COVID-19病毒N基因在昆蟲細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)

宿 放，韓佃剛 ，葉玲玲 ，張 沖 ，尹尚蓮 ，羅倩敏 ，董仙蘭 ，李瑤瑤 ，李凌楓 ，艾 軍，信吉閣

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.昆明海關(guān)，云南 昆明 650200)

突發(fā)和再次暴發(fā)的傳染性疾病是公共衛(wèi)生系統(tǒng)面臨的全球性挑戰(zhàn)[1-2]。2019年12月底暴發(fā)的由新型冠狀病毒導(dǎo)致的新型冠狀病毒肺炎(Coronavirus disease 2019，COVID-19)是當(dāng)前全球關(guān)注的公共健康問題，嚴(yán)重威脅全球人類健康。新型冠狀病毒屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，因其外包膜突起顆粒形似冠狀而得名[3]。2020年2月12日，國(guó)際病毒分類委員會(huì)正式將新型冠狀病毒命名為嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型(SARS-CoV-2)[4]。SARS-CoV-2具有極強(qiáng)的傳染性，主要通過呼吸道飛沫和接觸傳播，也可經(jīng)消化道傳播，感染者可出現(xiàn)發(fā)熱、干咳、乏力、胸悶等癥狀，但也有無癥狀感染者[5]。

SARS-CoV-2是β屬單股正鏈RNA病毒，基因組序列約有29 kb，擁有10個(gè)基因，可有效編碼10個(gè)蛋白[6]。作為SARS-CoV-2基因同一條編碼鏈上5個(gè)典型的開放閱讀框(ORF)之一的核衣殼蛋白(Nucleocapsid gene，N gene，419 aa)，分子量接近46 ku[7-8]。N蛋白是一種高免疫原性蛋白，在感染過程中大量表達(dá)，與病毒基因組RNA相互纏繞形成病毒核衣殼，具有較高的保守性和RNA分子伴侶活性，在病毒復(fù)制過程中相比其他基因而言不易突變，同時(shí)在病毒RNA的合成過程中發(fā)揮著重要的作用[9-10]。作為真核表達(dá)系統(tǒng)的一員，昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)有許多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，在眾多研究中被廣泛利用[11-14]。

新型冠狀病毒檢測(cè)方法的研究，對(duì)于此病的防控非常重要。本研究利用昆蟲表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白更接近天然蛋白的特點(diǎn)，根據(jù)SARS-CoV-2病毒N蛋白在病毒感染過程中大量表達(dá)，可作為抗原和抗體檢測(cè)靶標(biāo)的特性，開展了SARS-CoV-2病毒N蛋白在昆蟲細(xì)胞上的表達(dá)研究。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 包含目的片段的人工合成重組質(zhì)粒pUC57-COV19-N來自生工生物工程(上海)股份有限公司，E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞來自TaKaRa公司，E.coliDH10Bac、pFastBacTMHTB載體來自Thermo Fisher Scientific公司，Sf9昆蟲細(xì)胞為昆明海關(guān)技術(shù)中心動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑 高保真酶Primer STAR HS、PremixTaq酶、dATP、質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DNA Ligation Kit Ver.2.1、限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和XbaⅠ、T-Vector pMD19(simple)、牛血清白蛋白(BSA)來自TaKaRa公司；SOC培養(yǎng)基、10×TBST洗液、Cellfectin ReagentⅡ脂質(zhì)劑來自Thermo Fisher Scientific公司；Grace細(xì)胞培養(yǎng)基、卡那霉素(Kan)、四環(huán)素(Tet)、慶大霉素(Gen)、氨芐青霉素(Amp)來自Solarbio公司。

