基于生物信息學探究青娥丸治療骨質疏松癥的作用機制※

王 浩 譚國慶 薛海鵬 徐展望△

(1.山東中醫藥大學2019級碩士研究生，山東 濟南 250035；2.山東中醫藥大學附屬醫院脊柱骨科，山東 濟南 250035)

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種骨量減少、骨密度減低、骨脆性增加，從而易發生骨質減少性骨折乃至威脅生命的全身性疾病[1-2]。在人口老齡化形勢不斷加劇的情況下，OP的預防與治療成為人類健康管理的重要研究方向。現代醫學治療OP的藥物一般包括骨礦化促進劑(鈣劑、維生素D)、骨吸收抑制藥(雙膦酸鹽、降鈣素)、骨形成促進劑(氟制劑)，但其過高的費用、較多的毒副作用等問題難以解決[3]。隨著中醫學的發展，中醫藥治療OP體現出不良反應發生率低、辨證論治特異性強、多種療法相結合等獨特優勢，得到了廣泛關注。

青娥丸最早見于《太平惠民和劑局方》，全方由杜仲、補骨脂、核桃仁、大蒜4味組成，方中杜仲溫補肝腎，強筋壯骨；補骨脂補腎壯陽，固精縮尿，溫脾止瀉；核桃仁補腎溫肺，潤腸通便；大蒜溫中行滯，解毒消腫。全方共奏補腎強骨生髓之效，是治療OP的經典名方。現代醫學研究認為，青娥丸有抑制破骨細胞的骨吸收活動、促進成骨細胞的增殖、增強骨的質量和數量等多方面作用[4-5]。本研究基于生物信息學和網絡藥理學方法，科學系統地探究青娥丸治療OP的作用機制，為該方在臨床應用中提供理論支持，并進一步探索中藥組方治療OP的新方向和新思路。

1 資料與方法

1.1 高通量基因表達數據庫(Gene Expression Omnibus，GEO)基因芯片數據分析OP差異表達基因 以“osteoporosis”為關鍵詞檢索GEO中有關OP的實驗數據集，獲得滿足條件的編號為GSE100609的數據集，其中包含了4例從OP女性患者單核細胞中分離的破骨細胞前體細胞為實驗組，4例屬于非OP女性單核細胞中分離的破骨細胞前體細胞為對照組。利用生物信息學之RMA(robust multiarray average)算法背景校正和矩陣數據歸一化處理該數據集，利用R語言技術分析芯片數據，并結合P值和差異倍數(FC)進行篩選，其中顯著差異基因的篩選條件為P< 0.05，logFC絕對值>0.5，最終獲得OP的差異表達基因。

1.2 OP疾病靶基因預測 以“osteoporosis”作為關鍵詞，采用疾病基因數據庫(DisGeNET)、人類基因數據庫(GeneCards)、人類孟德爾遺傳綜合數據庫(OMIM)、人類疾病數據庫(MalaCards)、遺傳藥理學與藥物基因組學數據庫(PharmGKB)等多個數據庫對OP已知靶基因進行檢索與篩選，合并各數據庫的疾病靶基因，將合并后的疾病靶基因與R語言技術分析芯片獲得的差異表達基因取并集，刪除重復的靶基因后，即獲得已明確的OP發病過程的疾病靶點。

1.3 青娥丸有效成分篩選及作用靶點 通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP)和中藥分子機制的生物信息學數據庫(BATMAN-TCM)，檢索杜仲、補骨脂、核桃仁、大蒜4味中藥化學成分，TCMSP數據庫中以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug likeness，DL)≥0.18作為篩選條件，BATMAN-TCM數據庫中以Score off≥20和P≤0.05作為篩選條件，篩選出青娥丸有效成分并將結果導入蛋白質數據庫(Unitprot)進行轉換處理，得到青娥丸有效成分的作用靶點。

1.4 映射靶基因獲取 將所篩選的青娥丸有效成分的作用靶點與OP疾病靶基因交叉生成Venny圖，得出青娥丸與OP的映射靶基因。

1.5 構建“青娥丸藥物-有效成分-靶點”網絡圖 將映射靶基因導入Cytoscape3.7.2軟件，構建“青娥丸藥物-有效成分-靶點”網絡圖，并進行網絡拓撲分析。

