Rosai-Dorfman病12例臨床病理及分子特征

王清揚，王曉偉，鐘定榮

Rosai-Dorfman病(Rosai-Dorfman disease, RDD)又稱為伴巨大淋巴結病的竇性組織細胞增多癥，是一種罕見的、原因不明的非朗格漢斯細胞組織細胞增多癥。RDD曾被認為是一種反應性、非腫瘤性疾病，近年來部分支持RDD克隆性的證據已被發現，但由于RDD較為罕見，伴有基因改變的RDD常為個案報道。二代測序技術(next-generation sequencing, NGS)實現了全基因組高通量、低成本和快速化檢測，已在生物醫學領域廣泛應用。因此，本文回顧性分析12例RDD的臨床病理資料及隨訪材料，行免疫組化染色及分子檢測，并結合文獻復習以提高對該病的認識。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集中日友好醫院病理科2012年6月～2020年12月會診及收治的RDD共12例，對其臨床病理資料進行分析，并通過門診復查、病案查詢及電話形式進行隨訪。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 將手術切除及穿刺活檢標本經10%福爾馬林固定，常規脫水、石蠟包埋、切片，HE染色，鏡下觀察。免疫組化染色采用EnVision法，一抗包括S-100、CD68、CD138、CD38、CD3、CD5、CD20、Ki-67、CD1a、Cyclin D1(所用試劑盒購自羅氏公司)，選用組織壞死性淋巴結炎2例及朗格漢斯組織細胞增生癥(Langerhans cell histiocytosis, LCH)2例作為對照。

1.2.2分子檢測 采用基于雜交捕獲的高通量測序法(Hybridization Capture-based NGS)。測序流程包括，(1)DNA提取：石蠟包埋組織10 μm厚連續切片8張，放入1.5 mL離心管，二甲苯脫蠟后使用艾德生物公司FFPE DNA試劑盒按照說明書進行標本DNA提取，溶解于30～100 μL DTE緩沖液中，取適量樣品，對DNA質量濃度進行測定。(2)文庫構建：片段化處理、末端修復、接頭連接、PCR擴增、雜交捕獲。使用Illumina Nextseq 500進行基因檢測，采用艾德生物公司人類癌癥多基因突變聯合檢測數據分析系統進行分析，覆蓋116個基因的外顯子、剪切區域、融合相關內含子。判斷陽性條件：平均有效測序深度>500×，基因突變比例≥0.4%，突變絕對拷貝數≥2，鏈平衡性0.1～10。

2 結果

2.1 臨床特征12例RDD中，男性8例，女性4例，男女比為2∶1，平均年齡40歲(8～80歲)。2例淋巴結型，9例結外型(中樞神經系統2例、皮膚2例、鼻部2例、氣管1例、上縱隔1例、乳腺1例)，1例混合型(累及下頜、腹部皮膚及腋下淋巴結)。12例患者均接受手術治療，7例術后接受激素沖擊治療。9例患者獲得隨訪資料，中位隨訪時間37個月(7～109個月)，4例患者術后6～36個月復發，1例活檢病例緩解，3例無復發，1例不典型病例4年后死亡(表1)。

表1 12例RDD的臨床資料

2.2 病理檢查眼觀：12例中2例為穿刺活檢標本，1例送檢灰白色破碎組織，余腫物均呈結節狀，無包膜，大小1.5 cm×0.8 cm×0.1 cm～4.0 cm×3.0 cm×2.0 cm，切面灰白或灰黃色，實性、質中。鏡檢：低倍鏡下淋巴結型RDD淋巴結結構破壞，皮膚RDD病變位于真皮中，淋巴結外病變常伴有纖維組織增生。中高倍鏡下病變部位可見大量漿細胞、較多淋巴細胞及組織細胞一起呈現出交替的“暗區”和“亮區”(圖1)。“亮區”由病變組織細胞構成，細胞核呈圓形或橢圓形，胞質豐富、嗜酸性，部分組織細胞胞質內吞噬淋巴細胞、漿細胞(即“伸入現象”)(圖2)，其中1例可見吞噬紅細胞和炎細胞的現象；“暗區”主要為增生成片的漿細胞和淋巴細胞構成。淋巴結內病變吞噬現象比結外病變常見。

