聚合R基因Pigm和非R基因bsr-d1改良水稻稻瘟病抗性

王 亞，王越濤，申關望，王付華，王生軒，白 濤，尹海慶

(1.河南省農業科學院 糧食作物研究所，河南 鄭州 450002；2.信陽市農業科學院 水稻研究所，河南 信陽 464000)

稻瘟病是我國水稻主產區的第一大毀滅性病害，由子囊菌(Magnaporthegrisea(Hebert)Barr)引起[1]。稻瘟病在發病嚴重的年份可導致水稻顆粒無收，嚴重制約了我國水稻生產的發展[2-3]。相比使用化學農藥，種植抗稻瘟病水稻品種更能經濟有效地控制稻瘟病。由于稻瘟病生理小種繁多且容易變異，抗病品種經常喪失抗性而淪為感病品種，從而造成嚴重損失，生產上急需廣譜持久抗稻瘟病水稻新品種。稻瘟病抗性分為完全抗性(主效R基因控制)和部分抗性(非R基因控制)2種[4]。其中，完全抗性的主效基因易于操作，在水稻育種和生產中已得到廣泛應用。部分抗性的抗性水平雖然較完全抗性低，但抗性相對穩定和持久。完全抗性與部分抗性的結合利用將是未來水稻抗稻瘟病育種的方向和趨勢[5]。源自持久抗性品種谷梅4號的顯性主效R基因Pigm是一個包含多個NBS-LRR類抗病基因的基因簇，其中只有2個具有功能的蛋白質PigmR和PigmS。PigmR可以發揮廣譜抗病功能，但會導致水稻千粒質量降低，產量下降；PigmS則可以提高水稻的結實率，抵消PigmR對產量的影響，PigmS可以通過與PigmR競爭形成異源二聚體抑制PigmR介導的廣譜抗病性。但由于PigmS低水平的表達使得病原菌的進化選擇壓力變小，減緩了病原菌對PigmR的致病性進化，因此，Pigm介導的稻瘟病抗性更持久并且不影響最終產量[6]。bsr-d1是從廣譜持久抗病材料地谷中克隆的非R類廣譜抗稻瘟病基因。研究表明，由于Bsr-d1基因的啟動子區域一個關鍵堿基的變異，導致上游MYB轉錄因子對Bsr-d1啟動子結合增強而使得Bsr-d1基因表達受到抑制，進而導致Bsr-d1直接調控的H2O2降解酶基因表達下調，使H2O2降解減弱，細胞內H2O2富集，提高了水稻的免疫反應并因此獲得稻瘟病抗性；敲除Bsr-d1在增強水稻稻瘟病抗病性的同時，對產量性狀和稻米品質沒有明顯影響，因而具有十分重要的應用價值[7]。

稻米優質化是水稻生產“供給側改革”的重要內容，也是水稻產業提質增效的重要抓手。水晶3號是河南省優良食味水稻的標志性品種，但由于稻瘟病抗性差，極大限制了該品種的推廣應用，生產上急需具有廣譜持久稻瘟病抗性的優質稻品種。通過分子育種手段直接改良現有優質水稻資源的稻瘟病抗性，是培育抗稻瘟病優質水稻新品種的快速有效手段。CRISPR/Cas9系統是近幾年迅速發展起來的能夠便捷、高效、精準敲除靶基因的基因編輯技術，且成本低廉[8-10]。該技術主要原理是利用 gRNA與基因組上目標序列的特異性識別，引導Cas9核酸酶在靶標位置切割DNA使之雙鏈斷裂，進而導致基因組DNA在修復過程中發生堿基的缺失、插入或替換等特異性突變[11]。獲得的基因編輯材料通過后代自交分離能夠剔除外源基因，不會留下轉基因痕跡[12-13]。此外，隨著DNA 測序技術的迅猛發展，測序成本大大降低，分子標記檢測技術逐漸實現了高通量、低成本和自動化，為育種應用奠定了堅實基礎。選擇綜合性狀優良的品種，針對其突出缺點，精準導入目標性狀基因，利用基于基因芯片的分子標記檢測技術進行單個分子標記的前景選擇和高通量的背景選擇能夠靈活、高效地實現分子標記輔助回交育種的目標[14]，從而實現高產、優質、抗病的統一。