1.1.3 儀器 PCR儀來自美國(guó)Bio-Rad公司，高速臺(tái)式離心機(jī)來自德國(guó)Eppendorf公司，高速液體冷凍離心機(jī)來自日本HITACHI公司，超凈工作臺(tái)來自美國(guó)Termo Forma公司，凝膠成像系統(tǒng)來自美國(guó)基因公司，恒溫空氣搖床來自美國(guó)Life Sciences公司，電泳儀來自德國(guó)Pharmacia公司，細(xì)胞培養(yǎng)箱來自日本SAKURA公司，倒置顯微鏡來自德國(guó)萊卡公司，超低溫冰箱來自日本SANYO公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物合成 以pUC57-COV19-N為模板設(shè)計(jì)出一對(duì)PCR擴(kuò)增引物，并根據(jù)pFastBacTMHTB載體序列和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)選擇BamH Ⅰ和XbaⅠ作為酶切位點(diǎn)分別加至上、下游引物5′端(下劃線表示酶切位點(diǎn))：COV19-N-F：5′-TGGGATCCATGTCTGATAATGGACC-3′(BamH Ⅰ);COV19-N-R：5′-CGTCTAGATTAGGCCTGAGTTGAGTC-3′(XbaⅠ)。

1.2.2 PCR擴(kuò)增目的片段 使用高保真酶Primer STAR HS進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為：5×PrimeSTAR Buffer，10 μL；dNTP Mixture(2.5 mmol/L)，4 μL；COV19-N-F(10 μmol/L)，1 μL；COV19-N-R(10 μmol/L)，1 μL；COV19-N人工合成質(zhì)粒，2 μL；高保真酶Primer STAR HS(2.5 U/μL)，0.5 μL；ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性10 s，50.7 ℃退火15 s，72 ℃延伸76 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸3 min。

1.2.3 PCR產(chǎn)物加A尾 以PCR回收產(chǎn)物為模板，50 μL PCR回收產(chǎn)物中加入3 μL dATP和0.5 μLTaq酶，72 ℃延伸30 min；電泳，凝膠回收加A尾的PCR產(chǎn)物。

1.2.4 目的片段與T-Vector pMD19(simple)載體的連接轉(zhuǎn)化 按照TaKaRa DNA連接試劑盒使用說明，取加A尾的PCR產(chǎn)物4 μL與1 μL T-Vector pMD19(simple)載體連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，PCR鑒定，獲得重組質(zhì)粒pMD19-T(simple)-COV19-N。

1.2.5 重組質(zhì)粒pMD19-T(simple)-COV19-N的雙酶切鑒定 往25 μL體系中加入1 μLBamH Ⅰ(15 U/μL)，1 μLXbaⅠ(15 U/μL)，1 μL 10×K Buffer，17 μL pMD19-T(simple)-COV19-N重組質(zhì)粒，37 ℃水浴酶切2 h；電泳，確定目的條帶符合大小后凝膠回收雙酶切產(chǎn)物。

1.2.6 重組質(zhì)粒pMD19-T(simple)-COV19-N的測(cè)序 將初步鑒定的pMD19-T(simple)-COV19-N重組質(zhì)粒送至昆明擎科技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.7 重組桿粒DH10Bac-pFastBacTMHTB-COV19-N的構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和XbaⅠ雙酶切pFastBacTMHTB載體(4 857 bp)和重組質(zhì)粒pMD19-T(simple)-COV19-N，然后將COV19-N基因連接入pFastBacTMHTB載體，轉(zhuǎn)化E.coliDH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)Gen、Kan和Tet 3種抗生素篩選，獲得重組桿粒DH10Bac-pFastBacTMHTB-COV19-N。

1.2.8 重組桿粒DH10Bac-pFastBacTMHTB-COV19-N鑒定 PCR體系為：5×PrimeSTAR Buffer，10 μL；dNTP Mixture(2.5 mmol/L)，4 μL；M13-F(10 μmol/L)，1.25 μL；M13-R(10 μmol/L)，1.25 μL；重組桿粒，2 μL；高保真酶Primer STAR HS(2.5 U/μL)，0.5 μL；ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸5 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。電泳，觀察目的條帶位置確定重組桿粒成功構(gòu)建。

