芍藥ACS基因的克隆及其蛋白質(zhì)原核表達

肖士奎，李 芳，張文婷，呂淑芳，史國安，吳 疆，范丙友

(1.河南科技大學 農(nóng)學院，河南 洛陽 471023；2.中機十院國際工程有限公司，河南 洛陽 471003;3.榆林學院 信息工程學院，陜西 榆林 719000)

芍藥(PaeonialactifloraPall.)為芍藥科芍藥屬多年生草本植物，兼具觀賞和藥用價值[1]。“維士與女，伊其將謔，贈之以芍藥”出自《詩經(jīng)·國風·鄭風·溱洧》，這表明芍藥作為中國的“愛情花”，至少已有超過3 000 a的栽培歷史[2]。芍藥花色豐富，花型嬌美，花梗長而挺直，因而非常適宜作切花應用[1]。芍藥切花主要應用于婚禮和宴會等場合，目前全球已有50多個國家在開展芍藥切花生產(chǎn)。

桃花飛雪是我國傳統(tǒng)的芍藥品種，花型皇冠型，中花品種，花初開桃紅色、盛開后變粉，花量大、花期長、形態(tài)嬌美，是優(yōu)良的切花品種[3]。因瓶插期相對較短，影響了其商業(yè)開發(fā)價值。花瓣是該品種切花內(nèi)源乙烯釋放的主要器官，花瓣的乙烯釋放速率具有明顯的躍變峰，暗示乙烯在切花衰老進程中發(fā)揮重要作用；花瓣乙烯釋放的快速增加誘發(fā)了呼吸躍變的發(fā)生，進而啟動整個開花和衰老進程[4]。芍藥切花品種班可海爾和楊妃出浴也對乙烯敏感，外源乙烯處理后乙烯生物合成及信號轉(zhuǎn)導途徑中有多個基因上調(diào)[5]。

作為植物體內(nèi)唯一的氣體植物激素，乙烯參與種子萌發(fā)、幼苗生長、果實成熟、葉片和花瓣衰老及脫落等生長發(fā)育進程[6]。通過一系列精巧的試驗，乙烯的生物合成途徑已被詳盡地闡明[7]。在乙烯生物合成途徑中，1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid(ACC)synthase，ACS)，以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)為底物催化生成了乙烯生物合成的直接前體ACC[8]。目前，已從擬南芥(Arabidopsisthaliana)[9]、月季(Rosahybrida)[10]、牡丹(Paeoniasuffruticosa)[11-12]、文心蘭(OncidiumGower ramsey)[13]和無花果(FicuscaricaLinn.)[14]等高等植物中分離出編碼乙烯生物合成關(guān)鍵酶ACS的基因序列，但芍藥ACS基因尚未見報道。因而，基于cDNA末端快速擴增(Rapid amplification of cDNA ends，RACE)技術(shù)克隆了芍藥PlACS基因cDNA序列，對其進行了生物信息學分析，構(gòu)建了PlACS基因的原核表達載體并建立了PlACS重組蛋白的高效原核表達體系，以期為后續(xù)該基因的生物學功能和分子機制研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

芍藥桃花飛雪花瓣采自河南科技大學芍藥園，液氮速凍后帶回實驗室保存于-80 ℃冰箱備用。原核表達載體pET-32a及宿主菌大腸桿菌BL21(DE3)保存于牡丹種質(zhì)創(chuàng)新與精深加工河南省工程實驗室。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、DNA 連接試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、克隆載體 pMD18-T、TaqDNA 聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅱ、蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準(低)均購自大連寶生物公司；高保真KOD-Plus DNA聚合酶為日本TOYOBO公司產(chǎn)品；其余試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.2 PlACS基因全長cDNA的克隆