本研究首先利用CRISPR/Cas9系統對優良食味水稻品種水晶3號中的Bsr-d1進行定點編輯，在T0獲得純合的Bsr-d1敲除材料，經自交分離獲得去除轉基因成分的T1純合敲除材料，然后以這些材料為母本與攜帶Pigm基因的金玉1號(粳稻)雜交并連續回交3代，采用武漢雙綠源公司的水稻綠色基因芯片(GSR40K)進行Pigm基因分子標記選擇和高通量的背景選擇，獲得同時攜帶主效R基因Pigm和非R基因bsr-d1且遺傳背景基本回復的水晶3號抗稻瘟病材料，從而為水稻抗稻瘟病育種提供有重要價值的材料。

1 材料和方法

1.1 水稻材料、載體與菌株

水晶3號來自河南省農業科學院糧食作物研究所，金玉1號(轉育并攜帶Pigm基因)由江蘇里下河地區農業科學研究所提供。

CRISPR/Cas9雙元表達載體pBGK032來自百格基因科技(江蘇)有限公司。大腸桿菌DH-5α和農桿菌EHA105由河南省農業科學院糧食作物研究所水稻研究室保存。

1.2 CRISPR-Cas9-Bsr-d1表達載體構建

利用targetDesign(http：//skl.scau.edu.cn/targetdesign/)進行gRNA靶位點的設計。根據水稻生物學網站(http：//rice.plantbiology.msu.edu/)提供的Bsr-d1(LOC_Os03g32230)基因序列，選擇PAM(Protospacer adjacent motif)序列(NGG)上游約20 bp片段為靶位點序列(GGCGAAGGCCTTCCCGCAGA)，利用 NCBI 對水稻基因組進行 Blast 以分析確認靶位點的特異性。靶位點序列正義鏈和反義鏈設計，是在靶序列的5′端添加GTGT，靶序列互補鏈的5′端添加AAAC，使其與質粒經BsaⅠ酶切后形成黏性互補末端：正義鏈GTGTGGCGAAGGCCTTCCCGCAGA，反義鏈AAACTCTGCGGGAAGGCCTTCGCC。2條引物65 ℃退火5 min形成互補雙鏈 DNA，直接用于后續的載體構建。

對pBGK032雙元載體進行酶切：pBGK032質粒2 μg，10×NEB緩沖液5 μL，BsaⅠ 10 U，加ddH2O至50 μL。酶切后用DNA純化試劑盒進行純化，然后用T4連接酶將線性化的pBGK032(10 ng)與靶序列雙鏈 DNA(0.05 mmol/L)進行過夜連接，采用熱激法將連接產物轉化大腸桿菌DH-5α。根據載體序列信息設計上下游引物Cas9-F/Cas9-R(Cas9-F：CCATGAAGCCTTTCAGGACATGTA，Cas9-R：ACGCTGCAAACATGAGACGGAGAA)進行PCR鑒定，經測序驗證無誤的重組表達載體命名為CRISPR-Cas9-Bsr-d1，并轉化到農桿菌 EHA105中。

1.3 水稻遺傳轉化及無 T-DNA元件的bsr-d1純合突變體篩選

將攜帶CRISPR-Cas9-Bsr-d1重組質粒的農桿菌EHA105 轉化受體水稻品種水晶3號的愈傷組織，在含有潮霉素的培養基上篩選有抗性的再生組培苗即T0植株。將組培苗經過煉苗后轉移到溫室種植，采用CTAB法于四葉期提取葉片DNA，用潮霉素抗性基因特異性引物Hyg-F/Hyg-R(Hyg-F：CGAGAGCCTGACCTATTGCAT，Hyg-R：CTGCTCCATACAAGCCAACCAC)進行PCR擴增，能擴增出481 bp目標條帶的即為陽性轉基因植株。

設計能夠擴增含有CRISPR/Cas9靶序列的特異性引物(GP-F：GAGGTCGAAGTTCCTGACGG，GP-R：GGCGATCAACAAGGAGGAGT)，以上述陽性轉基因植株DNA為模板擴增目的條帶(長度約為490 bp)，將PCR產物送上海生工生物公司測序，以野生型水晶3號Bsr-d1基因序列為參考，采用在線分析軟件DSDecodeM(http：//skl.scau.edu.cn/dsdecode/)對測序結果進行比對分析，以明確突變位點的具體情況。根據測序獲得的水晶3號不同類型突變體中的編碼序列，利用BioEdit軟件翻譯成蛋白質序列并進行多重序列比對，然后將比對結果保存為Fasta格式，利用ClustalX軟件轉換為MSF格式，然后用GeneDoc軟件分析各突變單株氨基酸序列的變化情況。

