結(jié)直腸癌中RASSF7表達(dá)及其對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響

鄭小影，郭新建，陳瑞慧，王豐梅，冶俊玲，慧 芳

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1標(biāo)本來(lái)源 收集2018～2020年青海大學(xué)附屬醫(yī)院胃腸外科行CRC根治性手術(shù)的80例CRC癌組織及癌旁正常組織石蠟標(biāo)本，患者年齡40～75歲，平均(50.2±4.5)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均未接受術(shù)前放、化療及靶向治療；排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤。所有病例均經(jīng)病理科高年資醫(yī)師會(huì)診后確診，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)，且患者均知情同意。

1.1.2細(xì)胞系 CRC細(xì)胞系SW480、LOVO、HCT116、SW620、RKO及正常腸上皮細(xì)胞NCM460均購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 主要試劑與儀器DMEM培養(yǎng)基、血清(美國(guó)Gibco公司)，Lipofectamine 3000(美國(guó)Invitrogen公司)，RASSF7抗體(美國(guó)Origene公司)，RASSF7 plasmid、ShRNA及ShNC(中國(guó)GenePhrma公司)，Transwell小室(美國(guó)Corning公司)，MTT及DMSO(武漢華美公司)，倒置顯微鏡(日本OLYMPUS)，免疫組化試劑及DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋公司)。

1.3 方法

1.3.1生物信息學(xué)分析 基于GEPIA2數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gepia2.cancer-pku.cn/#index)使用標(biāo)準(zhǔn)的處理管分析來(lái)自GTEx和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中結(jié)腸癌(colon adenocarcinoma, COAD)和直腸癌(rectum adenocarcinoma, READ)的667例正常樣本和367例腫瘤樣本的RASSF7 RNA測(cè)序表達(dá)數(shù)據(jù)。

1.3.2免疫組化及結(jié)果判讀 (1)染色：切取4 μm厚石蠟切片，具體操作步驟嚴(yán)格按免疫組化SP試劑盒及DAB顯色說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，陰性對(duì)照選用PBS代替一抗。(2)判讀標(biāo)準(zhǔn)：RASSF7蛋白在CRC中的表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)。根據(jù)著色細(xì)胞百分比評(píng)分：≤25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分；根據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分：未著色為0分，淺黃色顆粒為1分，深黃色或黃褐色顆粒為2分。將兩項(xiàng)評(píng)分相乘即為該切片的最終得分(0～8分)：≤4分定義為低表達(dá)，>4分定義為高表達(dá)。

1.3.3Western blot 收集待測(cè)細(xì)胞，提取總蛋白，蛋白定量并配制為同一濃度后煮沸至蛋白變性。10% SDS-PAGE的凝膠電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)膜。5%BSA封閉2 h，加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。洗膜后加入對(duì)應(yīng)的二抗，25 ℃孵育2 h。ECL顯色劑發(fā)光，Bio-Image系統(tǒng)測(cè)定條帶灰度值，將其與GAPDH條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

在使用奧斯本檢核表檢核實(shí)驗(yàn)方案時(shí)，可以圍繞實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?個(gè)檢核項(xiàng)目進(jìn)一步細(xì)化，拓展出多個(gè)不同的問(wèn)題進(jìn)行思考，通過(guò)小組討論合作探究，形成新的實(shí)驗(yàn)思路或方案，具體檢核方法見(jiàn)表1。

1.3.4細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 SW480、LOVO、HCT116、SW620、RKO及NCM460置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育。每1～2天換液1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480和HCT116細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞密度達(dá)60%，采用Lipofectamine 3000對(duì)細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染6 h后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h。

1.3.5MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 將轉(zhuǎn)染24 h的細(xì)胞按每孔100 μL培養(yǎng)基中含1 000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，分別于24、48、72、96、120 h收集細(xì)胞，測(cè)吸光度。各組細(xì)胞加入10 μL MTT(5 mg/mL)，培養(yǎng)4 h，吸去上清，每孔加入150 μL DMSO，水平震蕩15 min，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)490 nm處各孔的吸光度(A)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均數(shù)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.3.6Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，將5×105個(gè)細(xì)胞接種到不含血清、鋪有基質(zhì)膠的Transwell上室，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，擦掉表面非侵襲的細(xì)胞，用10%中性福爾馬林固定剩余細(xì)胞，蘇木精染色。隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)侵襲到小室下的細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 CRC組織中RASSF7的表達(dá)基于GEPIA2數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，定義|Log2FC|≤1，P<0.05時(shí)，RASSF7在COAD、READ癌組織中的表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織(P<0.05，圖1)。

