EGFL6促進胃癌細胞增殖、侵襲及轉移能力

門 慧，談 順

我國胃癌的發(fā)病率及病死率均較高，分別位居惡性腫瘤發(fā)病率和病死率的第2位和第3位，患者5年生存率約35.1%，嚴重危害人類健康[1-2]。類表皮生長因子域屬于EGF重復超級家族，其中EGFL6是重要成員之一，又被命名為MAGE[3-4]。EGFL6與多種腫瘤密切相關，可以通過刺激腫瘤血管形成進而促進卵巢癌[5-7]、乳腺癌[8]的侵襲及轉移。本組前期實驗已證實EGFL6在胃癌組織中高表達，與胃癌患者預后呈負相關，并能促進胃癌血管形成[9]。本文著重探討EGFL6表達在胃癌細胞增殖、侵襲及轉移過程中的作用，以提高臨床與病理醫(yī)師的認識水平。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2014～2016年中南大學湘雅醫(yī)學院附屬海口醫(yī)院存檔的40例胃癌手術標本，患者術前均未接受放、化療，男性21例，女性19例，年齡39～58歲，中位年齡48.5歲。另選取距癌組織5 cm以上的癌旁正常胃黏膜組織作為對照。

1.2 細胞及試劑胃癌細胞株來自中南大學湘雅醫(yī)學院附屬海口醫(yī)院，RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自Invitrogen公司，胰酶購自Life公司，EGFL6抗體購自Abcam公司，CCK-8試劑盒購自碧云天生物公司，Boyden小室購自美國BD公司。

1.3 方法

1.3.1細胞培養(yǎng) 人胃癌細胞株(MGC803/MOCK、MGC803/EGFL6)置于10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2CCK-8實驗 選取狀態(tài)良好的胃癌細胞株，消化細胞株鋪96孔板，每孔鋪1×103個細胞，每孔總體積100 μL；每組設計5個目的復孔，1個blank對照孔，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)7天。鋪板24 h后于酶標儀中測450 nm處各孔吸光度值(OD值)，連測7天，最后繪制增殖曲線。

1.3.3Transwell實驗 選取狀態(tài)良好的胃癌細胞株，Boyden小室預處理：小室濾膜鋪基質膠(每小室50 μL)，置于超凈臺紫外照射2 h殺菌，消化細胞株，上室加入200 μL細胞懸液(細胞數(shù)2.0×105個)，下室加入10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基600 μL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)48 h，取出小室，進行清洗、固定、染色，顯微鏡下計數(shù)穿過小室膜細胞數(shù)，200倍光鏡下隨機取上、下、左、右、中心5個視野進行計數(shù)，拍圖，并取其均值。

1.3.4裸鼠肺定植實驗 2組4～6周齡裸鼠，每組5只，每只尾靜脈注射5×106個細胞，28天后解剖裸鼠，取其肺臟并觀察肺轉移情況，10%中性福爾馬林固定標本、取材、包埋、制片，光鏡下觀察腫瘤細胞的肺轉移情況。

1.3.5免疫組化 免疫組化染色采用SP法，提前烤石蠟切片6～8 h，脫蠟、脫水、抗原修復、阻斷滅活內源性過氧化物酶、血清封閉、加入一抗4 ℃冰箱過夜、生物素標記二抗、加入辣根過氧化物酶工作液、DAB顯色、染色及制片。判讀標準：(1)根據(jù)陽性細胞著色程度計分：未著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕褐色為3分；(2)根據(jù)陽性細胞百分比計分：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；將兩項得分結果相加：3～4分為陰性，5～7分陽性。

1.4 統(tǒng)計學分析采用Graphpad Prism 6.0軟件進行統(tǒng)計學分析，兩組均數(shù)間比較用配對樣本t檢驗，生長時間、增殖能力、時間與分組之間比較用析因方差分析，免疫組化結果與臨床參數(shù)的相關性分析用χ2檢驗。α=0.05為檢驗標準。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 胃癌組織中EGFL6蛋白表達免疫組化檢測顯示，EGFL6蛋白表達定位于細胞質(圖1)，胃癌組織中28例EGFL6蛋白陽性(70%，28/40)，癌旁正常胃黏膜組織中5例EGFL6蛋白陽性(12.5%，5/40)，與癌旁正常胃黏膜組織相比，胃癌組織中EGFL6的表達量明顯上調(χ2=27.29，P<0.001)。

圖1 EGFL6在胃癌及癌旁組織中的表達，SP法：A.胃癌組織中陽性；B.癌旁正常胃黏膜組織中陰性

2.2 胃癌組織中EGFL6表達與臨床病理特征的關系EGFL6表達與胃癌患者性別、年齡、腫瘤直徑無相關性，與腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移及TNM分期有相關性(P均<0.05，表1)。

