循環(huán)腫瘤細胞與子宮頸癌臨床病理的關(guān)系及臨床意義

李榮崗，廖悅?cè)A，孫麗霞，黃秀芳，周 偉

子宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，近年來呈年輕化趨勢，且中晚期子宮頸癌患者的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移率高、預(yù)后差[1-2]。因此，如何監(jiān)測子宮頸癌患者復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移風險、評估療效成為子宮頸癌治療中的重點和難點。循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cell, CTC)是指在腫瘤形成或進展過程中從原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落進入血液循環(huán)的腫瘤細胞，能夠真實反映腫瘤負荷，具有發(fā)展為轉(zhuǎn)移病變的潛力。CTC在1869年由Ashworth[3]首次發(fā)現(xiàn)，近十幾年來得到廣泛研究。目前，F(xiàn)DA唯一批準的用于監(jiān)測腫瘤的臨床數(shù)據(jù)均為基于CellSearch獲得，且限用于乳腺癌[4]、結(jié)直腸癌和前列腺癌，而對于CTC檢測技術(shù)在子宮頸癌中應(yīng)用的研究甚少。本實驗利用基于親和性的免疫磁珠陰性富集方法聯(lián)合免疫熒光原位雜交技術(shù)(immunofluorescence in situ hybridization, imFISH)技術(shù)，通過回顧性分析健康女性志愿者和子宮頸癌患者外周血CTC，探討CTC與子宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系，并進一步探討CTC檢測技術(shù)在預(yù)測子宮頸癌復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移中的實用價值，從而為臨床醫(yī)師評估子宮頸癌患者預(yù)后提供更多可靠證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料隨機選取廣東省江門市中心醫(yī)院2016年1月～2017年12月經(jīng)病理證實的80例子宮頸癌手術(shù)標本作為實驗組納入研究，其中鱗狀細胞癌70例、腺癌10例。患者年齡36～71歲，中位年齡53歲。根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics, FIGO)2018版[5]子宮頸癌分期系統(tǒng)重新進行分期。由于臨床上對早期(ⅠA～ⅡA期)和進展期(ⅡB～Ⅳ期)子宮頸癌的治療方式不同，因此本研究將實驗組劃為早期組和進展組，分別為18例和62例。其余臨床信息經(jīng)電子病歷查詢獲得。因子宮頸癌患者2年內(nèi)復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移比例較高，故本實驗隨訪結(jié)束時間為確診后24個月，隨訪結(jié)束時實驗組復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移病例47例。另收集47例同期女性健康志愿者為對照組，年齡31～67歲，中位年齡50歲。本實驗獲得醫(yī)院倫理委員會通過，所有患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1CTC檢測 本實驗采用基于親和性的免疫磁珠陰性富集聯(lián)合imFISH檢測受試者外周血CTC。熒光原位雜交樣品處理試劑盒購自江蘇萊爾公司，所有操作規(guī)程及判讀標準按照試劑盒說明書進行。受試者外周血采集應(yīng)用真空采血管采集肘正中靜脈血，為防止穿刺過程中上皮細胞污染，棄用前2 mL血，采集此后的4 mL靜脈血置于ACD抗凝管中。采集的血液樣本12 h內(nèi)去除血漿，裂解液去除紅細胞，磁珠孵育混勻去除白細胞，分離液分離富集腫瘤細胞。使用CD45抗體進行細胞免疫熒光檢測，8號著絲粒探針進行熒光原位雜交。使用奧林巴斯BX63熒光顯微鏡全自動掃描閱片，并進行人工復(fù)核。判讀標準：二倍體信號或CD45陽性為淋巴細胞(圖1A、B)，≥三倍體且CD45陰性為腫瘤細胞(圖1C、D)。根據(jù)試劑盒說明書，以CTC計數(shù)≥2個/4 mL定義為CTC陽性(圖1)。根據(jù)隨訪時間，CTC檢測時間節(jié)點為術(shù)后3、6、12和18個月，若病理組織學和標準影像學確診患者發(fā)生復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移則停止檢測。

圖1 淋巴細胞和腫瘤細胞在熒光顯微鏡下的顯色模式：A.為淋巴細胞二倍體；B.為淋巴細胞CD45陽性；C.腫瘤細胞8號著絲粒探針三倍體；D.腫瘤細胞8號著絲粒探針四倍體

1.2.2病理判讀 所有病理結(jié)果均由兩位高級病理醫(yī)師重新復(fù)核，對懷疑淋巴脈管侵犯的病例加做免疫組化CD31(EP78，即用型)和Podoplanin(D2-40，即用型)證實，兩種抗體均購自北京中杉金橋公司，免疫組化染色采用Roche BENCHMARK-XT全自動免疫組化儀，應(yīng)用EnVision兩步法染色。以病理組織學活檢和標準影像學作為判斷子宮頸癌復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移的金標準。

