穩定敲降多腺苷二磷酸核糖聚合酶1的HaCaT細胞的建立

劉 峰，肖智勇，程軍平，蔣 寧，周文霞，張永祥

（1.軍事科學院軍事醫學研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，北京 100850）

皮膚癌是臨床上最常見的癌癥之一，根據發生部位分為鱗狀細胞癌、基底細胞癌、惡性黑色素瘤和皮膚淋巴細胞瘤等［1-2］。經常性曝曬和紫外線照射是皮膚癌最常見的誘因［3］。流行病學研究表明，其他類型的輻射（如電離輻射）、農藥和石化燃料燃燒產生的多環芳香烴及水和某些食物中的毒素等造成的DNA損傷也是導致皮膚癌的重要因素［4］。

皮膚細胞基因組損傷后可激活多種DNA損傷修復酶［5］，其中最重要的一種是多腺苷二磷酸核糖腺苷二磷酸核糖〔poly（ADP-ribose），PAR〕聚合酶 1（PAR polymerase-1，PARP-1）6］。PARP-1 可結合到DNA單鏈或雙鏈損傷處，通過催化底物煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）合成長≥200個ADP核糖單位的PAR，發揮PAR化作用［7］。PAR化作用是指PAR通過共價或非共價方式結合到靶蛋白對靶蛋白進行修飾的過程，是一種可在生理和病理條件下發生的翻譯后修飾，主要參與遺傳毒性的應激反應。通過這種修飾，PAR可調節靶蛋白的理化性質，進而影響染色質重塑、DNA損傷修復和轉錄、細胞內信號轉導、細胞周期和死亡及表觀遺傳學調控等多種細胞功能［8］。目前，PAR化與DNA損傷修復相關的研究較多。PARP家族共有17個亞型，其中PARP-1作為含量最多的亞型，貢獻了機體90%的PAR化作用。PARP-1作為重要的DNA損傷修復酶被廣泛關注［9］。

目前用于皮膚癌防治藥物篩選的細胞模型主要為基于A431和SCL-1等皮膚癌細胞系的篩選模型，而輻射和環境污染物主要損傷的是正常皮膚細胞的DNA。為研究PARP-1在正常皮膚細胞DNA損傷中的作用，本研究構建含PARP-1短發夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）慢病毒載體質粒（pLVX-shRNA2-puro-PARP-1），轉染至人永生化表皮角化形成細胞HaCaT細胞，獲得單克隆穩定敲降PARP-1蛋白的HaCaT細胞（PARP-1 KD HaCaT細胞），為進一步篩選抗DNA損傷致皮膚癌藥物及機制研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑、引物和儀器

HEK293T人胚腎細胞（本實驗室保存）；人永生化表皮角化形成細胞HaCaT細胞（中國典型培養物保藏中心）。

質粒抽提試劑盒（美國Promega公司）；限制性內切酶EcoRⅠ，BamHⅠ和XhoⅠ及T4 DNA連接酶M0202L（美國NEB公司）；JM109感受態細胞、慢病毒載體質粒pLVX-shRNA2-puro、陰性對照慢病毒載體質粒pLVX-shRNA2-puro-hScramble和HET高效轉染試劑盒BW11002（深圳百恩維生物科技有限公司）；DMEM培養基（美國Cyclone公司）；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（美國Gibco公司）；胰蛋白酶（上海索萊寶生物科技有限公司）；TRIzol RNA提取試劑（美國Invitrogen公司）；cDNA逆轉錄試劑盒和SYBR Premix qPCR試劑盒（日本TaKaRa公司）；兔抗人PARP-1單克隆抗體和辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記山羊抗兔IgG抗體（美國CST公司）；小鼠抗人GAPDH單克隆抗體（北京中杉金橋公司）；Western印跡法SuperSignal HRP化學發光底物（美國Thermo公司）；Cocktail蛋白酶抑制劑（瑞士Roche公司）；Luminex多因子檢測試劑盒（德國Merck公司）；DNA損傷劑硫芥（sulfur mustard，SM）（軍事醫學研究院毒物藥物研究所）。

