甘加藏羊發情周期血漿Kisspeptin動態變化和PHPT軸中Kiss1/GPR54 的表達與分布

楊亞文，高何璇，劉莉莉，包瑩瑩，何玉琴，楊志杰，陳衛剛，葛聞博

(1.甘肅農業大學 生命科學技術學院，甘肅 蘭州 730070；2.蘭州銀行網絡金融部，甘肅 蘭州 730070；3.伊犁師范大學 生物與地理科學學院，新疆 伊犁 835000；4.中國農業科學院 蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅 蘭州 730070)

甘加藏羊(Ovisarise)是甘南草地型藏羊的優良地方類型之一，常年生活在2 800 m以上的高海拔地區，季節性發情(每年7—9月)，發情周期平均為(16 ± 2)d，每年產羔一次，一次一胎[1-2]。作為典型的季節性單次發情動物，較低水平的自然繁殖率與單次產羔是影響甘加藏羊群體數量的主要原因之一，嚴重影響了藏區畜牧業的良性發展。

研究發現，動物的季節性繁殖除了受到隨季節變化的光周期、氣溫、食物供應等[3]原因的影響，繁殖相關基因的表達調控[4]也對發情起到重要作用。20世紀90年代，Lee等[5]在人黑色素瘤細胞株中首次發現了Kiss1基因，它能編碼產生轉移抑制素(Kisspeptin)。有研究表明，下丘腦中的Kisspeptin在與膜受體GPR54結合后，會刺激下游促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasing hormone， GnRH)的分泌[6-9]，從而間接調控動物的季節性繁殖。也有研究報道Kiss1/GPR54系統是動物青春期啟動和發展的關鍵[10]。在非繁殖季節給綿羊注射Kisspeptin可以使90%的綿羊反季節排卵，證實Kiss1/GPR54系統是啟動母羊季節性繁殖的關鍵因子[11]；Kiss1基因及其受體分布于多種組織器官，主要表達于下丘腦、垂體、胰腺、性腺、甲狀腺等組織當中。下丘腦-垂體-甲狀腺軸在調節生殖功能上起著重要作用，無論是甲狀腺功能異常或是自身免疫性甲狀腺疾病，均會對生殖產生不利影響[12-14]。陳衛剛[15]已對甘加藏羊發情周期下丘腦、垂體和卵巢組織中Kiss1/GPR54系統進行了詳細研究，但對于有調節動物季節性繁殖的視神經、松果體和甲狀腺組織中、Kiss1/GPR54系統的表達及其生理調控等未見研究報道。

因此，本試驗以視神經為切入點，從“松果體-下丘腦-垂體-甲狀腺軸”(Pineal-hypothalamus-pituitary-thyroid axis，PHPTA)著手，首次從基因和蛋白水平對甘加藏羊繁殖季節和非繁殖季節視神經、PHPTA組織中Kiss1、GPR54mRNA及其蛋白的表達分布以及血漿Kisspeptin含量的動態變化規律進行了研究，以期為進一步闡明Kiss1/GPR54系統對藏羊生殖活動的調控及其機理研究提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 2019年7—9月(繁殖季節)在甘肅省甘南州夏河縣甘加鄉羊場隨機選取24只2.5～3.5歲健康未孕的雌性甘加藏羊作試驗組，其中發情前期、發情期、發情后期、間情期各6只；5月(非繁殖季節)隨機選取6只乏情期甘加藏羊作對照組。

1.1.2 頸靜脈采血 以公羊爬跨記為0 h，根據四期分法及母羊陰道涂片法跟蹤觀察2個發情周期，分別在發情期(第0～36小時)、發情后期(第39～72小時)、間情期(第4 ～13天)及發情前期(第14～16天)進行采樣。第一個周期采集血漿：頸靜脈采血，發情期每2 h采集1次，發情后期每3 h采集1次，其他時期7：00，19：00各采血1次，采血后迅速離心，吸取上清，置于-20 ℃保存。