篩選得到的T0純合突變株經自交結實后得到T1種子，將T1種子播種成苗移栽后提取葉片基因組DNA，用載體特異引物Hyg-F/Hyg-R進行PCR擴增，無法擴增出目的條帶的植株即為無T-DNA成分的T1單株。

1.4 無T-DNA元件的bsr-d1純合突變體中抗稻瘟病基因 Pigm的導入

2019年夏季在原陽試驗基地以無T-DNA成分的T1單株為母本，以攜帶Pigm基因的金玉1號為父本，雜交獲得F1。2019年冬單株種植于溫室，利用武漢雙綠源創芯科技研究院有限公司研制的GSR40K高密度水稻基因芯片(基于Illumina芯片制造技術開發的SNP 芯片，包含了豐富的多態性標記、重要農藝性狀的功能基因標記和單倍型標記以及用于定位 QTL標記)，篩選出攜帶Pigm基因的單株，以野生型水晶3號為輪回親本，連續回交3代，采用GSR40K基因芯片同時進行目標基因和背景選擇，獲得BC3F1。2020年冬選擇含Pigm基因且背景回復好的重組單株自交一次，獲得BC3F2。對BC3F2進行前景及背景選擇，最終獲得抗病基因(同時攜帶bsr-d1和Pigm基因)純合，且背景基本回復的水晶3號改良系。

1.5 水晶3號改良株系幼苗期的葉瘟抗性鑒定

將同時攜帶bsr-d1和Pigm基因的水晶3號改良株系及其野生型對照培養至五葉期，剪取5～6 cm長的水稻頂端完全伸展的葉片，用接種針在主脈間隔一定距離劃3個傷口且不穿透葉片，然后置于平皿內保濕的濾紙上。參考徐鵬等[15]的方法，將稻瘟病菌(GUY11由福建農林科技大學劉建平老師提供)制成分生孢子懸浮液(2×105個/mL)。用移液槍在葉片傷口處點滴15 μL的孢子液，隨即在25 ℃黑暗條件下保濕培養30 h。然后將光照時間調整為14 h，溫度保持在25 ℃，濕度飽和。接種后5 d觀察病斑大小。

1.6 水晶3號改良株系接種稻瘟病菌前后的生理指標測定

將獲得的攜帶bsr-d1和Pigm基因的水晶3號改良株系及野生型對照材料培養至四葉一心期，用分生孢子懸浮液活體噴霧處理，分別在接種0，2，5 d時取葉片測定各材料生理指標。利用商業化試劑盒(蘇州科銘)結合酶標儀對過氧化物酶(POD)活性[16]和過氧化氫(H2O2)含量[17]進行測定(具體方法參照試劑盒說明書)，以上均以未接種的材料為對照，3次重復。

2 結果與分析

2.1 Bsr-d1靶位點設計和CRISPR-Cas9-Bsr-d1表達載體構建

首先對日本晴、水晶3號和地谷中Bsr-d1基因的功能位點區段進行PCR產物測序，發現地谷Bsr-d1基因啟動子功能位點的堿基為G，而水晶3號和日本晴在同一位點的堿基為A(圖1-A)，說明水晶3號不具有bsr-d1介導的稻瘟病抗性。然后根據日本晴中Bsr-d1基因序列設計擴增引物Bsr-d1-F/Bsr-d1-R(GCTCATCATCCATCCATCTC/GGCGACAATCAATCTTGG)，以水晶3號基因組DNA為模板進行 PCR 擴增并對擴增產物進行測序，發現水晶3號中Bsr-d1基因與數據庫中公布的日本晴Bsr-d1完全一致，整個CDS區只有1個外顯子，長度為663 bp，編碼220個氨基酸。根據CRISPR-Cas9靶位點設計原則，在Bsr-d1基因編碼區靠近ATG一端設計20 bp的gRNA靶序列GGCGAAGGCCTTCCCGCAGA，靶序列3′端為PAM序列CGG(圖1-B)。退火形成的雙鏈互補靶序列經BsaⅠ酶切后與雙元載體pBGK032連接形成重組載體CRISPR-Cas9-Bsr-d1(圖1-B)。對重組質粒進行 PCR 擴增，目標片段長度約為361 bp，符合預期結果，表明CRISPR-Cas9-Bsr-d1表達載體構建成功。選取驗證片段大小正確的菌株抽提質粒，經測序驗證無誤后，將陽性質粒轉入農桿菌 EHA105。