引物為美國Invitrogen公司合成，分別為質粒測序引物U6-F：5′-TACGATACAAGGCTGTTAGAGAG-3′；PARP-1 RT-qPCR正向引物：GAGCATCCCCAAGGACTCG，反向引物：CCGCTGTCTTCTTGACTTTC；GAPDH RT-qPCR正向引物：AGGTGAAGGTCGGAGTCAAC，反向引物：CGCTCCTGGAAGATGGTGAT。

CountessTM細胞計數儀（美國Invitrogen公司）；F-11 PH計（北京屹源電子儀器科技公司）；DM4000B型熒光顯微鏡（美國Leica公司）；3K15型臺式高速冷凍離心機（美國Sigma公司）；ND2000C型微量紫外分光光度計（美國Thermo公司）；Milei-Q Biocel型純水機及 0.22和 0.45 μm PVDF針頭過濾器（美國Millipore公司）。

1.2 慢病毒載體質粒的構建

針對PARP-1mRNA進行RNA干擾的目標序列為 5′-CGACCTGATCTGGAACATCAA-3′［10］，以此為基礎合成PARP-1 shRNA片段，序列為5′-GATCCCGACCTGATCTGGAACATCAATTCAAGAGATTGATGTTCCAGATCAGGTCGTTTTTTCTCGAGG-3′。將慢病毒載體質粒pLVX-shRNA2-puro與PARP-1 shRNA分別經EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，酶切反應在37℃水浴反應2 h；酶切產物利用T4 DNA連接酶于22℃水浴過夜進行連接反應，將連接產物轉化到JM109感受態細胞。

轉化過程［11］如下：將連接產物與JM109感受態細胞混勻后冰浴30 min，42℃熱激45 s；立即置冰上2 min，加入預熱至室溫的LB培養基400 μL，37℃恒溫搖床（200 r·min-1）培養1 h；2000×g離心1 min，棄去培養上清400 μL，剩余100 μL用移液器混勻后均勻涂布于含氨芐西林100 mg·L-1抗性的LB平板上，倒置，37℃恒溫培養箱培養過夜。分別挑取單菌落接種于含5 mL氨芐西林100 mg·L-1的抗性LB培養液中，37℃恒溫搖床（250 r·min-1）培養過夜。用質粒抽提試劑盒抽提pLVX-shRNA2-puro-PARP-1質粒，并用XhoⅠ限制性內切酶37℃恒溫水浴酶切2 h，在pLVX-shRNA2-puro質粒上含有1個XhoⅠ酶切位點，結合PARP-1 shRNA片段上XhoⅠ位點可切出1320 bp條帶。挑取酶切鑒定連接成功的陽性菌落以引物U6-F進行DNA測序。測序結果包含PARP-1 shRNA序列則表明連接成功。

1.3 慢病毒包裝和制備

將HEK293T細胞培養至對數生長期，用胰酶消化，取6×106細胞接種到10 cm細胞培養皿中，37℃，5%CO2培養箱培養24 h。用含10%FBS、無青霉素和鏈霉素的DMEM完全培養基5 mL在轉染前2 h換液。轉染使用基于脂質體轉染方法的HET高效轉染試劑盒，按說明書方法進行。首先在A管中加入HET緩沖液 A 500 μL，在B管中加入pLVX-shRNA2-puro-PARP-1或陰性對照慢病毒載體質粒 pLVX-shRNA2-puro-hScramble 10 μL、慢病毒包裝混合物（含慢病毒包裝質粒）15 μL、HET緩沖液 B 50 μL和雙蒸水425 μL并混勻。將B管中的液體緩緩逐滴加入到A管，用移液器輕輕混勻并靜置30 min，將液體加入到HEK293T培養皿中，輕輕傾斜混勻，于培養箱中培養16 h。熒光顯微鏡觀察轉染后HEK293T細胞中綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表達。GFP表達陽性表示質粒轉染成功。

棄培養基后換液為完全培養基，繼續培養過夜后收集上清保存于4℃冰箱；重新加入完全培養基10 mL，過夜后再次收集上清。將2次收集的上清混合后200×g離心5 min；上清液以0.45 μm PVDF濾器過濾至50 mL圓底離心管中；4℃，20 000×g離心4 h，棄上清后按每皿（10 cm）加入DMEM 200 μL重懸病毒顆粒，室溫靜置2 h；然后用移液器輕輕吹勻，繼續室溫放置30 min，將提取的病毒顆粒分裝至潔凈的1.5 mL EP管中，-80℃冰箱保存待用。