表1 胃癌組織中EGFL6表達與臨床病理特征的關系

2.3 過表達EGFL6后MGC803細胞的增殖能力變化MGC803/MOCK組與MGC803/EGFL6組相比，細胞株生長時間差異有顯著性(F=290.9，P<0.000 1)，細胞增殖能力差異有顯著性(F=572.3，P<0.000 1)，時間與分組之間的交互效應顯著(F=40.45，P<0.000 1)。結果表明，過表達EGFL6后細胞增殖速度明顯增加，提示EGFL6表達促進腫瘤細胞體外增殖能力(表2，圖2)。

表2 CCK-8實驗檢測過表達EGFL6后對MGC803細胞增殖的影響

圖2 CCK-8實驗檢測過表達EGFL6后MGC803細胞株的體外增殖情況

2.4 過表達EGFL6后MGC803細胞的侵襲能力變化與MGC803/MOCK組相比，MGC803/EGFL6組穿過小室膜細胞數(shù)目明顯增多(t=11.34，P<0.000 1)。結果表明，EGFL6表達促進胃癌細胞的體外侵襲能力(圖3)。

圖3 Boyden小室侵襲實驗檢測過表達EGFL6后MGC803細胞株的體外侵襲情況

2.5 過表達EGFL6后MGC803細胞的肺定植能力變化與MGC803/MOCK組相比，MGC803/EGFL6組肺轉移灶數(shù)目明顯多于對照組(t=6.200，P=0.000 3)。結果表明，過表達EGFL6可增強胃癌細胞的體內肺轉移能力(圖4)。

圖4 裸鼠尾靜脈肺定植實驗檢測過表達EGFL6后MGC803細胞株體內肺轉移情況：A.肺轉移結節(jié)大體圖；B.肺轉移結節(jié)鏡下圖；C.肺轉移灶統(tǒng)計圖

3 討論

EGFL6屬于EGF重復超級家族，包涵1個N端信號肽，屬于一種分泌蛋白，研究發(fā)現(xiàn)其參與細胞周期、增殖、發(fā)育調節(jié)、血管形成及腫瘤演進等[10-12]。文獻已報道，EGFL6可以調控ALDH+卵巢癌細胞的不對稱分裂、生長和轉移[5]，EGFL6通過CRISPR/Cas9信號通路調控卵巢癌增殖、侵襲及血管形成[6]，miR-6086通過下調OC2/VEGFA/EGFL6軸抑制卵巢癌血管生成[7]。EGFL6可以增強癌細胞轉移能力及刺激腫瘤血管形成，促進乳腺癌的進展[8]。EGFL6可以作為肺腺癌預后標志物[13]。EGFL6在結直腸癌中高表達并通過Wnt/β-catenin信號通路促進結直腸癌增殖和遷移[14-15]；EGFL6促進食管癌增殖、侵襲和遷移[16]。EGFL6通過AKT信號通路，促進鼻咽癌生長及轉移[17]；EGFL6在胃癌組織中高表達[9,18]；EGFL6能夠促進胃癌血管形成[9]。腫瘤微環(huán)境是腫瘤細胞生命活動的場所，血管可以源源不斷提供營養(yǎng)成分[19-20]，促進腫瘤細胞的發(fā)生、發(fā)展。

本組前期實驗已證實EGFL6 mRNA在胃癌組織中高表達并與患者預后呈負相關，通過旁分泌EGFL6蛋白刺激胃癌血管形成[9]，腫瘤發(fā)展過程中需要足夠豐富的血管源源不斷提供營養(yǎng)支持，胃癌細胞通過自身旁分泌EGFL6蛋白刺激血管形成，為其提供足夠的養(yǎng)分。因此，本實驗進一步探究EGFL6是否在胃癌細胞侵襲、轉移中也發(fā)揮著重要作用。

本組免疫組化結果顯示，EGFL6蛋白在胃癌組織中高表達，其表達與腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移及TNM分期有關。過表達EGFL6后，胃癌細胞MGC803增殖、侵襲及裸鼠尾靜脈肺定植能力均增強，說明EGFL6與胃癌的增殖、侵襲及轉移密切相關。結合本組前期實驗結果，可以得出胃癌細胞通過自身旁分泌EGFL6蛋白，刺激胃癌血管形成，進一步促進胃癌侵襲、轉移，為臨床抗腫瘤治療提供新的靶向參考，具體作用機制還有待深入探究。