1.1.3 組織采樣 第2個周期采集組織樣：將甘加藏羊頸動脈放血處死后，迅速打開顱腔及頸部取出完整的視神經、松果體、下丘腦、垂體和甲狀腺，所得樣品平均分為2份，分別置于4%多聚甲醛溶液和液氮中，待返回實驗室后移至-80 ℃冰箱保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 血漿Kisspeptin檢測 根據綿羊吻素(Kisspeptin)ELISA 檢測試劑盒(北京，奇松)說明書并設置3次重復，測定血漿Kisspeptin的OD值。根據標準品的OD值以及相對應的濃度繪制標準曲線，得到Kisspeptin的回歸方程y=0.001x+0.132 9(R2=0.996 8)，其中y表示OD值，x表示濃度。根據回歸方程計算得到不同時期Kisspeptin的濃度。用SPSS 22.0軟件統計血漿中Kisspeptin不同時期的濃度，并分析顯著性。

1.2.2 視神經、PHPT軸中Kiss1、GPR54mRNA檢測 NCBI 網站查找Kiss1、GPR54相對應CDS序列，利用 Premier 5.0設計引物，由擎科生物合成(表1)。

表1 qRT-PCR引物Tab.1 Primer of qRT-PCR

TransZol UP RNA 提取試劑盒(北京，全式金)提取視神經、松果體、下丘腦、垂體、甲狀腺中的總RNA，迅速檢測RNA濃度，使用反轉錄預混型試劑盒(湖南，艾克瑞生物)在20 μL的體系中進行反轉錄，所得cDNA保存在-20 ℃備用。以反轉錄的cDNA為模板，設置溫度梯度測定退火溫度。然后進行qRT-PCR，總體系為 20 μL ，每個樣品設3個重復。擴增條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環次數40次。所得相關數據用2-ΔΔCt方法進行計算，每個基因相對表達量均以內參基因為基準進行校正。所有數據用SPSS 22.0軟件進行顯著性分析。

1.2.3 視神經、PHPT軸中Kisspeptin、GPR54 蛋白檢測 液氮中充分研磨組織，加RIPA裂解液(北京，索萊寶)和蛋白酶抑制劑(北京，索萊寶)，反復凍融使其充分裂解，振蕩離心，取上清，提取組織總蛋白。PCR儀(上海，普迪)進行蛋白變性(98 ℃，10 min)，保存于-20 ℃備用。制備12%分離膠和5%濃縮膠后，以8 μL上樣量進行SDS-PAGE電泳，電泳完畢對照Marker預染條帶，裁剪對應條帶：Kisspeptin(16 ku)、GPR54(44 ku)、β-actin(42 ku)，濕轉法轉膜至0.45 μm的PVDF膜(北京，索萊寶)上，PBST(PBS+Tween 20)(北京，索萊寶)洗膜10 min后5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。孵育一抗Kisspeptin、GPR54(1∶ 1 000)，β-actin(1∶4 500)，4 ℃過夜。PBST洗膜2 h，37 ℃二抗孵育(1∶4 500)1 h，PBST洗膜2 h，暗室曝光顯影。Image J圖像分析系統進行灰度值分析，SPSS 22.0軟件進行差異性分析。

1.2.4 視神經、PHPT軸Kisspeptin、GPR54免疫組織化學染色 將提前用4%多聚甲醛固定好的組織進行石蠟包埋、切片、脫蠟處理后，H2O2封閉內源性過氧化物酶，用SP免疫組化檢測試劑盒(北京，博奧森)進行試驗。Kisspeptin和GPR54抗體(北京，博奧森)以1∶350稀釋，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS) 代替一抗作陰性對照，4 ℃ 孵育過夜，然后與二抗(北京，博奧森)37 ℃反應15 min，二氨基聯苯胺(DAB)(北京，博奧森)顯色，脫水透明后中性樹膠封片。利用正置光學顯微鏡BX51-DP71(日本，麥克奧迪)觀察并拍照，Kisspeptin和 GPR54 陽性部位呈現棕色。

2 結果與分析

2.1 甘加藏羊血漿Kisspeptin含量動態變化

由圖1可知，甘加藏羊血漿Kisspeptin在整個發情周期呈波動式和脈沖式交替分泌，乏情期整體激素水平低于發情周期；Kisspeptin在發情開始第12 小時達到第一個峰值(172.53±1.91)pg/mL，發情后期開始激素水平急劇上升，在第36，39小時達到第2和第3個峰值；發情周期內，Kisspeptin在發情后期的平均激素水平最高(122.13±2.18)pg/mL，間情期最低(114.38±25.31)pg/mL；乏情期激素水平大幅下降，平均含量僅達到(92.71±16.10)pg/mL。

