微小RNA-16 對急性心肌梗死大鼠心肌細胞凋亡和炎癥反應的影響及其機制研究

賴震宇，趙展慶，余秉昌，蔡秋燕，林奇棟

急性心肌梗死（AMI）是一種以冠狀動脈閉塞導致心肌細胞缺氧和死亡為特征的疾病[1]。微小RNA（miR）是治療心血管疾病的新靶點[2-3]。已經在缺血、缺氧的心臟和心肌細胞中發現了miR 的異常表達[4]。miR-16 可誘導心肌細胞凋亡來加重心肌缺血損傷[5]。在AMI中，抑制miR-16 可保護大鼠心臟免受缺血性損傷[6]，表明miR-16 可能是挽救缺血性心肌的治療靶點。然而，miR-16 在AMI 中的作用機制尚不明確。miRNA 和信使RNA（mRNA）之間的相互作用在AMI 后的轉錄調控中發揮著關鍵作用，已經在AMI患者中發現了競爭性內源性RNA 網絡[7]。維甲酸受體相關孤核受體A（RORA）是維持心臟功能的關鍵保護劑，上調RORA 可抑制心肌細胞的缺氧損傷[8]。此外，RORA 可抑制腫瘤壞死因子-α（TNF-α）介導的核因子κB（NF-κB）通路激活[9]。另有研究顯示，miR-16 是一種潛在的NF-κB 相關miRNA，在心肌梗死大鼠中NF-κB 的激活可上調miR-16 表達[10-11]。然而，在AMI中，RORA 是否介導miR-16與NF-κB 的激活還是未知。使用生物信息學數據庫（TargetScan、starBase、PicTar）搜索了miR-16 下游靶標，預測顯示RORA 與miR-16 具有特定的結合位點，是miR-16 的潛在靶基因。我們推測miR-16的過表達可能是AMI 中RORA 低表達的原因，抑制miR-16 可能通過上調RORA 來預防AMI。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性SD 大鼠80只，體質量（200±20）g，購自濟南朋悅實驗動物繁殖有限公司，合格證號為SCXK（魯）20190003。大鼠在標準條件下飼養：溫度（21±1）℃，濕度55%～60%，可自由獲取食物和水。

1.2 主要試劑與儀器

重組腺相關病毒血清型9（rAAV9）載體攜帶miR-16 抑制劑（rAAV9-anti-miR-16）基因和用于RORA沉默的短發夾RNA（shRNA）（rAAV9-sh-RORA）及相應的陰性對照（rAAV9-anti-NC、rAAV9-sh-NC）、miR-16 模擬物（miR-16 mimic）及其陰性對照（miR-NC）購自上海GenePharm 公司；2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）溶液、核蛋白提取試劑盒購自北京Solarbio 公司；大鼠N 末端B 型利鈉肽原（NT-proBNP）酶聯免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脫氫酶（LDH）ELISA 試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒和TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒（綠色熒光）購自上海碧云天生物技術研究所；兔源一抗B 細胞淋巴瘤因子2（Bcl-2）、Bcl-2 相關X 蛋白（Bax）、NF-κB p65、RORA、TNF-α 和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、組蛋白H3（Histone H3）購自英國Abcam 公司；兔源一抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、裂解的Caspase-3（cleaved-Caspase-3）購自美國Cell Signaling Technology 公司。動物心電圖系統（Nasiff Associates 公司，美國）；Vevo 2100超高分辨率小動物彩色多普勒超聲實時影像系統（VisualSonics 公司，加拿大）；iMark680 多功能酶標儀（Bio-Rad 公司，美國）；BX51 電動顯微鏡（Olympus公司，日本）；ABI Prism?7500 型熒光定量PCR 儀（應用生物系統公司，美國）。