圖1 不同水稻品種中Bsr-d1基因啟動子的功能位點分析(A)及CRISPR-Cas9-Bsr-d1重組載體信息(B)Fig.1 Functional locus of Bsr-d1 gene promoter in different rice varieties(A)and schematic information of the CRISPR-Cas9-Bsr-d1 recombinant vector(B)

2.2 T0轉基因陽性株的獲得及靶位點的突變分析

通過農桿菌介導的方法將構建好的CRISPR-Cas9-Bsr-d1重組表達載體導入水晶3號愈傷組織，經潮霉素篩選，共獲得34個獨立轉化體。將獲得的轉基因植株煉苗后轉移至溫室培養，四葉期時提取葉片DNA用潮霉素抗性基因引物Hyg-F/Hyg-R進行PCR擴增，發現34個獨立轉化體均攜帶有潮霉素抗性基因，陽性率達到100%(圖2)。為了解水晶3號中Bsr-d1基因的突變情況，以上述葉片DNA為模板用能夠擴增含有CRISPR/Cas9靶序列的特異性引物GP-F/GP-R進行PCR擴增(圖2)，并對 PCR 產物進行測序分析，利用在線分析軟件DSDecodeM進行序列解碼。結果表明，有21株陽性轉基因苗在靶位點處發生了突變，突變率為61.8%；突變基因型包括純合突變和雜合突變，其中有8株為純合突變，占38.1%，13株為雜合突變，占61.9%；純合突變類型包括堿基插入和缺失(圖3-A)，其中T插入占25.0%，GA缺失占37.5%，G插入及CGCA和CGCAGA堿基缺失各占12.5%。氨基酸序列比對結果表明，與野生型Bsr-d1基因的氨基酸序列相比，編輯后的Bsr-d1基因由于出現堿基的插入或缺失造成了移碼突變(SJ3+T、SJ3+G、SJ3-2和SJ3-4)，導致氨基酸序列組成出現較大變化或翻譯提前終止；CGCAGA堿基缺失則導致了整碼突變，在77，78位置缺失了纈氨酸和半胱氨酸2個氨基酸，其他氨基酸則無變化(圖3-B)。以上突變體氨基酸的變化有可能造成蛋白質功能的喪失。

Marker.2000 bp DNA標準分子質量；+.Hyg基因的陽性對照；-.雙蒸水；1—34.34個T0 獨立轉化體。Marker.2000 bp DNA Marker；+.Positive control of Hyg；-.ddH2O；1—34.34 independent transformants in T0 generation.

2.3 無T-DNA元件的bsr-d1純合突變體篩選及抗稻瘟病基因 Pigm的導入

為快速獲得不包含T-DNA元件的bsr-d1純合突變株用于后續研究，將T0的5種類型的純合突變株系自交，結實后得到T1種子，將T1種子播種，成苗后提取葉片基因組DNA，用載體特異引物Hyg-F/Hyg-R進行PCR擴增，無法擴增出481 bp目的條帶的植株即為無轉基因成分的bsr-d1純合突變體(圖4)。以無轉基因成分的bsr-d1純合突變體基因組DNA為模板，利用靶點檢測特異性引物GP-F/GP-R進行PCR擴增，PCR產物測序表明無轉基因成分的bsr-d1純合突變體靶位點突變情況與T0是一致的，說明這5種Bsr-d1單基因突變類型在剔除Cas9載體骨架后能夠穩定遺傳。

A．T0轉基因水晶3號的5 種純合突變體類型；B．Bsr-d1基因野生型及5種純合突變類型的氨基酸序列分析:SJ3.野生型,SJ3+T.T堿基插入,SJ3+G.G堿基插入,SJ3-2.GA堿基缺失,SJ3-4.CGCA堿基缺失,SJ3-6.CGCAGA堿基缺失。A.Five types of homozygous mutants of Shuijing 3 in T0 generation；B.Bsr-d1 gene amino acid sequences in the wild type and five homozygous mutant lines:SJ3.Wild type,SJ3+T.T base insertion,SJ3+G.G base insertion,SJ3-2.GA bases deletion,SJ3-4.CGCA bases deletion,SJ3-6.CGCAGA bases deletion.

Marker.2000 bp DNA標準分子質量；1—24.24個T1 單株。Marker.2000 bp DNA Marker；1—24.24 independent plants in T1 generation.