1.6 構建蛋白質-蛋白質相互作用網絡圖(PPI網絡圖) 抽取映射靶基因，借助Cytoscape3.7.2軟件構建青娥丸治療OP的PPI網絡圖，根據節點連接度(Degree)值的大小排名順序進行篩選，得到青娥丸治療OP的關鍵靶基因，所獲取的靶基因則是直接或間接調控發揮治療OP作用的關鍵靶點，揭示出青娥丸治療OP的關鍵機制。

1.7 基因本體(GO)生物過程及京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 將映射靶基因導入基因功能注釋數據庫(DAVID)，進行KEGG通路及GO生物過程的富集分析。以P≤0.05，FDR≤0.05為篩選標準，將篩選出的排名前20個GO條目借助R語言ggplot2包繪制富集分析氣泡圖，借助Cytoscape3.7.2軟件構建映射靶基因在KEGG通路上的富集網絡圖。

2 結果

2.1 OP相關差異表達基因檢索 通過OP差異表達基因分析結果顯示，發現542個mRNA存在差異表達，其中上調188個，下調354個，用R語言中heatmap與limma程序包繪制芯片原始的差異基因熱圖與火山圖(見圖1、2)。

圖1 OP相關芯片差異基因聚類圖

2.2 OP疾病靶基因篩選 通過DisGeNET、GeneCards、OMIM、MalaCards、PharmGKB數據庫對OP已知靶基因進行檢索與篩選，合并后共獲得3576個疾病靶基因，將合并后的疾病靶基因與542個差異表達基因取并集并刪除重復值，獲得已明確的OP發病過程的疾病靶點共3811個。

2.3 青娥丸有效成分篩選及作用靶點 在TCMSP及BATMAN-TCM檢索到4味中藥活性成分共計48個，相對應靶點共計1757個，刪除重復值后得到青娥丸最終靶點973個。

2.4 映射靶基因獲取 將所篩選的青娥丸973個靶基因與2.2獲取的3811個OP疾病靶基因交叉生成Venny圖(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html，見圖3)，通過Venny圖可以直觀發現青娥丸對OP靶基因映射率為10%。該方共有973個有效靶點，其中映射靶點433個，作為青娥丸治療OP的直接或間接作用靶基因，占該方作用靶點的44.5%左右，表明該復方在治療OP方面具有顯著特異性。

圖2 OP相關芯片差異基因火山圖

圖3 “青娥丸-OP”映射靶基因Venny圖

2.5 青娥丸藥物-有效成分-靶點網絡圖構建及分析 借助Cytoscape3.7.2軟件構建“青娥丸藥物-有效成分-靶點”網絡圖(見圖4)。按照Degree值排名順序排名前4位的有效成分為：β-谷甾醇、豆甾醇、異補骨脂素、槲皮素，這4種有效成分與多個作用靶點相互關聯，說明這些化合物是青娥丸治療OP的主要有效成分。

圖4 青娥丸藥物-有效成分-靶點網絡圖

2.6 PPI網絡圖構建及分析 將433個映射靶基因導入Cytoscape3.7.2軟件，根據Degre值≥45為篩選條件，得到排名前27位的映射靶基因為青娥丸治療OP的關鍵靶基因，并構建青娥丸治療OP的關鍵靶基因PPI網絡圖(見圖5)，所獲取的靶基因則是直接或間接調控發揮治療OP作用的關鍵靶基因，揭示出青娥丸治療OP的關鍵機制。

圖5 青娥丸治療OP關鍵靶基因PPI網絡圖

2.7 GO生物過程及KEGG通路富集分析 對2.4獲得的映射靶基因采用DAVID數據庫進行GO生物過程和KEGG信號通路分析，得到分子功能、生物過程和細胞成分條目188個，KEGG通路118條，以P≤0.05，FDR≤0.05為標準，并以P值升序排列，分別篩選出符合條件的20個生物過程和20條信號通路，并將GO生物過程以氣泡圖的形式展現出來(見圖6)，將KEGG通路以表格形式展現出來(見表1)，并借助Cytoscape3.7.2軟件構建映射靶基因在KEGG通路上的富集網絡圖(見圖7)。