圖1 GEPIA2數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)腸癌和直腸癌癌組織及癌旁正常組織中RASSF7的表達(dá)：*P<0.05

本組應(yīng)用免疫組化檢測(cè)80例CRC組織及對(duì)應(yīng)癌旁正常組織中RASSF7蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CRC組織中RASSF7高表達(dá)50例，低表達(dá)30例，CRC癌組織中RASSF7的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織(圖2)。RASSF7高表達(dá)與TNM分期(P<0.001)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.030)相關(guān)；而與患者年齡(P=0.238)、性別(P=0.065)及腫瘤分化程度(P=0.238)無(wú)關(guān)(表1)。

表1 CRC中RASSF7表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

圖2 RASSF7在CRC組織中的表達(dá)：A.癌旁正常組織中RASSF7的表達(dá)，SP法；B.CRC組織中RASSF7的表達(dá)，SP法

2.2 CRC細(xì)胞中RASSF7的表達(dá)為明確RASSF7在CRC細(xì)胞中的表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Western blot法檢測(cè)CRC細(xì)胞系SW480、LOVO、HCT116、SW620、RKO及正常腸上皮細(xì)胞NCM460中RASSF7蛋白的表達(dá)量，結(jié)果顯示：與NCM460相比，RASSF7在CRC細(xì)胞系中的表達(dá)更高(F=55.34，P<0.01，圖3A)。選出RASSF7表達(dá)量較低的SW480(NC組：0.36±0.02vsRASSF7組：0.91±0.02)和表達(dá)量較高的HCT116(shNC組：0.85±0.03vsShRASSF7組：0.28±0.03)分別進(jìn)行過(guò)表達(dá)及敲除，轉(zhuǎn)染效率均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖3B、C)。

圖3 CRC細(xì)胞系中RASSF7的表達(dá)：A.RASSF7在正常腸上皮細(xì)胞及CRC細(xì)胞系中的表達(dá)；B.SW480細(xì)胞株中過(guò)表達(dá)RASSF7的轉(zhuǎn)染效率；C.HCT116細(xì)胞株中敲除RASSF7的轉(zhuǎn)染效率；**P<0.01

2.3 RASSF7對(duì)CRC細(xì)胞增殖能力的影響MTT實(shí)驗(yàn)顯示：SW480細(xì)胞株中過(guò)表達(dá)RASSF7可促進(jìn)細(xì)胞增殖(P<0.01，圖4A)；反之，HCT116細(xì)胞株中敲除RASSF7可顯著抑制細(xì)胞增殖(P<0.01，圖4B)。

圖4 RASSF7對(duì)CRC細(xì)胞株增殖能力的影響：A.過(guò)表達(dá)RASSF7對(duì)SW480細(xì)胞增殖能力的影響；B.敲除RASSF7對(duì)HCT116細(xì)胞增殖能力的影響，**P<0.01

2.4 RASSF7對(duì)CRC細(xì)胞侵襲能力的影響Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：SW480細(xì)胞株過(guò)表達(dá)RASSF7可促進(jìn)細(xì)胞的侵襲能力(NC組：13.30±16.22vsRASSF7組：320.30±17.29，P<0.01，圖5A)；反之，HCT116細(xì)胞株敲除RASSF7可顯著抑制細(xì)胞的侵襲能力(shNC組：197.00±9.54vsshRASSF7組：65.00±6.35，P<0.01，圖5B)。

圖5 RASSF7對(duì)CRC細(xì)胞株侵襲能力的影響：A.SW480中RASSF7過(guò)表達(dá)的侵襲能力；B.HCT116中RASSF7敲除的侵襲能力，**P<0.01