圖1 慢性炎細胞及組織細胞呈現出交替的“暗區”和“亮區” 圖2 組織細胞胞質內可見淋巴細胞、漿細胞“伸入現象” 圖3 病變組織細胞CD68陽性，EnVision法 圖4 病變組織細胞S-100強陽性，EnVision法 圖5 Cyclin D1在RDD中呈特征性陽性，EnVision法：A.Cyclin D1在RDD病組織細胞胞核及胞質中～強陽性；B.Cyclin D1在RDD組織細胞胞核中等強度陽性；C.Cyclin D1在LCH表現為核強陽性；D.壞死性淋巴結炎增生組織細胞Cyclin D1陰性，僅散在血管內皮細胞陽性

2.3 免疫表型病變組織細胞單核/巨噬細胞相關抗原CD68陽性(圖3)，S-100呈強陽性(胞核+胞質)(圖4)，CD1a陰性；漿細胞CD38、CD138陽性；伸入的淋巴細胞CD3、CD5、CD20陽性；Ki-67增殖指數5%～30%，大部分為炎細胞陽性，病變組織細胞增殖指數均低于10%。RDD組織細胞Cyclin D1均陽性(Cyclin D1均中～強核陽性，個別病例組織細胞胞質弱陽性)，對照組2例LCH表現為Cyclin D1核強陽性，2例組織壞死性淋巴結炎中增生組織細胞呈陰性，僅散在血管內皮細胞陽性(圖5)。

2.4 分子檢測對3例RDD的6個樣本進行了基因檢測。使用的參考基因組版本為hg19，報告中的變異命名遵從HGVS指南中的相關規定進行命名。共發現7種基因突變，包括MAP2K1、NTRK1、KRAS、FGFR3、TSC1、TSC2、NF2(表2)。

表2 3例RDD 6個樣本分子檢測結果

3 討論

RDD是一種罕見的組織細胞性疾病，1969年Rosai和Dorfman對4例RDD進行了詳細描述，并將其命名為“竇組織細胞增多癥伴巨大淋巴結病”[1]。根據RDD病變累及范圍可分為結內型、結外型及混合型[2]。

RDD主要影響兒童和年輕人，平均發病年齡20.6歲，男性略多于女性[3]。大多數患者以局部淋巴結無痛性腫大為主要或唯一表現而就診，可伴發熱、體重下降和盜汗等癥狀，病程長，病情進展緩慢，患者一般情況好[4]。40%患者可出現結外組織或器官受累[5]。本組12例男女比為2∶1，男性明顯多于女性；患者平均年齡38.9歲，大于文獻報道。本組66.7%出現結外受累(8/12)，50%表現為單一結外受累(6/12)，50%以發現腫塊為主要癥狀就診，50%以相應結外器官受累癥狀就診。縱隔是RDD較為罕見的發病部位，既往僅見個例報道[6-8]；本組1例上縱隔病例為39歲男性，伴有頸部淋巴結累及，該患者伴有反復發熱癥狀，4年內住院治療12次，最后一次入院才明確診斷，治療效果差，明確診斷后半年去世。4例累及中樞神經系統的病例，1例合并有顱底骨質破壞伴鼻咽部累及，活檢明確診斷后治療緩解，隨診87個月無癥狀，1例患者切除后無復發，1例患者術后7個月后復發再次手術，術后1年無異常，1例會診病例失訪。文獻報道皮膚型RDD更常見于老年婦女，平均發病年齡43.5歲[9]；本組3例皮膚型RDD中2例為男性，平均年齡54.3歲。