1.3 AMI 大鼠模型的建立

將大鼠隨機分為假手術組（sham組，n=12）和造模組（n=68）。造模組大鼠采用左前降支（LAD）永久結扎法[12]建立AMI 模型。通過腹腔注射戊巴比妥鈉（60 mg/kg）來麻醉大鼠。在第四肋間打開胸腔，露出心臟。用6-0 尼龍縫線在距左耳尖2～3 mm 處結扎LAD。三導聯心電圖用于監測心肌缺血開始時的心率以及典型的心電圖變化。結扎30 min 后觀察到心電圖ST 段明顯抬高和心肌紫紺，AMI 模型即成功建立[12]。為了降低大鼠的死亡率，在結扎后即可在心臟表面滴注（1～2 滴）和腹腔注射（0.1～0.2 ml）利多卡因以預防室性心律失常，并腹腔注射呋塞米（0.1～0.2 ml）以減輕心臟負荷[13]。然后，逐層縫合。sham 組大鼠不結扎冠狀動脈，其余操作同上。

1.4 分組與干預

取60 只造模成功大鼠隨機分為AMI 組、rAAV9-miR-16 抑制劑陰性對照組（rAAV9-anti-NC 組）、rAAV9-miR-16 抑制劑組（rAAV9-anti-miR-16 組）、rAAV9-miR-16抑制劑+RORA短發夾RNA的陰性對照組（rAAV9-anti-miR-16+sh-NC組）、rAAV9-miR-16抑制劑+RORA沉默組（rAAV9-anti-miR-16+sh-RORA 組），每組12 只。rAAV9-anti-NC 組和rAAV9-anti-miR-16 組大鼠分別通過單次尾靜脈注 射200 μl 的rAAV9-anti-NC 和rAAV9-anti-miR-16（含1×1011個載體基因拷貝）[14]；rAAV9-anti-miR-16+sh-NC 組大鼠以相同的方法將rAAV9-anti-miR-16和rAAV9-sh-NC 共同注射到大鼠體內，rAAV9-antimiR-16+sh-RORA 組大鼠以相同的方法和劑量注射rAAV9-anti-miR-16 和rAAV9-sh-RORA，sham組和AMI 組尾靜脈注射等體積的生理鹽水。單次尾靜脈注射，注射2 周后，進行取材和相關指標的檢測。

1.5 取材及指標檢測

1.5.1 超聲心動圖檢測大鼠心功能

將所有大鼠麻醉并仰臥位固定以進行經胸超聲心動圖檢測，評估左心室舒張末期內徑（LVEDD）、左心室收縮末期內徑（LVESD）、左心室射血分數（LVEF）和左心室短軸縮短分數（LVFS）。所有測量值均取自5 個連續心動周期的平均值。

1.5.2 ELISA 法檢測血清NT-proBNP 水平、CK-MB和LDH 活性

心功能檢測完成后，大鼠經腹主動脈取血，靜置后以2 000×g 離心10 min，取血清。ELISA 法檢測血清NT-proBNP 水平、CK-MB 和LDH 活性。

1.5.3 TTC 染色檢測心肌梗死面積

每組隨機選取6 只大鼠，采集血樣后，迅速收集心臟組織。然后，將心臟組織冠狀面切成五片，用0.2% TTC 溶液快速染色。用數碼相機拍攝圖像并使用Image J 軟件進行分析。心肌梗死面積百分比計算為白色面積（梗死區域）/總面積×100%。

1.5.4 HE 染色檢測心肌組織病理學變化

每組剩余6 只大鼠，取結扎線下方的左心室組織。將左心室組織冠狀切分為兩部分，一部分于-80℃保存；另一部分用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片厚5 μm，進行常規HE 染色。于光學顯微鏡下觀察心肌組織病理變化。