以無T-DNA成分的T1bsr-d1純合突變體為母本，以攜帶Pigm基因的金玉1號為父本，雜交獲得F1，利用GSR40K基因芯片篩選出攜帶Pigm基因的F1單株，以水晶3號為輪回親本，連續回交3代獲得BC3F1，根據芯片檢測結果選擇含Pigm基因且背景回復好的重組單株自交一次，獲得BC3F2，并篩選獲得抗病基因(同時攜帶bsr-d1和Pigm基因)純合，且背景基本回復的水晶3號改良植株(圖5，以T堿基插入突變體為例)。攜帶Pigm基因的水晶3號bsr-d1純合突變體SJ3+T、SJ3+G、SJ3-2、SJ3-4、SJ3-6的背景回復率分別為97.86%，96.71%，97.39%，97.52%，96.79%，將以上水晶3號改良系依次命名為SJ3-G1、SJ3-G2、SJ3-G3、SJ3-G4、SJ3-G5。

藍色.雜合基因位點；紅色.純合Pigm基因位點。Blue.Heterozygous gene locus；Red.Homozygous Pigm locus.

2.4 水晶3號改良株系幼苗期的葉瘟抗性鑒定

采用離體水稻葉片劃傷接種稻瘟病菌方法鑒定不同類型水晶3號改良株系幼苗期對稻瘟病菌的抗性，接種5 d后對病斑葉片進行拍照 (圖6)。從圖6可以看出，野生型水晶3號葉片感病比較嚴重，病斑面積明顯大于水晶3號各改良株系。以上結果表明，同時攜帶bsr-d1和Pigm基因的水晶3號各改良株系在幼苗期對稻瘟病菌生理小種GUY11引起的葉瘟抗性均明顯提高。但是否對其他稻瘟病菌生理小種產生抗性及穗頸瘟抗性如何，仍需進一步接種鑒定。

圖6 水晶3號改良株系及其野生型對照的稻瘟病菌接種鑒定結果Fig.6 Identification of improved strains of Shuijing 3 and the wild-type control after inoculation with M.coryza

2.5 水晶3號改良株系接種稻瘟病菌前后的生理指標測定

水稻幼苗未接種稻瘟病菌時，SJ3-G1、SJ3-G3株系葉片中POD活性與對照相比顯著降低，SJ3-G2、SJ3-G4、SJ3-G5株系葉片中POD活性則與對照無顯著差異；接種稻瘟病菌2，5 d后，水晶3號改良系葉片中POD活性均顯著低于對照(圖7-A)。未接種稻瘟病菌時，各改良株系葉片中H2O2含量與對照無顯著差異；接種稻瘟病菌2，5 d后，水晶3號改良系葉片中H2O2含量均顯著高于對照(圖7-B)。不論對照還是改良系，葉片中H2O2含量均隨著接種時間的增加而呈增加趨勢，POD活性變化不明顯。

柱上不同小寫字母表示野生型和各改良株系在接種后同一時期0.05水平上差異顯著(t測試)。Different lowercase letters above the bars indicate significant difference between the wild type and the improved lines at the 0.05 levels by t-test at the same stage.

3 結論與討論

CRISPR/Cas9基因編輯技術由于具有精準、便捷、高效、成本低廉等優點，已經在水稻稻瘟病抗性遺傳改良中得到了廣泛應用。Wang等[18]利用 CRISPR/Cas9 系統定向編輯水稻稻瘟病負調控基因OsERF922，從50株陽性轉化體中鑒定到21株T0突變株，經過自交分離，最終獲得6個稻瘟病抗性明顯增強且無外源基因成分的T2純合突變株系，CRISPR/Cas9技術可以在不影響其他農藝性狀的前提下實現對水稻抗病性的改良。楊海河等[19]利用CRISPR-Cas9技術對水稻稻瘟病感病品種日本晴pi21基因進行定點突變，最終獲得了21株不含T-DNA轉基因序列的pi21純合突變體，對其中1個pi21突變株系進行稻瘟病菌孢子噴霧接種，發現突變株系的抗病性顯著高于野生型日本晴。徐鵬等[15]利用CRISPR/Cas9系統對長粒粳稻恢復系L1014中Pita、Pi21和ERF922進行定點編輯，獲得了Pi21單突變株系和Pita、Pi21、ERF922三突變株系，接種鑒定結果表明，突變株系的稻瘟病抗性比野生型顯著提高。