1.2.9 重組桿粒DH10Bac-pFastBacTMHTB-COV19-N的真核表達(dá) 復(fù)蘇Sf9昆蟲細(xì)胞，將生長(zhǎng)良好的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至六孔板上，放入28 ℃無CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至約9×105個(gè)Sf9細(xì)胞/孔時(shí)取出六孔板進(jìn)行試驗(yàn)。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，在Cellfectin ReagentⅡ脂質(zhì)劑的介導(dǎo)下將重組桿粒DH10Bac-pFastBacTMHTB-COV19-N轉(zhuǎn)入Sf9昆蟲細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)立GFP熒光蛋白對(duì)照組與空白對(duì)照組，在六孔板上培養(yǎng)約3 d后轉(zhuǎn)入長(zhǎng)滿昆蟲細(xì)胞的25 cm2小瓶?jī)?nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)96～120 h后凍融3次收集蛋白，加入適量含PMSF的細(xì)胞裂解液煮沸制樣并保存于-20 ℃。

1.2.10 重組桿粒DH10Bac-pFastBacTMHTB-COV19-N的蛋白鑒定 配制10%的分離膠與5%的濃縮膠，用制好的重組N蛋白、GFP蛋白進(jìn)行SDS-PAGE試驗(yàn)，分離膠設(shè)定電壓50 V，直至PageRuler 預(yù)染蛋白Marker剛開始分離時(shí)將電壓調(diào)至120 V，電泳1 h后取出凝膠并在150 V、350 mA的條件下于預(yù)冷泡沫箱中轉(zhuǎn)膜1 h。轉(zhuǎn)膜過程中使用的材料均提前用轉(zhuǎn)膜緩沖液浸泡，PVDF膜提前激活，轉(zhuǎn)膜完成后用含3% BSA的1×TBST溶液37 ℃封閉1 h。HRP-His標(biāo)記抗體用TBST稀釋1 000倍，4 ℃過夜孵育，次日取出并加入1×TBST于搖床上清洗3次，每次10 min。稱取50 mg DAB溶于100 mL 1×TBST中，加入50 μL 30% H2O2溶液立即染色并拍照觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pMD19-T(simple)-COV19-N的PCR鑒定

查閱資料已知N基因片段大小為1 260 bp，將重組質(zhì)粒pMD19-T(simple)-COV19-N進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得圖1結(jié)果，可以看出，1—4這4個(gè)泳道條帶大小約為1 260 bp，符合預(yù)期大小，表明目的片段被成功擴(kuò)增，可以用于下一步試驗(yàn)。

M.DL5000 DNA Marker；1—4. pMD19-T(simple)-COV19-N的PCR產(chǎn)物。M.DL5000 DNA Marker；1—4. PCR products of pMD19-T(simple)-COV19-N.

2.2 重組質(zhì)粒pMD19-T(simple)-COV19-N雙酶切鑒定

利用BamH Ⅰ和XbaⅠ對(duì)pMD19-T(simple)-COV19-N重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，從圖2中的1—4泳道可以觀察到每個(gè)泳道上均有2個(gè)條帶，6泳道條帶為T-Vector pMD19(simple)載體帶，大小約為2 692 bp，5泳道條帶為COV19-N條帶，大小約為1 260 bp；第5泳道為2.1中重組質(zhì)粒pMD19-T(simple)-COV19-N的PCR產(chǎn)物，由于其濃度較高，因此，電泳后與前4個(gè)泳道COV19-N條帶相比更亮，第6泳道為T-Vector pMD19(simple)空載體帶，由于同種質(zhì)粒會(huì)因?yàn)榭臻g結(jié)構(gòu)不同而導(dǎo)致電泳速率發(fā)生變化，T-Vector pMD19(simple)空載體條帶電泳速率會(huì)高于雙酶切得到的T-Vector pMD19(simple)載體條帶的電泳速率，因此，該空載體目的條帶離點(diǎn)樣孔更遠(yuǎn)。通過前4個(gè)泳道與5，6這2個(gè)泳道的對(duì)比結(jié)果可知雙酶切試驗(yàn)成功，表明N基因與T-Vector pMD19(simple)載體成功連接，因此，可將樣品測(cè)序來做進(jìn)一步鑒定。