RDD主要的病理形態學特征是低倍鏡下“亮區”與“暗區”交替分布，高倍鏡下病變組織細胞內可見淋巴細胞、漿細胞及紅細胞“伸入現象”。在免疫表型上，病變組織細胞除表達單核/巨噬細胞相關抗原(CD68、CD163)外，胞核及胞質S-100陽性是RDD的重要診斷線索，淋巴結型RDD皮質內漿細胞可被漿細胞標志物(CD38、CD138和MUM1)染色，淋巴細胞表達CD3、CD5及CD20。

在鑒別診斷上，RDD一方面需與富于漿細胞的疾病鑒別。(1)與IgG4相關性疾病鑒別：后者纖維化更明顯，且可出現閉塞性血管炎。(2)與漿細胞瘤鑒別：后者漿細胞呈膨脹性腫瘤性增生，漿細胞群體中淋巴細胞稀少，且不存在成片增生的組織細胞。(3)與漿細胞型Castleman病鑒別：后者淋巴濾泡反應性增生，濾泡周出現漿細胞，無組織細胞聚集成片的現象。另一方面需與富于組織細胞的疾病鑒別。(1)與LCH鑒別：LCH病變主要位于淋巴結的副皮質區，腫瘤細胞中等大小，細胞核可呈咖啡豆樣外觀，可見核溝，胞質較RDD少，且無炎細胞“伸入現象”，CD1a、CD207(Langerin)和S-100陽性提示克隆性增殖[10]，無漿細胞顯著增多現象。(2)與早期的組織細胞壞死性淋巴結炎鑒別：后者常壞死不明顯，增生的組織細胞中可見少量吞噬現象，但組織細胞胞質不如RDD多，吞噬的為核碎裂成分，不是完整的淋巴細胞、漿細胞或紅細胞，伴隨的T淋巴細胞多，而漿細胞極少，但存在漿樣樹突細胞，CD123陽性，而CD38、CD138陰性等。(3)與Erdheim-Chester病鑒別：后者為黃瘤樣組織細胞，胞質中常見脂質，并可見杜頓氏多核巨細胞，合并梭形細胞，且梭形細胞表達組織細胞抗原，可見淋巴細胞浸潤，漿細胞極少見，且約60%病變出現BRAF V600E基因突變。(4)與黃色纖維組織細胞瘤鑒別：后者無成片增生的漿細胞，組織細胞胞質中常見脂質空泡。(5)與黏液變的神經鞘瘤鑒別：后者無漿細胞聚集現象，黏液變區域與RDD的組織細胞區域在高倍鏡下明顯不一樣，淋巴細胞浸潤極少。(6)與肉芽腫性疾病鑒別：后者組織細胞聚集呈團，黏附性強，細胞胞質相對RDD細胞胞質少，且無“伸入現象”。除梅毒等特殊肉芽腫外，漿細胞聚集現象非常少見。