編碼 C2H2 類轉錄因子的Bsr-d1基因是從廣譜抗稻瘟病品種地谷中鑒定出來的，由于該基因通過RNAi或CRISPR/Cas9技術被敲除后，水稻品種TP309的稻瘟病抗性明顯提高，因此，bsr-d1被認為是一個調控水稻稻瘟病廣譜抗性的新的遺傳位點[7，20]。bsr-d1為轉錄因子，其介導的稻瘟病抗性屬于非R類部分抗性，抗性相對穩定和持久。bsr-d1主要分布在秈型水稻資源中，在粳型資源中幾乎不存在[21]。因此，為了快速獲得具有廣譜持久稻瘟病抗性的水晶3號，本研究首先利用CRISPR/Cas9系統定向編輯Bsr-d1基因，并通過自交分離獲得了不含T-DNA轉基因成分的水晶3號bsr-d1純合突變株系，包括T插入、G插入、GA缺失、CGCA缺失和CGCAGA缺失5種類型，突變類型較為豐富。34個T0轉基因植株中Bsr-d1基因的突變率為61.8%，其中有8株為純合突變體。純合變變類型中GA缺失型最多，占全部純合突變體的37.5%，其次為T插入占25.0%，G插入及CGCA和CGCAGA堿基缺失則各占12.5%。氨基酸序列分析結果表明，以上5種突變類型均導致了Bsr-d1氨基酸序列組成的變化或翻譯提前終止，很有可能造成蛋白質功能的喪失，從而使得水晶3號獲得稻瘟病抗性。

研究認為，完全抗性與部分抗性結合利用在抗稻瘟病育種中有重要的應用價值[5]。作為公認的持久廣譜抗稻瘟病基因，Pigm目前在河南沿黃粳稻育種中還沒有得到充分利用[22]，因此，本研究在獲得Bsr-d1純合突變株系的基礎上，經雜交、回交、自交并采用武漢雙綠源創芯科技研究院有限公司的GSR40K高密度水稻基因芯片進行前景和背景選擇，大大縮短了育種周期，只經過4代就將粳稻金玉1號中的Pigm基因導入以上突變株系中，并最終獲得抗病基因(同時攜帶bsr-d1和Pigm基因)純合，且背景基本回復(背景回復率均在96%以上)的水晶3號改良植株即SJ3-G1、SJ3-G2、SJ3-G3、SJ3-G4、SJ3-G5。稻瘟病菌接種鑒定結果表明，與野生型水晶3號相比，改良株系葉片上的病斑面積明顯變小，稻瘟病抗性明顯提高。

研究表明，適度提高H2O2含量能夠增強水稻稻瘟病抗性[23]。bsr-d1通過調控過氧化氫酶基因的表達調節H2O2的積累，從而影響水稻的稻瘟病抗性。敲除Bsr-d1基因能夠顯著降低過氧化物酶基因的表達量，進而減弱其對H2O2的降解引起細胞內H2O2的富集，從而提高水稻植株抗病性[7]。本研究發現，接種稻瘟病菌后，水晶3號改良株系葉片中POD活性顯著低于其野生型對照，H2O2含量則正好相反，改良株系葉片中H2O2含量顯著高于其野生型對照。這與以前的研究結果是一致的，證明稻瘟病抗性與H2O2含量存在一定正相關關系，而與POD活性則存在一定負相關關系，很有可能是因為Bsr-d1基因被敲除后，引起活性氧清除相關酶類基因的表達下調，細胞內H2O2在一定程度上得以富集從而使水稻植株獲得了稻瘟病抗性，至于Pigm在這種調節機制中的具體作用還需要深入研究。

本研究通過CRISPR/Cas9系統結合分子標記輔助選擇獲得了同時攜帶bsr-d1和Pigm基因且無外源轉基因成分的水晶3號改良株系，并證實這些改良株系在苗期由于POD活性的降低和H2O2含量的增加一定程度上提高了對稻瘟病生理小種GUY11的抗性，但對其他稻瘟病生理小種是否具有抗性、穗頸瘟抗性如何、主效R基因和非R基因結合產生的抗性能否持久穩定、bsr-d1和Pigm基因之間存在何種關系，這些都還需要進一步研究。本研究為培育具有廣譜持久稻瘟病抗性的優質水稻新品種提供了重要的資源。在此基礎上，利用多種稻瘟病菌生理小種研究水晶3號改良系的抗性譜，開展多年多生態點抗性鑒定尤其是穗頸瘟抗性鑒定以明確抗性是否持久，同時開展產量、品質等其他農藝性狀鑒定，并利用這些材料改良其他骨干水稻親本的稻瘟病抗性，將是未來研究的重點方向。