根據(jù)芍藥近緣物種ACS蛋白的保守區(qū)設計簡并引物PlACS-F和PlACS-R(表1)，用于擴增芍藥ACScDNA保守區(qū)。基于ACS基因保守區(qū)測序結(jié)果，設計5′-RACE和3′-RACE引物PlACS-5′-1st和PlACS-3′(表1)，分別與SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit(TaKaRa，大連)自帶引物UPM配對使用。以CTAB-LiCl法[15]提取桃花飛雪盛花期花瓣總RNA，按照RACE試劑盒說明書進行第1鏈cDNA合成及5′-RACE和3′-RACE擴增。由于5′-RACE第1輪擴增條帶模糊，因而設計了5′-RACE第2輪擴增引物PlACS-5′-2nd，與試劑盒自帶引物NUP配對使用，以5′-RACE第1輪擴增產(chǎn)物為模板進行第2輪5′-RACE擴增。將克隆測序的PlACS保守序列、3′-RACE擴增產(chǎn)物和5′-RACE第2輪擴增產(chǎn)物拼接后，得到芍藥PlACS基因全長的cDNA序列，并對拼接序列進行ORF預測(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3PlACS基因編碼蛋白質(zhì)的生物信息學分析

應用Protparam軟件(https://web.expasy.org/protparam/)進行蛋白質(zhì)物理化學特性分析；應用ProtScale軟件(https://web.expasy.org/protscale/)進行疏水性分析；應用PSORT(https://www.genscript.com/psort.html)進行亞細胞定位預測；應用TMHMM(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)分析跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域；應用SignalP(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)進行信號肽分析；應用NetPhos(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1)預測磷酸化位點。

應用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)；應用SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)同源建模方法進行3D結(jié)構(gòu)預測。

應用DNAMAN 7.0軟件進行氨基酸序列比對分析；利用MEGA 5.0軟件的Neighbor-Joining進行ACS的分子系統(tǒng)進化樹構(gòu)建，并用Bootstrap法(重復1 000次)對構(gòu)建的進化樹進行評估。

1.4 PlACS基因CDS的亞克隆

基于PlACS的CDS序列和原核表達載體pET-32a的MCS位點序列，設計含酶切位點BamH Ⅰ和Hind Ⅲ的PCR引物(表1)，擴增得到PlACS的CDS。回收純化目的基因片段，連接至克隆載體pMD18-T，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。將質(zhì)粒PCR及BamH Ⅰ/Hind Ⅲ雙酶切鑒定的陽性克隆送至華大基因公司進行測序。

1.5 PlACS基因原核表達載體的構(gòu)建

用BamH Ⅰ/Hind Ⅲ對重組質(zhì)粒pMD18-T-PlACS和原核表達載體pET-32a進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收并純化目的基因片段和pET-32a載體，用DNA 連接試劑盒連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。將經(jīng)質(zhì)粒PCR及BamH Ⅰ/Hind Ⅲ雙酶切鑒定后的陽性重組子轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE)獲得基因工程菌。

1.6 IPTG誘導PlACS重組蛋白的表達

挑取1個PlACS基因表達工程菌的單菌落，接種在含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至A600達0.6，加入IPTG使其終濃度為0.6 mmol/L，誘導繼續(xù)培養(yǎng)4 h，收獲菌體用于SDS-PAGE電泳檢測。

1.7 PlACS重組蛋白高效表達體系的建立

為了建立芍藥PlACS重組蛋白原核高效表達體系，分別對基因工程菌菌體密度A600、IPTG濃度及表達時間等影響重組蛋白表達量的因素進行了單因素的優(yōu)化。

當基因工程菌菌體密度A600達0.1～1.1時，添加IPTG至終濃度為0.4 mmol/L，37 ℃誘導表達4 h后進行SDS-PAGE電泳檢測。

當基因工程菌菌體密度A600達0.6時，添加IPTG至終濃度分別達0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9 mmol/L。37 ℃誘導表達4 h后進行SDS-PAGE電泳檢測。

當基因工程菌菌體密度A600達0.6時，加入IPTG至終濃度為0.4 mmol/L誘導，分別在2，5，10，20，40 min及1，2，4 h各取出1.5 mL菌液用于SDS-PAGE電泳檢測。

1.8 PlACS重組蛋白表達形式分析

采用超聲波充分裂解37 ℃ IPTG誘導表達的基因工程菌，12 000 r/min離心20 min，分別收集細菌裂解上清液和沉淀用于SDS-PAGE電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 PlACS基因的克隆