RAS-RAF-MEK-ERK細胞信號通路在實體腫瘤和血液系統惡性腫瘤中發揮重要作用。該通路能影響幾種不同的細胞功能，包括增殖、凋亡、血管生成、遷移和存活[11]。既往在對LCH發病機制的分子研究中發現了與MAPK/ERK途徑相關的互斥復發性體細胞突變，包括BRAF V600E和MAP2K1[12]，在Erdheim-Chester病中也有報道[13]。RDD的病因尚不明確，長期以來被認為是非克隆疾病，但近年來部分支持RDD克隆性的證據已被發現。Garces等[14]的研究顯示：高達33%的RDD病例顯示KRAS或MAP2K1突變，這表明部分病例可能是克隆性的。Durham等[15]對17例RDD進行靶向DNA/RNA測序和全外顯子測序并發現了KRAS、MAP2K1、NRAS及CSF1R突變。本文對3例RDD進行NGS檢測，發現了MAP2K1、NTRK1、KRAS、FGFR3、TSC1、TSC2、NF2突變。例1為56歲男性，皮膚RDD，MAP2K1基因3號外顯子錯義突變，c.371C>A(p.P124Q)以及NTRK1基因9號外顯子突變，c.1024G>T(p.A342S)。MAP2K1基因的c.371C>A(p.P124Q)導致基因編碼蛋白第124位氨基酸由脯氨酸轉變為谷氨酰胺，在一項臨床研究中[16]，1例攜帶MAP2K1 P124Q突變的Erdheim-Chester病患者使用cobimetinib治療后療效為完全緩解。NTRK1基因的c.1024G>T p.A342S導致基因編碼蛋白第342位氨基酸由丙氨酸轉變為絲氨酸，其與腫瘤發生發展的相關性暫不明確。例2為19歲男性，中樞神經系統RDD，KRAS基因4號外顯子錯義突變，c.351A>C(p.K117N)。KRAS基因是人體內最為常見的原癌基因，其負責編碼的RAS蛋白在細胞內的信號通路中起著信號轉導作用，KRAS突變在多種腫瘤中均有發生，在肺癌中占15%～25%[17]，在結直腸癌中高達40%[18]，在胰腺癌中甚至高達70%[19]。KRAS p.K117N屬于明確的致病性突變，該突變的發生可導致KRAS蛋白及其下游MAPK信號通路持續激活，從而促進腫瘤的發生與發展。例3為66歲女性，皮膚及腋下淋巴結RDD，發現多個基因突變：FGFR3基因13號外顯子錯義突變，c.1949A>C(p.K650T)；TSC1基因15號外顯子錯義突變，c.1460C>G(p.S487C)；TSC2基因34號外顯子錯義突變，c.4270G>C(p.D1424H)；NF2基因13號外顯子錯義突變，c.1439C>T(p.T480M)。FGFR3隸屬FGFR酪氨酸激酶家族，參與細胞的增殖、生長、遷移與分化。FGFR3突變在多種腫瘤中均有報道，包括乳腺癌、結直腸癌、肺癌、胰腺癌、腎細胞癌、膀胱癌等。多篇文獻報道顯示[20-22]，胚系FGFR3 K650T突變與家族性軟骨發育低下和黑棘皮癥相關，OncoKB數據庫記錄該突變為疑似致病性突變。本例屬于首次在RDD中發現FGFR3 K650T突變。TSC1、TSC2、NF2突變在既往RDD中未見報道，它們對臨床用藥意義尚不明確。

Cyclin D1是MAPK通路的下游標記之一。92.3%～100%的LCH病例發現了Cyclin D1陽性，與MAPK普遍激活保持一致[23-24]。多篇文獻報道[25-27]Cyclin D1在幾乎所有RDD中均陽性，且顯著高于反應性組織細胞增生和IgG4相關性疾病。本組9例RDD行Cyclin D1免疫組化染色，8例出現病變組織細胞核中～強陽性，部分病例組織細胞胞質亦陽性。Cyclin D1在RDD中特征性陽性，加強了RDD是腫瘤性病變的證據，不僅提示MAPK通路激活可能參與RDD的發病機制，也能作為診斷RDD的一個重要輔助標記。

RDD通常具有自限性且預后良好，但局部切除后容易復發[28]。本組有隨診資料的9例患者中4例復發。文獻報道部分患者可能死于并發癥或感染[3]，特殊部位反復復發也容易致命。對于沒有并發癥和無癥狀的皮膚RDD可觀察隨訪，手術治療是單灶結外RDD和有癥狀RDD的首選治療方式，手術不能完全切除的多灶RDD需輔以系統治療[4-5]。RDD克隆性證據的發現為使用靶向藥物治療提供了理論依據，目前共識建議伴MAPK通路相關基因突變的嚴重或難治性RDD可考慮行靶向治療[4]。

總之，RDD是一種有具有獨特病理形態學特征，通常具有自限性且預后良好的組織細胞疾病。組織細胞標記(CD68、CD163)與S-100在組織細胞中聯合表達，Cyclin D1陽性也可作為RDD輔助診斷的有用標記，伴發的漿細胞增多雖然目前意義不明，但具有重要的鑒別診斷意義。目前RDD尚未被歸類為腫瘤性疾病，但一些支持克隆性證據改變了我們對這類疾病的理解。激素治療往往有效，難治性病例和特殊部位病例也存在致命性可能。