1.5.5 TUNEL 染色檢測心肌組織中細胞凋亡

取心肌組織石蠟切片，經脫蠟、水化后，添加TUNEL 染色溶液并在37℃下避光孵育60 min，4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染核10 min。封片，在熒光顯微鏡下觀察切片，并使用Image J 軟件計數TUNEL 陽性（TUNEL+，綠色熒光）細胞，計算細胞凋亡率（TUNEL+細胞/總細胞數×100%）。每張切片隨機選取3 個視野進行統計分析。

1.5.6 逆轉錄定量PCR（RT-qPCR）檢測心肌組織miR-16、RORA mRNA 和TNF-α mRNA、IL-6 mRNA 表達水平

使用Trizol 試劑從心臟組織中分離總RNA 樣品。通過逆轉錄試劑盒將總RNA 逆轉錄為互補DNA（cDNA）。然后，在ABI Prism?7500 型熒光定量PCR 系統中擴增cDNA。熱循環條件如下：95℃10 min，94℃ 15 s，60℃ 30 s 和72℃ 60 s，40 個循環。2-ΔΔCt方法計算靶基因的相對表達量，U6 和GAPDH 用于標準化。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5.7 免疫蛋白印跡（Western blot）法檢測心肌組織中蛋白表達

用放射免疫沉淀法（RIPA）裂解液提取心肌組織總蛋白，并用核蛋白提取試劑盒提取核蛋白質（用于檢測NF-κB p65 水平）。BCA 法測定蛋白質濃度后，將蛋白質（30 μg）變性并通過10% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離并轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脫脂牛奶在室溫下封閉膜1 h。洗滌3 次后，將膜與一抗Bcl-2、Caspase-3、cleaved-Caspase-3、Bax，均以1: 500 稀釋；NF-κB p65、RORA、TNF-α、Histone H3，均以1: 1 000 稀釋；GAPDH，1: 2 000 稀釋在4℃下孵育過夜。然后將山羊抗兔IgG 二抗（HRP，1: 2 000）與膜在室溫下孵育1 h。使用電化學發光（ECL）系統檢測免疫反應，并用Image J 軟件計算條帶灰度值。GAPDH、Histone H3 為內參蛋白。

1.5.8 雙熒光素酶報告基因實驗

miR-16 和RORA 的結合位點由StarBase（http://starbase.sysu.edu.cn/）預測。構建重組熒光素酶報告載體psiCHECK-2，分別攜帶野生型（WT）或突變型（MUT）RORA 的3'-非翻譯區（3'UTR），命名為WT-RORA、MUT-RORA。使 用Lipofectamine 3 000 試劑將24 孔板中的HEK-293 細胞與熒光素酶報告載體（WT-RORA、MUT-RORA）和miR-16 mimic 或miR-NC共轉染。轉染48h后，用雙熒光素酶報告基因檢測系統（Dual-Glo?）測量psiCHECK-2 載體的熒光素酶活性。海腎熒光素酶活性用作內部對照，計算螢火蟲螢光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比率。

1.6 統計學方法

使用GraphPad Prism 8.0 軟件進行統計分析。計量數據以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠心功能指標比較（表2）

表2 各組大鼠的心功能指標比較（n=12，）

注：LVEDD：左心室舒張末期內徑；LVESD：左心室收縮末期內徑；LVEF：左心室射血分數；LVFS：左心室短軸縮短分數；rAAV9：重組腺相關病毒血清型9；RORA：維甲酸受體相關孤核受體A；miR：微小RNA。sham 組：假手術組；AMI 組：急性心肌梗死組；rAAV9-anti-NC 組：rAAV9-miR-16 抑制劑陰性對照組；rAAV9-anti-miR-16 組：rAAV9-miR-16 抑制劑組；rAAV9-anti-miR-16+sh-NC 組：rAAV9-miR-16 抑制劑+RORA短發夾RNA 的陰性對照組；rAAV9-anti-miR-16+sh-RORA 組：rAAV9-miR-16 抑制劑+RORA 沉默的短發夾RNA 組。與sham 組相比*P＜0.05，與AMI 組、rAAV9-anti-NC 組相比△P＜0.05，與rAAV9-anti-miR-16 組、rAAV9-anti-miR-16+sh-NC 組相比▲P＜0.05