M.DL5000 DNA Marker；1—4.pMD19-T(simple)-COV19-N雙酶切結(jié)果；5.pMD19-T(simple)-COV19-N的PCR產(chǎn)物對(duì)照；6.T-Vector pMD19(simple)空載體對(duì)照。

2.3 重組質(zhì)粒pMD19-T(simple)-COV19-N測(cè)序

得到測(cè)序結(jié)果與原人工合成序列進(jìn)行比對(duì)，可知送出測(cè)樣的序列與原序列相同，表明在擴(kuò)增過程中堿基未發(fā)生突變和錯(cuò)漏等情況，可繼續(xù)進(jìn)行重組桿粒的構(gòu)建。

2.4 重組桿粒DH10Bac-pFastBacTMHTB-COV19-N的PCR鑒定

從圖3可以看到，pFastBacTMHTB空載體經(jīng)過電泳后出現(xiàn)了3個(gè)條帶，離加樣孔最遠(yuǎn)的條帶最亮、濃度最高，是因?yàn)榄h(huán)形載體空間中會(huì)出現(xiàn)扭轉(zhuǎn)彎曲等情況，導(dǎo)致出現(xiàn)不同的結(jié)構(gòu)，最亮的條帶為pFastBacTMHTB空載體的超螺旋結(jié)構(gòu)，超螺旋結(jié)構(gòu)的載體含量越高則做后續(xù)的連接試驗(yàn)效率更高。利用M13引物對(duì)構(gòu)建的重組桿粒進(jìn)行PCR鑒定會(huì)出現(xiàn)2個(gè)條帶，遠(yuǎn)離加樣孔的條帶是使用pFastBacTMHT系列的pFastBacTMHTB載體時(shí)會(huì)出現(xiàn)的固有條帶(2 430 bp)，離加樣孔近的條帶大小是由固有條帶大小加上N基因大小(3 690 bp)，從圖4中可觀察到2條帶，與預(yù)期結(jié)果相同，表明重組質(zhì)粒pFastBacTMHTB-COV19-N轉(zhuǎn)入DH10Bac細(xì)胞后得到了重組桿粒，該重組桿粒能直接用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。

M.DL5000 DNA Marker；1—2.pFastBacTMHTB空載體。M.DL5000 DNA Marker；1—2.pFastBacTMHTB empty vector.

M.DL5000 DNA Marker；1.M13引物PCR擴(kuò)增重組桿粒。M.DL5000 DNA Marker；1.Amplification of recombinant bacmid by M13 primer PCR.

2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)結(jié)果

由于重組桿粒DH10Bac-pFastBacTMHTB-COV19-N在轉(zhuǎn)染過程中并不能通過直接觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果判定轉(zhuǎn)染成功，因此，在轉(zhuǎn)染時(shí)設(shè)立空白組和DH10Bac-pFastBacTMHTB-GFP熒光蛋白組作為對(duì)照組。重組GFP轉(zhuǎn)染對(duì)照試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)重組GFP桿粒轉(zhuǎn)染六孔板內(nèi)的Sf9細(xì)胞確定重組桿粒的最佳轉(zhuǎn)染量為1.5 μg/孔；在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染6～12 h后即可觀察到對(duì)照組的熒光出現(xiàn)，說明轉(zhuǎn)染效率很高，再經(jīng)過3～5 d培養(yǎng)，可觀察到對(duì)照組出現(xiàn)大量熒光，且細(xì)胞生長(zhǎng)較好，表明重組桿粒轉(zhuǎn)染成功。對(duì)于重組桿粒DH10Bac-pFastBacTMHTB-COV19-N也采取了以上同步的轉(zhuǎn)染策略。桿粒轉(zhuǎn)染六孔板120 h后，細(xì)胞轉(zhuǎn)移至長(zhǎng)滿細(xì)胞的瓶?jī)?nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，約5 d后將細(xì)胞凍融3次后收集，加入含PMSF的細(xì)胞裂解液并分裝保存，準(zhǔn)備用于蛋白鑒定試驗(yàn)(圖5)。

