基于腸道菌群變化探討健脾泄濁解毒方預防緩解期潰瘍性結腸炎大鼠復發的實驗研究※

劉思雨 郎曉猛 劉建平△ 康 欣

(1.河北省寧晉縣醫院中西醫結合科，河北 邢臺 055550；2.河北省中醫院脾胃病科，河北 石家莊 050011)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是腸道的慢性炎癥病變，以黏液膿血便反復發作為外在表現，亦可有腹痛、腹瀉、里急后重等伴隨癥狀，甚至伴有其他腸外表現。我國UC的發病率約為11.6/10萬，且近年來呈明顯上升及年輕化趨勢[1]。目前UC的發病機制尚不明確，因其反復發作，日久不愈，可給患者帶來極大痛苦和負擔，被世界衛生組織(WHO)列為難治性疾病之一。隨著現代醫學發展，研究者逐漸認識到UC反復發作可能與腸道菌群存在著千絲萬縷的聯系，腸道菌群失衡與恢復，進而引起UC癥狀的加重與緩解[2]。健脾泄濁解毒方是臨床常用的經驗方，前期研究發現其對UC治療效果顯著[3]。為進一步研究健脾泄濁解毒方防治UC的作用，我們通過觀察健脾泄濁解毒方對UC大鼠治療后及第2次造模后糞便中腸道菌群相對含量的變化，探討健脾泄濁解毒方預防UC復發的作用機制，以更好地應用與指導臨床。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)級Wistar大鼠85只，體質量200～220 g，飼養于溫度21～25℃、相對濕度50%～60%的環境，均購自河北醫科大學動物中心，動物合格證號:1804033。

1.2 實驗藥物 健脾泄濁解毒方(藥物組成：黃芪15 g，黨參15 g，茯苓15 g，車前子15 g，魚腥草15 g，大血藤10 g，敗醬草10 g，黃芩10 g，黃連10 g，生薏苡仁15 g，葛根20 g，木香6 g。均采用廣東一方制藥有限公司生產的中藥配方顆粒)；柳氮磺胺吡啶片(上海信誼天平藥業有限公司，國藥準字H31020557，0.25 g/片)。

1.3 主要實驗試劑及儀器 2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)(美國Sigma公司)；基因組DNA抽提試劑盒 (美國Omega Bio-Tek公司)；SYBR Green熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]；PE-9600基因擴增儀(美國PE公司)；實時熒光定量PCR(real time-PCR)分析儀(美國ABI公司)；Chemix-180全自動生化分析儀(日本希森美康公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 第一次造模及分組 所有大鼠適應性喂養1周后，隨機抽取10只大鼠設為空白組，其余75只參照文獻[4]完成復發性UC模型的第一次造模，具體方法：①禁食不禁水24 h后，以10%水合氯醛(0.3 mL/kg)腹腔注射，完全麻醉后，將四肢固定在操作臺上，呈仰臥位；②將2 mm硅膠管連接2 mL注射器，按100 mg/kg抽取TNBS與50%乙醇的混合液，以石蠟油潤滑后，由肛門輕緩插入結腸8 cm處，輕輕推入；③為防止藥物溢出，使藥物與腸黏膜充分接觸，緩慢拔出后倒置大鼠，捏緊肛門15 min，再仰臥放回鼠籠，待蘇醒。期間死亡3只大鼠。正常喂養3 d后將剩余72只大鼠隨機分為模型組、柳氮磺胺吡啶組、健脾泄濁解毒方低劑量組及健脾泄濁解毒方高劑量組，每組18只，各組再隨機處死2只大鼠，觀察結腸組織充血、水腫、潰瘍等情況，確定造模成功。