與sham 組相比，AMI 組大鼠LVEDD、LVESD 均顯著增大，LVEF、LVFS 均顯著下降（P均＜0.05）；與AMI組、rAAV9-anti-NC組相比，rAAV9-antimiR-16組大鼠LVEDD、LVESD均顯著減小，LVEF、LVFS均顯著升高（P均＜0.05）；與rAAV9-anti-miR-16組、rAAV9-anti-miR-16+sh-NC 組相比，rAAV9-antimiR-16+sh-RORA 組大鼠LVEDD、LVESD 顯著增大，LVEF、LVFS 均顯著下降（P均＜0.05）。

2.2 各組大鼠血清NT-proBNP水 平、CK-MB和LDH活性比較（圖1）

圖1 各組大鼠血清NT-proBNP 水平（1A）、CK-MB（1B）和LDH 活性（1C）比較（n=12）

與sham 組相比，AMI 組大鼠血清NT-proBNP 水平、CK-MB 和LDH 活性均顯著升高（P均＜0.05）；與AMI 組、rAAV9-anti-NC組相比，rAAV9-antimiR-16 組上述指標水平均顯著降低（P均＜0.05）；與rAAV9-anti-miR-16組、rAAV9-anti-miR-16+sh-NC組相比，rAAV9-anti-miR-16+sh-RORA組上述指標水平均顯著升高（P均＜0.05）。

2.3 各組大鼠心肌梗死面積比較（圖2）

與sham 組相比，AMI 組大鼠心肌梗死面積百分比顯著升高（P＜0.05）；與AMI 組、rAAV9-anti-NC 組相比，rAAV9-anti-miR-16 組心肌梗死面積百分比均顯著降低（P均＜0.05）；與rAAV9-antimiR-16 組、rAAV9-anti-miR-16+sh-NC組相比，rAAV9-anti-miR-16+sh-RORA 組心肌梗死面積百分比均顯著升高（P均＜0.05）。

2.4 各組大鼠心肌組織損傷比較（圖3）

圖3 HE 染色檢測各組大鼠心肌組織形態學改變（n=6，比例尺：50μm）

HE 染色結果顯示，sham 組心肌細胞形態規則，心肌纖維排列整齊，無明顯水腫和炎性細胞浸潤；與sham 組相比，AMI 組和rAAV9-anti-NC 組大鼠可見心肌細胞排列紊亂、腫脹、數量減少，心肌纖維出現斷裂，炎性細胞浸潤明顯；與AMI 組和rAAV9-anti-NC 組相比，rAAV9-anti-miR-16組和rAAV9-anti-miR-16+sh-NC 組大鼠可見輕度心肌細胞水腫，少量心肌纖維斷裂，炎性細胞浸潤減少；與rAAV9-anti-miR-16 組和rAAV9-anti-miR-16+sh-NC 組相比，rAAV9-anti-miR-16+sh-RORA 組大鼠心肌細胞排列紊亂，炎性細胞浸潤增加，心肌損傷加重。

2.5 各組大鼠心肌細胞凋亡率比較（圖4）

圖4 TUNEL 染色檢測大鼠心肌細胞凋亡（n=6）

TUNEL 染色結果顯示，與sham 組相比，AMI組大鼠心肌組織中綠色熒光標記的TUNEL+細胞明顯增多，細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與AMI組、rAAV9-anti-NC 組相比，rAAV9-anti-miR-16組細胞凋亡率顯著降低（P＜0.05）；與rAAV9-antimiR-16 組、rAAV9-anti-miR-16+sh-NC 組相比，rAAV9-anti-miR-16+sh-RORA 組細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）。

