蘋果籽中β-葡萄糖苷酶提取過程的研究

＊陶后怡 凌焰輝 袁滿 唐嬉月 王圓圓 魏勝華

（安徽工程大學生物與食品工程學院 安徽 241000）

β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，E.C.3.2.1.21）又被稱作為β-葡萄糖苷水解酶，它能夠高效水解各類糖苷化合物中結合于末端非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵，從而釋放出β-D-葡萄糖和相應的配基[1]。該酶在自然界中廣泛存在，各類植物的種子，動物的肝臟、小腸等器官以及微生物中都存在β-葡萄糖苷酶[2-3]。

β-葡萄糖苷酶應用領域較多，包括纖維素資源開發、食品加工和糖苷類化合物的合成等方面[4-6]。植物來源的β-葡萄糖苷酶具有多種多樣的功能，特別是其能夠耐受較高濃度的葡萄糖，使其應用遠比微生物來源的β-葡萄糖苷酶廣泛和更有價值。目前商品化的β-葡萄糖苷酶主要來自于苦杏仁，價格及其昂貴。許多研究者探尋從其他植物的種子中去獲取β-葡萄糖苷酶[7-8]。

三相分離是一種較新的蛋白質分離純化技術，目前在蛋白、多糖以及生物活性成分的分離提取中有較多的應用。其有機相和含鹽的水相與蛋白粗提物結合時，能有選擇性地使目標蛋白懸浮在有機相與水相的中間層成為固相。三相分離確切機理到目前還沒有完全闡明，但是人們普遍認為是鹽離子濃度、Kosmotropy、滲透壓應力和表面張力多種因素的綜合效應[9-11]。該方法是一種簡單、快速和易于放大的分離提取酶的方法，不同于硫酸銨鹽析的分步多級沉淀和脫鹽處理，也不同于柱層析的繁瑣操作而造成成本較高，通過三相分離法可以從粗酶提取液中一步分離純化而得到目的酶蛋白，并且能夠達到較高純度和較高收率[12-13]。為了高效和低成本獲得具有較高酶活力的β-葡萄糖苷酶，本文在考察了不同植物種子中β-葡萄糖苷酶的基礎上采用三相法從蘋果籽中提取β-葡萄糖苷酶，優化了三相分離提取酶蛋白的條件，為規模化制備β-葡萄糖苷酶提供了新方法。

1.材料與方法

（1）材料與試劑。蘋果籽和蓖麻籽購自當地種子公司；苦杏仁，購自當地中藥房；榴蓮籽、菠蘿蜜籽，來自當地水果商店；其他試劑購自國藥集團上海化學試劑公司，均為分析純。

（2）高活力β-葡萄糖苷酶的種籽的篩選。將所有的種籽先用自來水浸泡6h后剝殼自然風干粉碎，過200目篩。用預冷的丙酮洗滌2次脫脂風干后獲得粗酶粉；準確稱取1.0g粗酶粉加入石英砂進行研磨，用0.05M的磷酸緩沖液（pH7.0）提取2次，合并提取液后離心10min后收集上清液，測定酶活。

（3）β-葡萄糖苷酶的三相法分離提取。取10mL的粗酶液，在室溫條件下加入一定量研磨成粉末狀的固體硫酸銨，使其飽和度為40%，振蕩使其充分溶解，再加入同等體積的有機溶劑，調節pH為7.0，混勻，并靜置1h，然后將混合體系在1000r/min條件下離心10min，使中間相被壓縮成薄片狀蛋白沉淀。上層的有機相和下層的水相用移液槍移走，收集中間沉淀相，即得提取的β-葡萄糖苷酶。然后用0.05M的磷酸緩沖液（pH7.0）溶解中間沉淀相，并對其酶活性和蛋白質濃度進行測定。在以上初始條件的基礎上，分別對有機溶劑的種類和用量、硫酸銨的飽和度、提取的pH值和溫度進行考察，獲取最佳提取參數。

（4）酶活和蛋白含量的測定。β-葡萄糖苷酶的酶活的測定以硝基苯基-β-D-葡萄糖苷為底物采用比色法進行測定，以對硝基苯酚為標準產物，酶活的定義為：在pH7.0、45℃條件下，每分鐘水解硝基苯基-β-D-葡萄糖苷產生1μmol對硝基酚（pNP）所需要的酶量定義為一個酶活力單位（U）[14]；蛋白質含量的測定以牛血清白蛋白為標準蛋白，采用Bradford法進行測定[15]。