1.3 統(tǒng)計學方法應(yīng)用SPSS 20.0軟件包進行統(tǒng)計學分析及受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve, ROC)分析。各組資料的比較采用χ2檢驗和Fisher精確概率檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮頸癌患者外周血CTC與臨床病理特征的關(guān)系對實驗組受檢者一般臨床病理資料進行分析，結(jié)果顯示不同年齡、是否絕經(jīng)、病理組織學類型組間外周血CTC差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表1)；而發(fā)生淋巴結(jié)侵犯和未發(fā)生淋巴結(jié)侵犯的CTC陽性率分別為94.87%(37/39)和36.59%(15/41)，發(fā)生淋巴脈管侵犯和未發(fā)生淋巴脈管侵犯的CTC陽性率分別為81.48%(44/54)和30.77%(8/26)，F(xiàn)IGO分期Ⅰ～ⅡA和ⅡB～Ⅳ的CTC陽性率分別為44.44%(8/18)和70.96%(44/62)，提示發(fā)生淋巴結(jié)侵犯和脈管侵犯及臨床分期越高的患者，CTC陽性率越高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 子宮頸癌患者外周血CTC與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.2 對照組與實驗組及實驗組有無復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移患者外周血CTC的差異對照組外周血CTC陽性率為4.26%(2/47)，2例陽性患者經(jīng)人HPV檢測、陰道鏡及腹部超聲檢查，并行子宮頸活檢，診斷為子宮頸慢性炎及子宮肌瘤，未發(fā)現(xiàn)子宮頸惡性病變；實驗組外周血CTC陽性率為65.0%(52/80)，兩組比較差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=53.073，P<0.05)。實驗組有復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移和無復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移患者的外周血CTC陽性率分別為93.62%(44/47)、24.24%(8/33)，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=38.022，P<0.001)。通過ROC分析其曲線下面積達0.803，說明具有良好的特異性(P<0.001，圖2)。

圖2 健康志愿者和子宮頸癌患者CTC檢測的ROC分析

3 討論

2018年WHO統(tǒng)計結(jié)果顯示，全球子宮頸癌每年新發(fā)病例近57萬，死亡病例約31.1萬例，其中我國每年新發(fā)子宮頸癌病例10.6萬，死亡病例約4.8萬例。子宮頸癌的5年總生存率約50%，經(jīng)系統(tǒng)治療后仍有75%患者在2年內(nèi)復(fù)發(fā)。惡性腫瘤的復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后的重要因素。近來，CTC被認為是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要因素之一，目前主要用于腫瘤復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移的風險評估[6-9]。新進研究[10]提示，CTC有望作為藥效動力學和預(yù)測性的生物標志物，為臨床治療決策提供實質(zhì)性的幫助，并有望在精準醫(yī)學快速發(fā)展的今天，成為腫瘤的伴隨診斷標志物，從而有效的篩選出最有可能受益的患者。

CTC是進入到外周血中的腫瘤細胞，被認為是腫瘤轉(zhuǎn)移過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。然而，血液中的CTC極為稀少，如何有效捕獲、分離和收集CTC極具挑戰(zhàn)性。在現(xiàn)有的各種CTC技術(shù)中，基于親和性的CTC捕獲分離技術(shù)使用最為廣泛。該技術(shù)利用CD45磁珠抗體吸附白細胞，在磁場的作用下對其進行去除，可以富集具有全部特征的CTC，包括上皮細胞黏附分子(EpCAM)、CK陰性、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)特征的CTC。

有研究[11]顯示，在子宮頸上皮內(nèi)瘤變和早期子宮頸浸潤癌中，隨著病變程度的加重，基于親和性的免疫磁珠陰性富集的方法CTC的陽性率及數(shù)量均增加。目前，國內(nèi)外關(guān)于檢測CTC在肺癌和乳腺癌中的研究較多，其在評估子宮頸癌預(yù)后價值方面也有文獻報道。Wen等[12]報道顯示，局部晚期子宮頸癌患者行放療后，CTC陽性患者的無瘤生存期較短、預(yù)后差，進一步分析提示CTC是子宮頸癌患者2年無瘤生存期的獨立預(yù)后因素。本實驗同樣基于親和性的免疫磁珠陰性富集檢測方法，結(jié)果顯示子宮頸癌復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移患者的CTC陽性率明顯高于無復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移者，提示CTC檢測技術(shù)可以有效預(yù)測子宮頸癌復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移。此外，本實驗結(jié)果顯示CTC在判斷子宮頸轉(zhuǎn)移癌中具有較高的敏感性和特異性，與金標準具有較高的一致性。同時還發(fā)現(xiàn)，CTC與淋巴結(jié)侵犯、淋巴脈管侵犯和FIGO分期明顯相關(guān)，而與患者年齡、是否絕經(jīng)及組織學類型無關(guān)，提示CTC水平與腫瘤惡性程度相關(guān)，與Wen等[12]研究結(jié)果一致。但Wen等的報道中CTC與FIGO分期無相關(guān)性，與本研究不一致，可能與Wen等收集病例均為晚期子宮頸癌患者有關(guān)。本實驗組中5例死亡患者的CTC檢測結(jié)果均為陽性，提示CTC檢測可以作為評估子宮頸癌轉(zhuǎn)移的預(yù)后指標。

綜上，CTC檢測技術(shù)在評估子宮頸癌復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移中具有較高的敏感性和特異性，且CTC水平與淋巴結(jié)侵犯、淋巴脈管侵犯和FIGO分期相關(guān)，可以反映子宮頸癌的惡性程度，可作為預(yù)測子宮頸癌復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移的重要指標之一。CTC檢測技術(shù)作為液體活檢的重要組成部分，具有微創(chuàng)性甚至無創(chuàng)性、操作簡單、檢測報告周期短等優(yōu)勢，具有可普及性。