應用高保真KOD-Plus DNA聚合酶擴增，成功獲得了PlACS基因保守區(qū)、3′-RACE和5′-RACE第1輪及第2輪PCR產(chǎn)物(圖1)。PCR產(chǎn)物經(jīng)加A后與T載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，獲得了陽性克隆。測序結(jié)果表明，PlACS保守區(qū)長576 bp，3′-RACE擴增產(chǎn)物長1 165 bp，5′-RACE擴增產(chǎn)物長895 bp；三者拼接后得到的PlACS基因全長cDNA為1 752 bp(GenBank登錄號為JX512359)，其5′-UTR長134 bp，3′-UTR長139 bp，CDS長1 479 bp，編碼492個氨基酸，其中含有51個帶負電荷的氨基酸殘基(D和E)和51個帶正電荷的氨基酸殘基(R和K)。

A.保守序列；B.3′-RACE；C.5′-RACE第1輪；D.5′-RACE第2輪。A.Conservative sequence；B.3′-RACE；C.5′-RACE round 1；D.5′-RACE round 2.

2.2 PlACS編碼蛋白質(zhì)的理化特性分析

蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預測分析結(jié)果顯示，PlACS蛋白分子式C2465H3835N673O717S26，分子質(zhì)量55.20 ku，理論等電點7.13，定位于細胞質(zhì)內(nèi)，不具有信號肽或跨膜結(jié)構(gòu)，不穩(wěn)定系數(shù)為43.78，總平均疏水性為-0.194，推測PlACS為親水性不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。經(jīng)NetPhos軟件分析，發(fā)現(xiàn)PlACS蛋白存在44個可能的磷酸化位點，其中26個位于絲氨酸(S)上，13個位于蘇氨酸(T)上，5個位于酪氨酸(Y)上(圖2)。

ATG.起始密碼子；TAA.終止密碼子；小寫字母.5′-UTR和3′-UTR；下劃線.可能的磷酸化位點。ATG.The start codon；TAA.The stop codon；The lowercase letters.5′-UTR and 3′-UTR;The underline.Possible phosphorylation sites.

2.3 ACS蛋白多序列比對

將PlACS(AFT92042)與牡丹ACS(PsACS，ABC69166)、蘋果(Malusdomestica)ACS(MdACS，AAB67989)、擬南芥ACS7(AtACS，NP_194350)和番茄(Solanumlycopersicum)ACS(SlACS，XP_010313742)進行蛋白質(zhì)多序列比對分析(圖3)，發(fā)現(xiàn)PlACS與牡丹ACS蛋白相似性最高達95.33%，暗示ACS蛋白在芍藥屬中可能較為保守。

PlACS蛋白序列中含有7個保守結(jié)構(gòu)域和保守活性位點K278，其中BOX5中含有保守的12肽基序SLSKDMGFPGFR，該基序為ACS結(jié)合底物SAM的位點，5′-磷酸吡哆醛結(jié)合位點氨基酸殘基為G128A129T130Y154N211Y242S275S277K278R286，形成同源二聚體界面的氨基酸殘基為G131T165H235G284F285R286T314L317(圖3)。

2.4 ACS蛋白分子系統(tǒng)進化分析

分子進化樹分析結(jié)果表明，PlACS和牡丹ACS的親緣關(guān)系最近，與葡萄(Vitisvinifera)和河岸葡萄(Vitisriparia)ACS親緣關(guān)系次之，而與蘋果、枇杷(Rhaphiolepisbibas)、歐洲甜櫻桃(Prunusavium)、李(Prunussalicina)、扁桃(Prunusdulcis)等薔薇科植物的ACS親緣關(guān)系相對較遠(圖4)。

2.5 PlACS蛋白二級和三級結(jié)構(gòu)分析

運用SOPMA軟件對PlACS蛋白二級結(jié)構(gòu)進行分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)存在α-螺旋(40.04%)、β-折疊(16.26%)、β-轉(zhuǎn)角(6.91%)和無規(guī)則卷曲(36.79%)4種二級結(jié)構(gòu)(圖5)。

以擬南芥ACS7蛋白結(jié)合5′-磷酸-l-氨基乙氧基乙烯基甘氨酸吡哆醛(Pyridoxal 5′-phosphate-l-aminoethoxyvinylglycine，PPG)的晶體結(jié)構(gòu)(7DLW)[16]為模型預測PlACS蛋白三維結(jié)構(gòu)，二者蛋白質(zhì)序列相似性為55.63%，預測PlACS寡聚體狀態(tài)為同源二聚體(圖6)。

紅色框.ACS蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；紅色箭頭.活性位點K278。Red box.Conservative domains of ACS proteins；Red arrow.Active site K278.