2.6 各組大鼠心肌組織miR-16、RORA mRNA 和TNF-α mRNA、IL-6 mRNA 水平比較（圖5）

圖5 各組大鼠心肌組織miR-16（5A）、RORA mRNA（5B）、TNF-α mRNA（5C）、IL-6 mRNA（5D）水平比較（n=6）

與sham 組相比，AMI 組miR-16、TNF-α mRNA、IL-6 mRNA 水平均顯著升高，RORA mRNA水平顯著降低（P均＜0.05）；與AMI 組、rAAV9-anti-NC 組 相 比，rAAV9-anti-miR-16 組miR-16、TNF-α mRNA、IL-6 mRNA 水平均顯著降低，RORA mRNA 水平顯著升高（P均＜0.05）；與rAAV9-anti-miR-16 組、rAAV9-anti-miR-16+sh-NC 組相比，rAAV9-anti-miR-16+sh-RORA 組TNF-α mRNA、IL-6 mRNA 水平均顯著升高，RORA mRNA 水平顯著降低（P均＜0.05）。

2.7 各組大鼠心肌組織Caspase-3、cleaved-Caspase-3、Bcl-2、Bax 蛋白水平比較（圖6）

與sham 組相比，AMI 組cleaved-Caspase-3/Caspase-3 比值、Bax 蛋白水平均顯著升高，Bcl-2 蛋白水平顯著降低（P均＜0.05）；與AMI 組、rAAV9-anti-NC 組相比，rAAV9-anti-miR-16 組cleaved-Caspase-3/Caspase-3 比值、Bax 蛋白水平顯著降低，Bcl-2 蛋白水平均顯著升高（P均＜0.05）；與rAAV9-anti-miR-16 組、rAAV9-anti-miR-16+sh-NC 組相比，rAAV9-anti-miR-16+sh-RORA 組cleaved-Caspase-3/Caspase-3 比值、Bax 蛋白水平顯著升高，Bcl-2 蛋白水平均顯著降低（P均＜0.05）。

2.8 各組大鼠心肌組織RORA、TNF-α、NF-κB p65 蛋白表達水平比較（圖7）

圖7 各組大鼠心肌組織RORA、TNF-α、NF-κB p65 蛋白表達水平（n=6）

與sham 組相比，AMI 組RORA 蛋白水平顯著降低，TNF-α 和NF-κB p65 蛋白水平均顯著升高（P均＜0.05）；與AMI 組、rAAV9-anti-NC 組相比，rAAV9-anti-miR-16 組RORA 蛋白水平顯著升高，TNF-α 和NF-κB p65 蛋白水平均顯著降低（P均＜0.05）；與rAAV9-anti-miR-16 組、rAAV9-antimiR-16+sh-NC 組相比，rAAV9-anti-miR-16+sh-RORA組RORA蛋白水平顯著降低，TNF-α 和NF-κB p65 蛋白水平均顯著升高（P均＜0.05），差異均有統計學意義。

2）采集套管氣的技術路線。對于正在生產的抽油井，回油干線的壓力稱為回壓。一般情況下，回壓取決于原油集輸系統的流動阻力。一旦建設完成原油集輸系統，回壓波動將是一個穩定值Ph。

注：6A：蛋白電泳圖；6B：各組Caspase-3、cleaved-Caspase-3、Bcl-2、Bax 蛋白表達量比較。A：假手術組（sham 組）；B：急性心肌梗死組（AMI組）；C：rAAV9-miR-16 抑制劑陰性對照組（rAAV9-anti-NC 組）；D：rAAV9-miR-16 抑制劑組（rAAV9-anti-miR-16 組）；E：rAAV9-miR-16 抑制劑+RORA短發夾RNA的陰性對照組（rAAV9-anti-miR-16+sh-NC 組）；F：rAAV9-miR-16 抑制劑+RORA 沉默的短發夾RNA 組（rAAV9-anti-miR-16+sh-RORA組）。Caspase-3：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3；cleaved-Caspase-3：裂解的Caspase-3；Bcl-2：B 細胞淋巴瘤/因子2；Bax：Bcl-2 相關X 蛋白；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶；miR-16：微小RNA-16；rAAV9：重組腺相關病毒血清型9；RORA：維甲酸受體相關孤核受體A。與sham 組相比*P＜0.05；與AMI 組、rAAV9-anti-NC 組相比 △P＜0.05；與rAAV9-anti-miR-16 組、rAAV9-antimiR-16+sh-NC 組相比▲P＜0.05