A.發情期(0～36 h)和發情后期(39～72 h)；B.間情期(4 dM～13 dN)、發情前期(14 dM～16 dN)和乏情期(F)；N.晚；M.早。A.Estrus(0—36 h)and metestrus(39—72 h)；B.Diestrus(4 dM—13 dN)，proestrus(14 dM—16 dN)and anestrus(F) ；N.Night ；M.Morning.

2.2 甘加藏羊視神經、PHPT軸中Kiss1 、GPR54 mRNA的表達分析

由圖2可知，視神經Kiss1mRNA的相對表達量整體呈下降趨勢，并在發情后期降到谷底。松果體Kiss1mRNA的相對表達量在發情后期最高，間情期最低，其余各時期基本無太大波動。下丘腦、甲狀腺中的Kiss1mRNA在發情周期內逐步升高，均在發情后期達到頂峰，顯著高于其他時期(P<0.05)。垂體Kiss1mRNA相對表達量在發情期就達到峰值。

同一組織不同時期間進行顯著性分析，不同小寫字母表示不同時期間差異顯著(P<0.05)。圖4同。Significance analysis was conducted in different periods of the same organization, and different lowercase letters indicated significant differences in different periods(P<0.05).The same asFig.4.

視神經GPR54mRNA相對表達量在發情前期最高，顯著高于其他時期(P<0.05)；垂體組織Kiss1、GPR54mRNA相對表達量在發情期顯著高于其他時期(P<0.05)；松果體、下丘腦和甲狀腺三者GPR54mRNA表達模式相同，均在發情后期達到峰值，顯著高于其余時期(P<0.05)。

2.3 甘加藏羊視神經、PHPT軸中Kisspeptin、GPR54 蛋白含量分析

由圖3，4可知，視神經組織Kisspeptin蛋白含量在發情后期達到峰值；在乏情期，松果體Kisspeptin高于發情周期各時期，其中間情期顯著高于發情期和發情后期(P<0.05)；下丘腦Kisspeptin蛋白含量在乏情期最高，發情前期表達量顯著高于其他3個時期(P<0.05)；垂體Kisspeptin蛋白含量在間情期達到峰值，顯著高于其他時期(P<0.05)；甲狀腺Kisspeptin蛋白含量在發情前期和發情期差異不顯著(P<0.05)，發情后期和間情期差異不顯著(P<0.05)，但均顯著高于乏情期(P<0.05)。

A.視神經；B.松果體；C.下丘腦；D.垂體；E.甲狀腺。A.Optic nerve；B.Pineal body；C.Hypothalamus；D.Pituitary body；E.Thyroid gland.

圖4 甘加藏羊發情周期和乏情期視神經、PHPT軸組織中Kisspeptin、GPR54蛋白相對表達量Fig.4 Optic nerve and PHPT axis tissues in estrus cycle and anestrus of Ganjia Tibetan sheep relative expression levels of Kisspeptin and GPR54 proteins

視神經GPR54蛋白含量總體呈下降趨勢，在整個發情期內變化不大，其中間情期降到谷底；松果體、下丘腦GPR54均在間情期蛋白含量最高，顯著高于其他時期(P<0.05)；垂體組織GPR54蛋白含量在發情前期最高，并隨發情周期逐漸減少；甲狀腺GPR54蛋白含量在發情前期最高，顯著高于其余時期(P<0.05)。

2.4 甘加藏羊視神經、PHPT軸中Kisspeptin、GPR54免疫陽性產物分布表達

甘加藏羊發情周期視神經、松果體、下丘腦、垂體、甲狀腺中均有Kisspeptin和GPR54蛋白表達。視神經中，Kisspeptin陽性著色主要在神經膠質細胞胞核中(圖5-A)，GPR54主要在神經膠質細胞胞質中(圖5-B)；松果體中，Kisspeptin和GPR54主要表達在松果體細胞胞質中(圖5-C、D)，呈棕黃色強陽性表達，胞核中也有少量表達；下丘腦組織中，Kisspeptin在促垂體區的神經內分泌小細胞和神經膠質細胞中呈強陽性表達(圖5-E)，GPR54主要在神經內分泌小細胞的胞質中表達(圖5-F)；垂體組織中，Kisspeptin和GPR54主要表達在嗜堿性細胞的胞質中(圖5-G、H)；甲狀腺組織中，Kisspeptin和GPR54主要表達在甲狀腺濾泡細胞胞質中(圖5-I、J)。