圖4 PlACS蛋白與其他物種ACS蛋白的系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of PlACS and previously reported ACS proteins

A.α-螺旋；B.β-折疊；C.β-轉(zhuǎn)角；D.無規(guī)則卷曲。A.α-helix；B.Extended strand；C.β-turn；D.Random coil.

2.6PlACS基因CDS的亞克隆

根據(jù)PlACS的CDS序列，設計含有BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位點的PCR引物，擴增獲得帶有酶切位點BamH Ⅰ和Hind Ⅲ的CDS片段(圖7-A)，純化回收后與T載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，質(zhì)粒PCR(圖7-B)和BamH Ⅰ/Hind Ⅲ雙酶切(圖7-C)鑒定獲得陽性重組子，測序結(jié)果表明，含有插入的BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位點，且編碼區(qū)與PlACS拼接序列CDS完全一致。

圖6 PlACS蛋白三級結(jié)構(gòu)預測Fig.6 The tertiary structure prediction of PlACS protein

A.PlACS基因CDS擴增；B.pMD18-T-PlACS重組質(zhì)粒PCR；C.pMD18-T-PlACS重組質(zhì)粒的BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切。A.Amplification of PlACS gene CDS；B.PCR identification of pMD18-T-PlACS；C.Double enzyme digestion of pMD18-T-PlACS by BamH Ⅰ/Hind Ⅲ.

2.7 pET32a-PlACS原核表達載體的構(gòu)建

用BamH Ⅰ/Hind Ⅲ酶切重組質(zhì)粒pMD18-T-PlACS和原核表達載體pET-32a，將目的基因片段與pET-32a空載體連接。經(jīng)轉(zhuǎn)化后，用含有BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位點的引物進行質(zhì)粒PCR檢測，得到與PlACS的CDS大小一致的條帶(圖8-A)；進一步用BamH Ⅰ/Hind Ⅲ對重組質(zhì)粒進行雙酶切，獲得2個條帶，其中大片段條帶為質(zhì)粒pET-32a載體骨架，小片段條帶為PlACS基因(圖8-B)。表明PlACS基因已成功插入到原核表達載體pET-32a中，將構(gòu)建好的PlACS基因原核表達載體轉(zhuǎn)化BL21(DE3)獲得基因工程菌。

2.8 PlACS重組蛋白的表達

與未誘導的陰性對照相比，基因工程菌經(jīng)IPTG誘導后表達出分子質(zhì)量約為60 ku的蛋白質(zhì)(圖9)，其分子質(zhì)量與理論計算值一致，表明PlACS重組蛋白表達成功。

A.PCR；B.BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切。A.PCR；B.Double enzyme digestion by BamH Ⅰ/Hind Ⅲ.

M.Protein Marker；1.IPTG未誘導；2.IPTG誘導。M.Protein Marker；1.Without induced by IPTG；2.Induced by IPTG.

2.9 PlACS重組蛋白高效表達體系的建立

當宿主菌A600為0.1～1.1時，添加終濃度為0.4 mmol/L的IPTG均能誘導出PlACS重組蛋白(圖10)，其中當A600介于0.2～1.1時，PlACS重組蛋白表達量較高。

當基因工程菌菌體密度A600達0.6時，添加終濃度為0.1～0.9 mmol/L的IPTG均能成功誘導PlACS

M.Protein Marker；1.未誘導；2—12.A600為0.1～1.1時誘導表達。M.Protein Marker；1.Without induced；2—12.Induced when A600 was 0.1—1.1.

重組蛋白的表達(圖11)。基于節(jié)約成本考慮，確定誘導劑IPTG濃度為0.1 mmol/L。

M.Protein Marker；1.未誘導；2～10.IPTG終濃度為0.1～0.9 mmol/L。M.Protein Marker；1.Without induced；2—10.The final concentration of IPTG was 0.1-0.9 mmol/L.

誘導時間與異源蛋白在大腸桿菌中的表達量關(guān)系密切。在加入誘導劑IPTG僅 2 min后，基因工程菌中即可檢測出PlACS重組蛋白，表明pET-32a載體上的T7啟動子對誘導劑IPTG非常敏感，反應迅速。當IPTG誘導2 h后其表達量趨于穩(wěn)定(圖12)，因此，誘導2 h左右即可收獲菌體。

M.Protein Marker；1.未誘導；2.2 min；3.5 min；4.10 min；5.20 min；6.40 min；7.1 h；8.2 h；9.4 h。M.Protein Marker；1.Without induced；2.2 min；3.5 min；4.10 min；5.20 min；6.40 min；7.1 h；8.2 h；9.4 h.