A.DH10Bac-pFastBacTMHTB-GFP對(duì)照組(明視野)，約12 h，40×10；B. DH10Bac-pFastBacTMHTB-GFP對(duì)照組(暗視野)，約12 h，40×10；C.DH10Bac-pFastBacTMHTB-GFP對(duì)照組，120 h，40×10；D.DH10Bac-pFastBacTMHTB-COV19-N組，120 h，40×10。

2.6 SDS-PAGE和WB鑒定

用收集的DH10Bac-pFastBacTMHTB-COV19-N重組蛋白(約46 ku)與DH10Bac-pFastBacTMHTB-GFP熒光蛋白制樣并進(jìn)行SDS-PAGE與WB試驗(yàn)。從SDS-PAGE試驗(yàn)結(jié)果中無法清楚地區(qū)分目的條帶(圖6)，分析原因可能是由于收集和制樣時(shí)未處理好蛋白樣品導(dǎo)致蛋白濃度低。由于pFastBacTMHTB載體末端存在6×His標(biāo)簽，因此，在轉(zhuǎn)膜后使用HRP-His標(biāo)記抗體來驗(yàn)證重組桿粒是否順利表達(dá)，通過DAB法染色驗(yàn)證蛋白成功在昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，重組N蛋白條帶顏色與GFP蛋白條帶相比較淺(圖7)，反映出GFP熒光蛋白表達(dá)量高于重組N蛋白，同時(shí)也說明重組桿粒可以在昆蟲細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)，因此，后續(xù)試驗(yàn)中可以繼續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)條件使DH10Bac-pFastBacTMHTB-COV19-N重組蛋白表達(dá)量提高。

N.PageRuler預(yù)染蛋白Marker；1.DH10Bac-pFastBacTMHTB-GFP熒光蛋白對(duì)照；2.DH10Bac-pFastBacTMHTB-COV19-N重組蛋白。圖7同。

圖7 轉(zhuǎn)膜后使用DAB染色法染色Fig.7 DAB staining after membrane transfer

3 結(jié)論與討論

面對(duì)嚴(yán)峻的疫情，在當(dāng)前疫防控工作中，對(duì)所有人員進(jìn)行普篩檢查尤其是對(duì)無癥狀感染者的檢查是疫病篩查的重點(diǎn)，SARS-CoV-2 lgM/lgG快速檢測(cè)試劑卡是一種快速判斷是否是無癥狀感染者的一種重要血清學(xué)檢測(cè)方法，其中N蛋白便是SARS-CoV-2 lgM/lgG快速檢測(cè)試劑卡的核心原材料，這表明N蛋白的重要性。本試驗(yàn)利用昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中桿狀病毒穿梭載體的穩(wěn)定性，使病毒迅速在昆蟲細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行穩(wěn)定傳播來最大限度保證外源蛋白的穩(wěn)定表達(dá)，同時(shí)，屬于真核表達(dá)系統(tǒng)的昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)也有許多原核表達(dá)系統(tǒng)(大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng))不具備的優(yōu)點(diǎn)：可對(duì)表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行翻譯加工，且能正確進(jìn)行空間折疊和形成二硫鍵，從而使表達(dá)的重組蛋白更接近于天然的蛋白質(zhì)；可對(duì)重組蛋白進(jìn)行定位，如將核蛋白轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核上、膜蛋白轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上、分泌蛋白分泌到細(xì)胞外；昆蟲細(xì)胞較易培養(yǎng)，能表達(dá)自然界大部分蛋白質(zhì)，通常用于大規(guī)模表達(dá)重組蛋白，與哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)相比縮短了從基因克隆至蛋白表達(dá)的時(shí)間；具有高度特異的宿主范圍，對(duì)脊椎動(dòng)物和植物無致病性，是安全的載體[15-16]。在本研究之初希望獲得具有天然蛋白質(zhì)活性的蛋白以便應(yīng)用于日常檢測(cè)當(dāng)中，使檢測(cè)結(jié)果更加精確，因此，選擇了被廣泛應(yīng)用的安全高效的昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)重組N蛋白，由試驗(yàn)結(jié)果可知符合預(yù)期目標(biāo)，成功對(duì)重組N蛋白進(jìn)行表達(dá)，為進(jìn)一步驗(yàn)證重組蛋白的免疫原性及ELISA檢測(cè)方法的建立等相關(guān)研究提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