1.神經膠質細胞；2.松果體細胞；3.神經細胞；4.神經細胞核；5.嗜酸性細胞；6.嗜堿性細胞；7.嫌色細胞；8.濾泡上皮細胞；9.濾泡膠質；10.濾泡旁細胞。1.Glial cell；2.Pineal body cell；3.Neuron；4.Nerve nucleus；5.Eosinophilic cell；6.Basophilic cell ；7.Chromophobe；8.Follicular epithelial cell；9.Follicular glial cell；10.Parafollicular cell.

3 結論與討論

3.1 甘加藏羊血漿Kisspeptin動態變化和發情周期的關系

動物的季節性發情不僅受到光照、溫度和營養等因素的影響，基因調控也是非常重要的原因之一[4]。研究表明，Kiss1及其受體GPR54廣泛參與到動物的季節性發情調控中。作為Kiss1基因的水解產物之一，Kisspeptin會在神經內分泌細胞末梢調控GnRH的分泌。有研究報道[11]，Kisspeptin在母羊非繁殖季節的含量遠低于繁殖季節，這與本研究結果相符。本研究結果顯示，甘加藏羊發情周期各時期血漿Kisspeptin含量呈現脈沖式和波動式交替變化，出現多個波峰和波谷，且在發情周期內血漿Kisspeptin含量遠高于乏情期含量，表明發情周期內高濃度的Kisspeptin是參與甘加藏羊季節繁殖生殖活動調控的因子之一。

研究發現，Kisspeptin與GnRH的分泌改變具有同步性，在與其神經元表面的GPR54結合后，可對后者形成正向反饋作用[16]。葛聞博等[17]在研究甘加藏羊發情周期GnRH分泌規律時發現，甘加藏羊血漿GnRH從發情前期開始升高，在發情后期達到峰值后開始下降，間情期最低。史軍紅等[18]認為，哺乳動物的發情周期內每個卵泡波的出現都伴隨著1個促卵泡素(Follicle-stimulating hormone，FSH)和促黃體素(Luteinizing hormone，LH)分泌峰，而血漿GnRH會正向促進FSH和LH的分泌。Jayasena等[19]也證實了這一點。在本試驗結果中，Kisspeptin分泌量在間情期最低，從發情前期開始，呈上升趨勢，至發情后期達最高值，在第16 天達到一個明顯峰值，后在發情期(第12 小時)、發情后期(第36，39 小時)、間情期(第4，6，9 天)也出現明顯峰值。這與葛聞博等[17]關于GnRH的分泌趨勢研究結果相一致，但二者出現峰值的時間點不同，后者存在一定時間延遲，表明Kisspeptin可能通過促進GnRH的分泌參與到甘加藏羊的季節性繁殖中。

3.2 甘加藏羊視神經、PHPT軸中Kiss1、GPR54 表達變化及其對繁殖的影響

Kiss1、GPR54作為繁殖相關調控基因在人、綿羊、大鼠、小鼠、母豬等[20-25]哺乳動物體內廣泛表達，Tena-Sempere[26]在研究Kiss1/GPR54對人生殖系統的影響時發現，Kiss1、GPR54均會在人下丘腦中離散分布，且GPR54還在甲狀腺、腦垂體中特異表達，其中腦垂體含量最高。Um等[27]在研究魚類和哺乳動物Kiss1和GPR54基因的表達時發現，Kiss1主要分布在大鼠、小鼠、羊的下丘腦中，母豬的下丘腦、垂體、卵巢中也有Kiss1和GPR54mRNA的表達。本研究結果發現，甘加藏羊的視神經、松果體、下丘腦、垂體、甲狀腺組織中均檢測到Kiss1、GPR54mRNA及其蛋白的表達，且不同組織在不同時期有顯著差異。陳衛剛[15]通過免疫組化試驗發現甘加藏羊Kisspeptin、GPR54的陽性產物主要存在于下丘腦的促垂體區和垂體中的嗜堿性細胞中，這與本研究結果一致。本試驗Kisspeptin主要表達在神經膠質細胞、松果體細胞胞質、下丘腦神經內分泌小細胞、垂體嗜堿性細胞胞質以及甲狀腺濾泡細胞胞質中，GPR54主要表達在神經膠質細胞胞質、松果體細胞、下丘腦神經內分泌小細胞胞質以及甲狀腺濾泡細胞胞質中。發情周期Kiss1、GPR54在不同組織的分布及差異性表達表明，Kiss1/GPR54系統可能參與調控甘加藏羊的季節性發情。

