/PD-L1在TNBC中存在陽性率低，部分陽性患者應答效率低等問題，因此針對陰性患者尋找新的免疫抑制逃逸通路和對于應答效率低的陽性患者尋找具有協同作用的免疫通路，值得進一步研究。

Tim-3是一類T細胞表面抑制性分子，能夠引起T細胞衰竭，其中一個配體為Galectin-9[15]。Tim-3在腫瘤T細胞的損耗中起關鍵作用。協同抑制PD-1/PD-L1和Tim-3/Galectin-9通路能夠較好的糾正T細胞的耗竭狀態，并能夠增加效應性T細胞的抗腫瘤免疫功能，且Tim-3與抗PD-1治療的藥物耐藥緊密相關[16]，提示Galectin-9可以作為和PD-L1的有效協同靶點。FGL1/LAG-3是目前新發現的另一條腫瘤免疫逃逸通路[17]，阻斷該通路能夠刺激腫瘤微環境中T細胞的活化和增殖[18]。LAG-3是一個在活化T細胞上發現的跨膜蛋白[19]。LAG-3主要功能為作為受體傳遞抑制性信號[20]。FGL1是LAG3的一個功能性配體。FGL1表達上調與腫瘤的進展及預后不佳相關，在胃癌[21]和肝癌[22]中均見相關報道。上述研究結果表明，FGL1在腫瘤的發生、進展中起重要作用。進一步研究發現，FGL1/LAG-3相互作用是獨立于PD-1/PD-L1通路的另一條腫瘤免疫逃逸通路。FGL1/LAG-3有望成為TNBC中繼PD-1/PD-L1后的另一個治療靶點。

目前臨床研究主要集中于FGL1和Galectin-9的受體LAG-3和Tim-3，當前針對LAG-3和Tim-3靶點的藥物尚未上市，但相應涉及黑色素瘤、血液腫瘤和實體瘤等臨床研究，分別有臨床Ⅰ～Ⅲ期不同階段的研究開展。BMS公司[23]和默沙東公司[24-25]的LAG-3抗體在各種實體瘤中開展臨床研究，有部分已經展示了治療潛力。Tim-3抗體目前已在肺癌、肝癌、胃癌、前列腺癌等多項實體瘤中展開研究，Cobolimab為全球開發階段最高的Tim-3抗體，與PD-1抗體聯用可明顯抑制腫瘤發展[26]。相比于PD-1/PD-L1，以LAG-3和Tim-3為靶點的藥物開發尚屬早期，但均展現了客觀的治療效果，因此其受體在腫瘤中表達情況的研究，尤其是在TNBC等報道較少領域的研究，有助于推進FGL1/LAG-3和Galectin-9/Tim-3靶點藥物的研究。

本實驗中，Galectin-9和FGL1在TNBC中顯著高表達，其mRNA和蛋白水平陽性率分別為55.55%、50.93%和26.85%、27.78%，在間質TIL中同樣具有相同趨勢的表達[27]。與臨床病理相關指標研究表明，其與組織學分級、淋巴結轉移等存在相關性，提示Galectin-9和FGL1可能是TNBC的有效靶點之一。經TIMER數據庫[28]檢索腫瘤組織中的6種免疫細胞的浸潤情況[29]表明，Galectin-9與FGL1的免疫浸潤模式存在不同，這或許與Galectin-9和FGL1與PD-L1的表達模式不同存在相關性，值得后續進一步探究。而在組織學類型中，Galectin-9和FGL1在TNBC和非TNBC浸潤性導管癌中的表達差異有統計學意義，在浸潤性小葉癌和浸潤性微乳頭癌中的表達差異無統計學意義。但由于浸潤性小葉癌和浸潤性微乳頭癌病例數限制，還有待進一步研究。

綜上，在分子及蛋白表達水平上，TNBC組與非TNBC組均高表達Galectin-9與FGL1，提示針對TNBC的治療具有潛在的前景，有可能在TNBC的免疫治療中產生積極的效果，相關后續研究深入探究其相互作用，并深入分析各TNBC亞型中Galectin-9與FGL1的表達情況，有望對TNBC患者的免疫治療產生積極作用。