3 討論

CRC是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的第四大惡性腫瘤[4-5]。我國(guó)青海地區(qū)CRC的發(fā)病率居高不下，可能與喜辣的飲食習(xí)慣有關(guān)。盡管近年來(lái)國(guó)內(nèi)外關(guān)于CRC的病因及治療的研究取得了一定進(jìn)步，但是其發(fā)病率和病死率仍呈增長(zhǎng)趨勢(shì)[6-7]。多數(shù)CRC患者就診時(shí)已為晚期，且CRC的治療常以化療為主，但化療具有高毒性且機(jī)體反應(yīng)相對(duì)不敏感[8-10]。因此，通過(guò)尋找特異性的分子靶定標(biāo)志物來(lái)提高CRC患者的早期診療效率，進(jìn)而改善患者預(yù)后，提高患者生存率成為迫切需要解決的問(wèn)題[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合GEPIA2數(shù)據(jù)庫(kù)檢測(cè)RASSF7在CRC組織中的表達(dá)，并通過(guò)臨床樣本和細(xì)胞系進(jìn)行驗(yàn)證，探究RASSF7對(duì)CRC增殖及侵襲的影響。

ANCRASSF7SW480

BshNCshRASSF7HCT116

RASSF蛋白質(zhì)由10名成員組成，以在其C-端(RASSF1-6)或N-端(RASSF7-10)包含RA結(jié)構(gòu)域(Ras相關(guān)區(qū)域)著稱(chēng)。RASSF7(也稱(chēng)HRC1基因)位于染色體11p15.5，與傳統(tǒng)RASSFs不同，RASSF7在多種癌細(xì)胞系中均有表達(dá)[12-13]，且基因芯片結(jié)果顯示RASSF7在多種癌組織中表達(dá)上調(diào)[14-16]，認(rèn)為其可能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[17]。

最近很多研究表明，RASSF7在多種癌組織及細(xì)胞系中高表達(dá)。Zhang等[3]發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞癌中過(guò)表達(dá)RASSF7可以促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制凋亡，敲除RASSF7則作用相反，且其通過(guò)激活MEK1/2-ERK1/2信號(hào)通路發(fā)揮作用。Zheng等[1]證實(shí)RASSF7在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞系中高表達(dá)，且通過(guò)Hippo信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。韓艷春等[2]實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：乳腺癌中RASSF7高表達(dá)且在低氧環(huán)境下可以促進(jìn)乳腺癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移。崔建利等[18]指出RASSF7在人食管鱗狀細(xì)胞癌組織和4種食管癌細(xì)胞系中均高表達(dá)，提示RASSF7基因表達(dá)可能與食管鱗狀細(xì)胞癌的惡性程度及轉(zhuǎn)移相關(guān)。以上研究均提示RASSF7可能參與惡性腫瘤的進(jìn)程。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)：RASSF7在CRC組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織；進(jìn)一步通過(guò)免疫組化檢測(cè)80例CRC臨床樣本結(jié)果提示：RASSF7在CRC組織中的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織，這與數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果一致，且RASSF7高表達(dá)與TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，而與患者年齡、性別及腫瘤分化程度無(wú)關(guān)(P>0.05)，提示RASSF7高表達(dá)可能與CRC的惡性程度及轉(zhuǎn)移有關(guān)；Western blot檢測(cè)CRC細(xì)胞系SW480、LOVO、HCT116、SW620、RKO及正常腸上皮細(xì)胞NCM460中RASSF7的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，CRC細(xì)胞系中RASSF7的表達(dá)量均高于NCM460(P<0.01)。本實(shí)驗(yàn)選擇相對(duì)低表達(dá)RASSF7的SW480和相對(duì)高表達(dá)RASSF7的HCT116分別進(jìn)行過(guò)表達(dá)或敲除RASSF7，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)RASSF7可以促進(jìn)CRC細(xì)胞的增殖及侵襲能力；反之，敲除RASSF7則作用相反。提示RASSF7可能在CRC細(xì)胞的增殖及侵襲中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

綜上，RASSF7在CRC組織和細(xì)胞系中高表達(dá)，敲除RASSF7后細(xì)胞的增殖、侵襲能力均被抑制。然而，RASSF7影響CRC生物學(xué)行為的具體分子機(jī)制目前尚不清楚，還有待于進(jìn)一步研究。