1.4.2 給藥與糞便標本留取 除空白組正常喂養外，模型組予0.9%氯化鈉注射液10 mL/kg灌胃，柳氮磺胺吡啶組予柳氮磺胺吡啶混懸液0.3 g/kg灌胃，健脾泄濁解毒方低、高劑量組分別予健脾泄濁解毒方藥液8.0、16.0 g/kg灌胃，均每日1次。灌胃14 d后，禁食不禁水24 h，空白組隨機取5只大鼠，其余各組隨機取8只大鼠，處死后留取大鼠結腸病變嚴重處糞便≥1 g，-80 ℃超低溫冰箱中保存，備用。

1.4.3 第2次造模與標本留取 將模型組、柳氮磺胺吡啶組、健脾泄濁解毒方低劑量組及健脾泄濁解毒方高劑量組剩余大鼠按30 mg/kg予TNBS與50%乙醇的混合液進行第2次造模灌注[4]，繼續正常喂養2 d后，禁食不禁水24 h，各組大鼠全部處死，糞便標本留取同1.4.2項。

1.5 觀察指標及方法 比較各組大鼠第1次造模治療后及第2次造模后糞便標本中乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸桿菌及腸球菌相對表達情況，real time-PCR法進行檢測。①各組均準確稱取200 mg 糞便樣品到2 mL離心管內，按試劑盒說明提取總DNA；②根據腸道菌群的16S rRNA基因序列，在BLAST基因庫內應用引物設計軟件Primer 5.0設計相應菌屬的PCR引物；③采用SYBR Green染料進行熒光信號的收集，按試劑盒說明書操作，獲得溶解曲線，應用三步法反應程序,預變性95 ℃ 10 min，然后40個循環反應：95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，最后一個循環72 ℃持續2 min，分析結果；④擴增完畢，獲得擴增曲線后，得到各樣本各目的基因的Ct值，求所有樣本的Ct均值，采用2-△△Ct法計算樣品的DNA相對表達量。PCR引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

2 結果

各組大鼠第1次造模治療后及第2次造模后乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸桿菌及腸球菌相對表達情況比較 與第1次造模治療后比較，柳氮磺胺吡啶組及健脾泄濁解毒方低劑量組第2次造模后乳酸桿菌及雙歧桿菌相對表達量均降低(P<0.05)，腸桿菌及腸球菌相對表達量均升高(P<0.05)，空白組、模型組及健脾泄濁解毒方高劑量組第2次造模后乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸桿菌及腸球菌相對表達量比較差異無統計學意義(P>0.05)。第2次造模后組間比較，模型組乳酸桿菌及雙歧桿菌相對表達量均低于空白組(P<0.05)，腸桿菌及腸球菌相對表達量均高于空白組(P<0.05)；健脾泄濁解毒方高劑量組乳酸桿菌及雙歧桿菌相對表達量均高于模型組(P<0.05)，腸桿菌及腸球菌相對表達量均低于模型組(P<0.05)，而柳氮磺胺吡啶組及健脾泄濁解毒方低劑量組乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸桿菌及腸球菌相對表達量與模型組比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2、3、4、5。

表2 各組大鼠各組大鼠第1次造模治療后及第2次造模后乳酸桿菌相對表達量比較

表3 各組大鼠各組大鼠第1次造模治療后及第2次造模后雙歧桿菌相對表達量比較

表4 各組大鼠各組大鼠第1次造模治療后及第2次造模后腸桿菌相對表達量比較

表5 各組大鼠各組大鼠第1次造模治療后及第2次造模后腸球菌相對表達量比較

3 討論

腸道菌群是腸道內寄居微生物的總稱，其種類多樣，數量龐大，也被稱作人的“第二器官”或“第二大腦”[5-6]。腸道菌群存在于人體生命的整個時期，對維持正常的生理和能量產生至關重要。生理狀態下腸道菌群數量與宿主及外部環境處于相對動態平衡的穩態，在防御病原體侵犯、維生素合成、物質代謝、促進生長、抗衰老、抗癌等方面均起著關鍵的作用[6]。但如果動態平衡被打破，則會引發各類疾病的產生，所以在很多疾病的預防及治療方面，腸道菌群的作用及影響因素可以為其提供參考[7]。近年來研究發現，腸道菌群失調與UC的發生密切關聯，腸道內菌群紊亂，有害菌較有益菌數量占據主導，可導致腸道黏膜屏障功能異常，局部微環境的改變，進而引起腸道黏膜過度的炎性反應，引起UC[8]。相關研究發現，UC患者糞便中的雙歧桿菌、乳酸桿菌含量較健康人含量降低，口服雙歧桿菌膠囊后可使有益菌占據作用位點，促使腸道黏膜屏障得以重建，機體抗感染能力增強，進而緩解UC病情，長遠來看可預防UC復發[9]。