圖6 青娥丸治療OP映射靶基因的GO生物過程氣泡圖

表1 青娥丸治療OP的KEGG富集通路

圖7 青娥丸治療OP映射靶基因在KEGG通路上的富集網絡圖

3 討論

隨著近年來現代醫學對OP機制的認識，在中醫理論指導下，中藥復方青娥丸防治OP在臨床和實驗中均取得了一定成果[1]。經活性物質篩選及靶點預測發現，青娥丸具有諸多活性物質協同作用調控OP進程。植物甾醇作為一種天然活性成分，廣泛存在于各種植物中，超過250種被學者研究報道，以β-谷甾醇、豆甾醇(stigmasterol)最常見[2]，其生理功能包括抗高脂血癥、抗癌、抗炎、抗氧化和免疫調節等諸多方面[3]。植物甾醇通過抑制小腸對膽固醇的吸收來調節脂代謝，脂代謝異常引起肥胖可影響骨凋亡、骨形成、骨分化、骨微循環、骨吸收等多條信號通路的改變[4]。異補骨脂素(angelicin)是補腎中藥補骨脂有效成分之一，通過激活骨礦化過程激活成骨細胞活性，調節骨代謝，預防骨質疏松。張軍芳等[5]經體外細胞培養初步證明了異補骨脂素及鋅制劑共同作用能促進成骨細胞增殖與分化。進一步試驗表明，異補骨脂素在1×10-5mol/L濃度時能最大程度使大鼠成骨細胞增殖分化成熟，顯著提高細胞堿性磷酸酶(ALP)，增加鈣含量，促進骨鈣素分泌[6]。補骨脂另一成分補骨脂酚(backuchiol)對于去勢導致的雄性小鼠OP有較好治療作用[7]，對雌激素受體(ER)α同樣具有很強的結合親和力，減少絕經后骨質流失[8]。研究表明，補骨脂酚干預OP的可能機制為抑制蛋白激酶B(Akt)和激活蛋白-1(AP-1)途徑改善巨噬細胞刺激集落因子(M-CSF)和核因子κB受體活化因子配體(RANKL)誘導的破骨細胞分化和骨吸收[9]。槲皮素(quercetin)作為經典的抗衰老活性成分，能有效清除衰老的骨髓間充質干細胞，促進骨髓間質干細胞的增殖，刺激成骨細胞活性，改善骨質狀態及結構[10]。槲皮素以其雌激素拮抗劑活性在絕經后OP治療中應用廣泛，臨床OP常規治療基礎上，補充槲皮素明顯改善骨密度、疼痛、骨代謝等指標[11]。青蛾丸具有肝腎同調、精血并補功效，組方中藥富含多種活性成分，能同時影響骨代謝和骨吸收過程，對于改善慢性疼痛、骨丟失具有重要作用。