綜上所述，PlACS蛋白最佳誘導表達條件為：當基因工程菌菌體密度A600達0.2時，在菌液中加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，在37 ℃誘導2 h。

2.10 PlACS重組蛋白的表達形式分析

在37 ℃條件下，表達的PlACS以包涵體的形式存在，上清液中幾乎未見表達的PlACS蛋白(圖13)，其原因可能是由于外源基因表達速度過快，導致表達的蛋白質(zhì)來不及正確折疊。

3 結(jié)論與討論

本研究應用RACE技術(shù)從芍藥切花品種桃花飛雪中克隆了PlACS基因cDNA序列，應用生物信息

M.Protein Marker；1.未誘導上清液；2.誘導上清液；3.未誘導沉淀；4.誘導沉淀。M.Protein Marker；1.Supernatant without induced；2.Supernatant induced；3.Precipitate without induced；4.Precipitate induced.

學方法對其編碼的蛋白質(zhì)進行了綜合分析，構(gòu)建了PlACS基因的原核表達載體，建立了PlACS蛋白高效的原核表達體系。研究結(jié)果為后續(xù)通過變復性獲得有生物學活性的PlACS重組蛋白及其酶學功能鑒定奠定了基礎。

擬南芥[8]、番茄[17]和蘋果[18]等物種的ACS基因已被克隆和鑒定，但受限于基因組和轉(zhuǎn)錄組等信息的缺乏，芍藥ACS基因遲遲未被研究。在沒有基因組或轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的情況下，RACE技術(shù)是獲得芍藥ACS基因cDNA全長序列的有效方法。通過2輪RACE-PCR，獲得了芍藥ACS基因全長cDNA序列，共1 752 bp。cDNA完整序列的獲得對后續(xù)該基因功能的鑒定及蛋白質(zhì)原核表達等研究至關(guān)重要。

與擬南芥ACS一樣，PlACS蛋白序列中存在多個保守區(qū)及保守的活性位點K，且包含了底物SAM特異性結(jié)合位點和磷酸吡哆醛結(jié)合位點，這些保守結(jié)構(gòu)在擬南芥中已經(jīng)被證明為ACS酶活性所必需的位點[9]；PlACS蛋白中的活性位點12肽基序SLSKDMGFPGFR與蘋果和番茄ACS活性位點12肽基序高度相似，而后者的12肽基序已被3H和14C同位素標記試驗證實為與底物SAM結(jié)合的蛋白質(zhì)序列[18-19]。系統(tǒng)發(fā)育分析揭示，PlACS和牡丹ACS親緣關(guān)系最近，與葡萄屬植物ACS親緣關(guān)系較近，而與薔薇科植物相對較遠。該結(jié)果與基于基因組序列推斷的虎耳草目(Saxifragales)植物與葡萄目(Vitales)植物親緣關(guān)系較近，而與薔薇類(Rosids)植物親緣關(guān)系相對較遠的結(jié)果一致[20]。

目前，已經(jīng)建立了多個物種的ACS重組蛋白原核高效表達體系，如月季[21]、牡丹[22]和絲瓜[23]的大腸桿菌原核表達體系，但是尚無芍藥ACS重組蛋白的原核表達體系。因此，本研究構(gòu)建芍藥PlACS基因原核表達載體并探索PlACS原核高效表達所需的條件。在大腸桿菌中表達的重組蛋白往往不能自發(fā)折疊卷曲，以一種不溶性的沉淀即包涵體的形式存在，這是原核表達系統(tǒng)高效表達時的普遍現(xiàn)象[24]。為了使重組蛋白具有生物活性，必須將包涵體變性后復性[25]。但包涵體的變復性一直困擾著許多科學工作者，降低誘導溫度有益于某些蛋白質(zhì)的可溶性表達[26]。在本試驗條件下，PlACS重組蛋白表達形式為包涵體。后續(xù)將采取降低表達溫度及變復性2種方式，嘗試獲得有生物學活性的PlACS重組蛋白，從而對PlACS重組蛋白的酶學特性及功能進行深入研究。