前期我們研究已經證實，通過結腸灌注TNBS與50%乙醇的混合液成功復制UC模型后，大鼠糞便中乳酸桿菌及雙歧桿菌的相對含量可明顯減少，腸桿菌及腸球菌的相對含量可明顯升高，說明大鼠在UC狀態下存在腸道菌群失衡狀態[21]。經相應干預治療后，UC大鼠病情可得到明顯控制，癥狀減輕，糞便中乳酸桿菌及雙歧桿菌相對含量升高，腸桿菌及腸球菌相對含量降低，處于緩解期。繼而本研究又給予第2次造模刺激，與第1次造模治療后比較，柳氮磺胺吡啶組及健脾泄濁解毒方低劑量組第2次造模后乳酸桿菌及雙歧桿菌相對表達量均降低(P<0.05)，腸桿菌及腸球菌相對表達量均升高(P<0.05)，提示柳氮磺胺吡啶組及健脾泄濁解毒方低劑量組大鼠經第2次造模刺激出現了UC復發的情況，腸道內微環境相對不穩定，在適宜情況下有害菌定植的可能性大大增加；而健脾泄濁解毒方高劑量組第2次造模后乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸桿菌及腸球菌相對表達量較第1次造模治療后無明顯變化(P>0.05)，提示高劑量的健脾泄濁解毒方能有效預防和阻止第2次造模刺激導致的UC復發，穩定腸道菌群平衡，具有持久效應。有研究發現，雙歧桿菌通過與腸上皮表面相關受體相結合而形成腸道菌膜屏障，其是維持腸道微生態環境穩定的重要菌屬，亦可通過增強巨噬細胞的吞噬能力，增強腸道黏膜的抗感染作用，而被破壞的腸道黏液層可以被雙歧桿菌修復，從而阻止細菌的黏附，使腸道內環境穩態得以維持，適宜的內環境能促進其他有益菌的生長，又進一步提高了腸道屏障的防御能力，也從側面解釋了健脾泄濁解毒方療效能持久的原因[22]。第2次造模后組間比較，模型組乳酸桿菌及雙歧桿菌相對表達量均低于空白組(P<0.05)，腸桿菌及腸球菌相對表達量均高于空白組(P<0.05)，再次證明了UC大鼠存在腸道菌群失衡狀態；健脾泄濁解毒方高劑量組乳酸桿菌及雙歧桿菌相對表達量均高于模型組(P<0.05)，腸桿菌及腸球菌相對表達量均低于模型組(P<0.05)，而柳氮磺胺吡啶組及健脾泄濁解毒方低劑量組乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸桿菌及腸球菌相對表達量與模型組比較差異均無統計學意義(P>0.05)，也再次證實高劑量健脾泄濁解毒方具有良好的遠期療效，能有效持久的穩定腸道菌群平衡，預防UC的復發，而柳氮磺胺吡啶及低劑量健脾泄濁解毒方的遠期療效較差，不能預防UC的復發。

綜上所述，中醫學認為“正氣存內，邪不可干；邪之所湊，其氣必虛”，高劑量健脾泄濁解毒方能以腸道菌群為作用靶點，通過提高乳酸桿菌、雙歧桿菌相對含量，降低腸桿菌、腸球菌相對含量，使有益菌較有害菌數量占據主導，調節腸道菌群紊亂狀態，進而維持腸道微環境的長久穩態，保持機體健康，有效預防UC復發。