2.9 miR-16 靶向調控RORA 表達（圖8）

圖8 靶基因預測和細胞熒光素酶活性結果

通過StarBase 數據庫預測編碼RORA 的3'UTR mRNA 含有miR-16 的結合位點。

雙熒光素酶報告基因實驗檢測結果顯示，與轉染miR-NC 相比，轉染miR-16 抑制劑后，含有WT-RORA 質粒的細胞熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05），含MUT-RORA 質粒的細胞熒光素酶活性未受顯著影響（P＞0.05）。

3 討論

TNF-α 是一種促炎細胞因子，其介導炎癥反應的下游靶標是NF-κB。心臟組織中TNF-α/NF-κB 激活被認為是心肌梗死的標志[15]。有研究發現，病情嚴重且預后不良的AMI 患者NF-κB p65表達水平顯著增加，與AMI 發展和預后相關[16]。RORA 為心肌梗死的關鍵基因[8]。RORA 的缺乏會加劇高脂飲食引起的心肌肥大、纖維化和功能障礙[17]。重要的是，RORA 是一種炎癥調節劑，RORA 的缺失會導致IL-6 表達增強和NF-κB 核轉位[18]。相反，RORA 的過表達可以通過阻斷NF-κB p65 核轉位和調節沉默調節蛋白1（SIRT1）表達限制NF-κB p65在賴氨酸310 處的乙酰化來緩解體內和體外脂多糖（LPS）誘導的炎癥和器官損傷[19]。這些研究表明，RORA 在維持心肌細胞存活中發揮關鍵作用。

本研究結果顯示，缺血性心臟中RORA 表達降低，而miR-16 和NF-κB p65 核轉位均增加。在敲低miR-16后，RORA 上調，TNF-α 表達、NFκB p65 核轉位和心肌細胞凋亡均受到抑制。通過生物信息學預測發現，miR-16 包含RORA 的結合序列。由此猜想miR-16 和RORA 可能存在調控網絡。隨后的雙熒光素酶實驗顯示，miR-16 的過表達可降低WT-RORA 細胞的熒光素酶活性，證實miR-16 可靶向調控RORA。為了進一步驗證miR-16 和RORA 的調控關系，本研究在敲低miR-16 的基礎上，采用小分子干擾技術下調RORA 表達，結果顯示下調RORA 可部分阻斷miR-16 敲低對AMI 大鼠心肌損傷的保護作用，證實了miR-16 可靶向負調控RORA。提示，miR-16 對心肌細胞的有害作用可能是由RORA 的下調賦予的。

miRNA 的生物學功能之一是一個miRNA 可以調節多個基因表達。除RORA外，許多凋亡相關基因已被證實是miR-16 的靶基因。例如，Cao 等[20]表明miR-16 可靶向調節蛋白酪氨酸磷酸酶非受體4型（PTPN4）影響缺氧/復氧誘導的心肌細胞凋亡和自噬；在阿爾茨海默病模型中，miR-16 的高表達可直接靶向和抑制Bcl-2 誘導神經元細胞凋亡[21]。在本研究中，我們確定了RORA 作為miR-16 的直接靶基因，未研究其他潛在靶點，但不能排除所有已驗證的靶基因和miR-16 的其他潛在靶點可能參與其對心肌細胞的影響，這是本研究的局限性之一，在未來的研究中將結合體外細胞實驗對其作用機制進行深入分析。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突