近年來，越來越多的研究人員開始使用昆蟲表達(dá)系統(tǒng)Bac-to-bac來表達(dá)蛋白，并進(jìn)行相關(guān)的研究。徐興莉等[17]首次采用昆蟲表達(dá)系統(tǒng)對(duì)微小牛蜱Enolase基因得到高效表達(dá)后進(jìn)行了免疫反應(yīng)原性及抗凝指標(biāo)測(cè)定；曾博宇等[18]為獲得具有良好免疫原性的流感病毒蛋白，針對(duì)流感病毒HA球狀頭部結(jié)構(gòu)域，利用昆蟲表達(dá)系統(tǒng)并成功表達(dá)，為新型流感疫苗的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)；張愉等[19]針對(duì)廣西IBV優(yōu)勢(shì)血清型代表株，利用昆蟲表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)出具有很好免疫原性的GX-YL5株的S蛋白。王睿男等[20]為了制備出特異性強(qiáng)、親和性高，針對(duì)牛γ干擾素的單克隆抗體，同樣選擇了昆蟲表達(dá)系統(tǒng)來代替原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行試驗(yàn)，原因是昆蟲表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白質(zhì)其空間結(jié)構(gòu)與天然牛IFN-γ蛋白更為相近。大量的文獻(xiàn)表明，昆蟲表達(dá)系統(tǒng)在不同病毒的蛋白表達(dá)中已被廣泛應(yīng)用，且起到了非常重要的作用，表達(dá)出的蛋白更接近天然蛋白質(zhì)，具有更好的免疫原性。經(jīng)中國(guó)知網(wǎng)檢索，查閱的文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)，關(guān)于COV19-N蛋白的表達(dá)通常使用的為原核表達(dá)系統(tǒng)，利用真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)該蛋白幾乎沒有相關(guān)文獻(xiàn)，而真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出的蛋白質(zhì)更接近于天然的蛋白質(zhì)，因此，在后續(xù)相關(guān)的試驗(yàn)及實(shí)際檢測(cè)中利用真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組N蛋白應(yīng)會(huì)使試驗(yàn)結(jié)果和檢測(cè)結(jié)果更加精確，進(jìn)一步降低假陽性結(jié)果出現(xiàn)的可能性，提高檢測(cè)效率。本研究利用Bac-to-bac昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)成功構(gòu)建了重組桿粒DH10Bac-pFastBacTMHTB-COV19-N。在試驗(yàn)過程中為了保證每個(gè)步驟的精確無誤，在設(shè)計(jì)引物時(shí)于引物兩端增加酶切位點(diǎn)以便構(gòu)建過程中每一個(gè)步驟除了PCR驗(yàn)證外再進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，構(gòu)建的重組N基因與原人工合成序列100%相同，證明重組N蛋白載體構(gòu)建成功。用重組N蛋白和GFP蛋白分別轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，并設(shè)置了轉(zhuǎn)染細(xì)胞的質(zhì)粒與試劑的濃度梯度來盡量保證轉(zhuǎn)染效果更佳，凍融裂解收集蛋白后通過SDS-PAGE與WB試驗(yàn)、利用HRP-His標(biāo)記抗體證明重組蛋白在昆蟲細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)，雖然條帶顏色較淺，但期望后期通過不斷優(yōu)化轉(zhuǎn)染和蛋白制樣等步驟來增加樣品中的蛋白含量、提高目的條帶顏色深度。

本研究利用昆蟲表達(dá)系統(tǒng)成功構(gòu)建了重組桿粒DH10Bac-pFastBacTMHTB-COV19-N并驗(yàn)證其在昆蟲細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)，為建立更精確的ELISA檢測(cè)方法提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)。