酶活回收率定義為純化后酶所顯示出的酶活力占初始粗酶酶活力的百分數，其計算公式如下：

純化倍數定義為經純化后酶的比酶活與初始粗酶比酶活的比值，其計算公式如下：

2.結果與分析

(1)高活力β-葡萄糖苷酶的植物種籽的篩選

植物的種籽中一般都含有β-葡萄糖苷酶，該酶可以與其他酶協同作用水解種籽中的淀粉生成葡萄糖用以提供其萌發階段所需要的糖分，相比較微生物中廣泛存在的β-葡萄糖苷酶，種子中的酶能夠耐受較高的葡萄糖濃度，使其可以通過逆水解合成糖苷類活性化合物。本試驗選取了市面上常見的幾種植物的種籽，先通過浸泡，促使其酶的活性被激活，然后考察其酶活，試驗結果如圖1所示，由圖中可以看出，酶活最大的是蘋果籽，其次是苦杏仁，最差的是菠蘿蜜的種籽，因此后續的試驗就以蘋果籽作為研究的對象。

圖1 不同種籽中β-葡萄糖苷酶的活力

(2)三相分離條件的優化

①有機溶劑的選擇。分別選取正丁醇、異丁醇、叔丁醇、正戊醇、乙腈等有機溶劑進行三相分離操作，測定純化后的酶活力和蛋白濃度，計算酶活回收率和純化倍數，試驗結果如圖2所示，由圖可以看出，采用為正戊醇作為提取溶劑的效果最好，在三相法提取蛋白的過程中，雖然現在普遍使用的是叔丁醇，但是沒有一定的絕對規律可循，基本上需要試驗驗證。

圖2 不同有機溶劑對分離提取的影響

②正戊醇用量對提取的影響。正戊醇作為有機溶劑能夠同硫酸銨共同作用將酶蛋白從粗提液中分離出來，但是其用量也影響著三相分離提取的效果，圖3顯示了不同正戊醇濃度下三相分離提取的效果，由圖可以看出當提取液與正戊醇的比例為1.0:2.0的時候，三相分離的效果最好，這時候可以將大部分的酶蛋白聚集在中間層，酶的純化倍數和酶活回收都較高。

圖3 正戊醇用量對提取的影響

③硫酸銨飽和度對提取的影響。硫酸銨在三相分離的過程中起著鹽析以及促使相形成的作用，由于帶電離子的作用，蛋白質膠體顆粒表面的一部分電荷被中和，膠體顆粒之間互相排斥的力量減弱，膠體顆粒就會相互聚集，最后沉淀出來。圖4顯示了不同硫酸氨濃度下的三相分離的情況，由圖可以看出，當硫酸銨的飽和度為70%的時候，其分離效果最好。

圖4 硫酸銨飽和度對提取的影響

④pH對提取的影響。pH值影響蛋白的帶電狀態，中間層蛋白的表面電荷濃度影響鹽析作用的效率，而鹽析表面所帶凈電荷與體系的pH相關聯，探究不同pH對三相分離β-葡萄糖苷酶的影響，結果如圖5所示，由圖中可以看出在pH值為5.0的時候，酶活回收率和純化倍數最大，估計5.0在該酶的等電點附近。

圖5 pH值對提取的影響

⑤溫度對提取的影響。酶蛋白從溶液中匯聚到中間相呈固態析出的過程也是蛋白分布從無序到有序的過程，溫度過低酶蛋白的呈相時間越長，且長時間與有機溶劑接觸影響酶的活性，造成目標蛋白變性失活。溫度過高容易造成固液界面酶蛋白的溶解，使酶蛋白難以沉淀下來形成中間相，導致損失大量的酶蛋白，影響目標蛋白酶的純化倍數；此外，過高的溫度也會影響酶的活性。因此考察了不同溫度對三相分離的影響并從中找出三相分離體系的最適溫度，結果如圖6所示，由圖可以看出最佳提取溫度是35℃。

圖6 溫度對提取的影響

(3)提取結果分析

由上述試驗結果可知，三相法從蘋果籽中分離提取分離β-葡萄糖苷酶的最佳條件為：以正戊醇為有機溶劑，其與粗酶液的體積比為2.0:1.0，硫酸氨的飽和度為70%，提取體系的pH值為5.0，提取溫度為35℃，在此條件下在25mL離心管中進行三相提取的操作，其中所有的蘋果籽的起始量為1.0g，試驗結果如表1所示。

表1 三相法分離β-葡萄糖苷酶的結果

由表1可知，通過三相法，最終β-葡萄糖苷酶的純化倍數和酶活回收率分別為7.51%和88.68%，純化效果良好。

3.結論

三相法分離蛋白具有簡便和高效的特點，在酶活篩選的基礎上，選用蘋果籽作為提取β-葡萄糖苷酶的原料，結果表明以正戊醇為有機溶劑，當粗酶液與正戊醇體積比為1.0:2.0，硫酸銨的飽和度為70%，pH值為5.0，提取溫度為35℃時，提取效果最好，最終純化倍數可達7.51，酶活回收率為88.68%，本研究為規模化制備β-葡萄糖苷酶提供了新方法。