哺乳動物視網膜在接收到不同季節的光信號后經視神經傳導，會刺激松果體發生節律性釋放褪黑素，直接或間接影響Kiss1的表達，繼而調控GnRH的表達[28]。本研究結果與之一致，當甘加藏羊處在發情周期內時，視神經Kiss1、GPR54mRNA相對表達量在發情前期就顯著高于其他時期，這可能是短日照致使藏羊褪黑素分泌增多，Kiss1形成的正反饋調節。進入繁殖季節或發情期后下丘腦會大幅合成GnRH，并釋放進入垂體門脈，被血液運送到腺垂體后使垂體細胞合成釋放FSH和LH，FSH和LH在到達卵巢后加快了卵泡的發育、排卵，同時刺激類固醇激素的合成釋放，進而引起動物發情癥狀逐漸明顯[29]。王軍等[30]在研究Kiss1、GPR54基因對綿羊的繁殖調控中發現，在發情狀態下綿羊下丘腦ARC中Kiss1基因表達量明顯上升；而在乏情期時，不管是正常綿羊還是切除了卵巢的綿羊，ARC內Kiss1mRNA表達水平都顯著降低。結合本研究，甘加藏羊下丘腦Kiss1、GPR54mRNA相對表達量均在發情后期達到峰值，整個發情周期總體呈上升趨勢，這也與金慧慧等[31]的結果相似，進一步證實了Kiss1/GPR54系統會通過干涉靶基因GnRH從而參與調控藏羊的季節性繁殖。但郭若婷[32]卻指出，阿勒泰綿羊下丘腦Kiss1在發情期表達最高，與本研究結果不一致，這可能是品種、生長環境及氣候不同所導致的。

褪黑素參與的光周期與類固醇激素的季節性反饋作用會共同調節Kiss1基因在不同繁殖季節的表達[33]。松果體、下丘腦、甲狀腺組織中Kiss1、GPR54基因表達從發情前期開始呈現上升趨勢，在發情后期達到最高，顯著高于非繁殖季節。有研究發現，甲狀腺中有合成褪黑素的2種關鍵酶[34]，提示甲狀腺可自主合成褪黑素。褪黑素會通過光周期的變化來介導甲狀腺中Kiss1的表達，甲狀腺中Kiss1/GPR54在不同時期內的表達變化表明，其可能作為重要的調控因子參與到季節性調控中，這種調控作用而后又會集中表現在調控下游GnRH的表達來影響藏羊季節性發情中。垂體組織中Kiss1mRNA在發情期達到峰值，并顯著高于各個時期。Kisspeptin、GPR54蛋白含量與mRNA檢測結果略有差異，可能是基因在轉錄和翻譯水平存在時空間隔造成的。Kiss1/GPR54系統廣泛參與到甘加藏羊的季節性繁殖調控中，但該系統影響藏羊繁殖的分子機制有待進一步研究。

本研究結果顯示，甘加藏羊血漿Kisspeptin含量在發情周期內呈現動態變化規律，且Kisspeptin水平明顯高于乏情期，表明Kisspeptin參與了藏羊的季節性發情調控。發情周期Kiss1、GPR54mRNA及其蛋白在視神經和PHPT軸中均有表達及分布，且其相對表達量隨發情周期的變化存在一定的差異和動態變化規律，證實Kiss1/GPR54系統是調控藏羊季節性發情周期生理活動的主要調控因子。