通過靶點映射發現，大量靶點共同存在于青娥丸及OP，且部分靶基因同時存在于諸多活性物質及通路，說明青娥丸通過調控復雜靶基因網絡，協同各活性物質共同發揮作用。胰島素(INS)為典型降血糖成分，INS缺乏易引起糖脂代謝紊亂，導致體內鈣、磷元素代謝失調,使骨組織微結構破壞，加速OP進程[12]。INS一方面作用于成骨細胞表面受體，上調成骨細胞活性；另一方面調節血糖水平，抑制高糖對成骨細胞的毒性作用[13]。諸多研究發現，葡萄糖不僅對成骨細胞具有毒性作用，同時破骨細胞骨吸收活動對于葡萄糖具有依賴性，破骨細胞在7～25 mmol/L濃度時使骨吸收最活躍[14-15]，因此推測INS是青娥丸在糖尿病性OP臨床治療中具有良好療效的關鍵基礎靶基因。OP發生的根本原因是成骨與破骨之間平衡失調，而蛋白激酶B1(Akt1)正是控制這種平衡的傳導中間體，調控成骨細胞與破骨細胞的成熟分化[16]。而且Akt1不同表達程度也會產生不同生理作用，Tu Q S等[17]使用脂聯素下調Akt1活性來抑制破骨細胞作用，而當Akt1過度表達時又成功逆轉了對破骨細胞分化的抑制作用。在成骨方面,地塞米松能間接活化Akt1誘導成骨細胞及骨細胞的凋亡,而使用Akt1抑制劑能明顯降低成骨細胞凋亡[18]。白細胞介素6(IL-6)是生物學效應廣泛的細胞炎癥因子，廣泛參與破骨細胞分化，最近數據顯示IL-6尤其在絕經期后OP婦女中顯著增加[19]。有關臨床數據表明，雌激素較低時OP患者IL-6水平會高達210.0 ng/L[20]，進一步證明了IL-6在絕經后OP發病過程中的重要作用，其具體作用機制可能為絕經后婦女體內雌激素水平下降，導致雌激素抑制成骨細胞生成腫瘤壞死因子α(TNF-α)能力減弱，TNF-α的增加進一步刺激成骨細胞產生IL-6，進而發揮抑制成骨、促進破骨的作用[21]。血管內皮生長因子(VEGF)一方面通過血管構建對骨組織進行營養供給，增加骨量和治療OP[22]；另一方面通過血管構建，維持骨組織穩定氧環境，抑制因缺氧分泌的炎癥因子進一步加快骨流失。最重要的是VEGF能產生成骨性生長因子，調節成骨細胞的增殖分化及破骨細胞活性[23]。綜上所述，眾多關鍵靶點相互作用，產生復雜作用網絡，調控炎性反應及糖脂代謝等諸多相關生理過程，這可能是青蛾丸干預OP的可能內在機制。

依托DAVID數據庫進行基因可視化。KEGG通路富集分析發現諸多通路關于各種癌癥，癌癥相關通路普遍見于OP的諸多通路研究之中，癌癥患者不僅因自身病變引起代謝異常而面臨原發性OP的風險，而且還可能因特別是削弱性腺功能的相關治療引起繼發性OP[24]。研究顯示，性激素剝奪治療的前列腺及乳腺癌患者骨量丟失尤其明顯[25]，臨床數據顯示前列腺癌去勢治療后OP患病率為37%。去勢治療后降低雄激素，經芳香化而來的雌激素也隨之減少，進而破骨細胞增殖，活性上調，骨吸收增強[26]，因此在延長壽命治療同時也應及時糾正骨量丟失。有研究顯示，選擇性抑制破骨細胞中缺氧誘導因子1α(HIF-1α)的表達，能減弱破骨細胞活性，骨吸收減少，改善骨量[27]。除改善骨代謝外，HIF-1一方面能調節組織、細胞適應低氧或缺氧環境，缺氧對大鼠成骨細胞的骨形成能力起到抑制作用[28]；另一方面，HIF-1也能調控血管生成構建，與VEGF協同作用促進骨血管為骨組織提供氧、營養、激素、細胞因子等物質[29]。越來越多證據表明，肝臟與骨之間有著復雜聯系，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)更是能夠通過多條通路影響骨骼發育成熟。臨床研究表明，NAFLD患者腰椎、髖部等部位的骨密度(BMD)明顯下降[30]。同時,NAFLD與絕經后女性BMD關系更密切，NAFLD被認為是OP的高危因素。NAFLD從肝纖維化、胰島素抵抗(IR)、脂肪因子、胃饑餓素等多個方面對BMD產生影響。研究認為，脂毒性更易引起低骨量和OP, 膽固醇及其代謝產物能影響成骨細胞和破骨細胞活性，降低BMD。基于以上分析，青娥丸通過調控平衡多種細胞因子及代謝干預OP，尤其在性激素代謝方面調控作用顯著，推測這是臨床治療絕經后OP療效顯著的原因。

本研究基于生物信息學相關技術手段，篩選青娥丸有效活性物質及作用靶點，并與OP相關疾病靶點映射分析獲得關鍵靶基因，通過基因可視化尋找青娥丸可能作用通路，相對科學可靠地預測青娥丸干預OP的分子作用機制，為青娥丸的應用及OP的防治提供新思路。但這種信息整合的可靠性依托數據庫的信息準確與否，具體作用機制仍需進一步試驗研究的驗證。