1.4 慢病毒轉染HaCaT細胞感染復數的測定

HaCaT細胞接種于96孔培養板，每孔1×104細胞。按1，10和100的感染復數（multiplicity of infection，MOI）分別將 1×104，1×105和 1×106含PARP-1 shRNA的慢病毒顆粒加入細胞，CO2培養箱（37℃，5%CO2）孵育24 h。同時設未轉染慢病毒的HaCaT細胞對照組。孵育后吸棄培養液，加入不含病毒的培養液過夜。慢病毒中帶有GFP核酸序列，熒光顯微鏡觀察GFP表達陽性細胞即為成功感染的細胞。轉染效率（%）=鏡下GFP表達陽性細胞數/鏡下細胞總數×100%。每組觀察3個視野，據平均感染效率判斷加入病毒最適MOI值。

1.5 嘌呤霉素濃度的確定

將HaCaT細胞以每孔5×104接種24孔板，孵育過夜后加入含嘌呤霉素（終濃度0，1，3和6 mg·L-1）和10%FBS的DMEM培養基，每組設3復孔。48 h后顯微鏡下拍照，計數活細胞。活細胞數為0時的最低嘌呤霉素濃度為后續實驗用濃度。

1.6 HaCaT細胞慢病毒轉染和單克隆PARP-1 KD HaCaT細胞的篩選

將HaCaT細胞以每孔5×104接種24孔板，孵育6 h貼壁后，每孔加入5×106帶有陰性對照hScramble shRNA或PARP-1 shRNA的病毒顆粒，24 h后加入嘌呤霉素（終濃度為3 mg·L-1）篩選。篩選過程中可見細胞大量死亡，4～7 d后適時胰酶消化轉移至六孔板。待細胞長滿后轉移到培養瓶中擴大培養，分別得到陰性對照（negative control，NC）HaCaT細胞和PARP-1 KD HaCaT細胞。將PARP-1 KD HaCaT細胞稀釋至1.0×104L-1，96孔板中每孔接種100 μL，待細胞貼壁生長后倒置顯微鏡下觀察。將只含有1個細胞的培養孔編號，記錄只有單個克隆的孔，約15 d后即可挑選單克隆穩定敲降PARP-1細胞，即PARP-1 KD HaCaT細胞。

1.7 RT-qPCR法檢測PARP-1 KD HaCaT細胞PARP-1 mRNA表達

用TRIzol試劑提取NC HaCaT細胞和PARP-1 KD HaCaT細胞總RNA，并用cDNA逆轉錄試劑盒合成cDNA。以PARP-1為目的基因，GAPDH為內參基因，qPCR 反應體系為：模板 cDNA 6 μL，SYBR qPCR Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，無RNA酶水2 μL。RT-qPCR實驗參照SYBR Premix qPCR試劑盒說明書進行。反應條件為：95℃ 預變性 1 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃1 min，共40 個循環。以 2-ΔΔCt計算PARP-1mRNA相對表達水平。

1.8 Western印跡法檢測PARP-1 KD HaCaT細胞PARP-1蛋白表達

用含Cocktail蛋白酶抑制劑的RIPA細胞裂解液分別提取NC HaCaT細胞和PARP-1 KD HaCaT細胞總蛋白，并用BSA蛋白質含量檢測試劑盒進行蛋白質定量。均取蛋白質25 μg進行SDS-PAGE凝膠電泳。濕法電轉到PVDF膜上。5%BSA封閉1 h后，分別加入兔抗人PARP-1單克隆抗體（1∶2000）和小鼠抗人GAPDH單抗（1∶10 000），4℃孵育過夜。加入HRP標記山羊抗兔IgG抗體或山羊抗小鼠IgG抗體（1∶10 000）室溫孵育1 h，ECL顯色后于化學發光儀中曝光并掃描分析各條帶積分吸光度（integrated absorbance，IA）。以目標蛋白PARP-1與內參蛋白GAPDH的IA比值表示PARP-1蛋白相對表達水平。

1.9 Luminex法檢測PARP-1 KD HaCaT細胞磷酸化組蛋白H2AX（ γ-H2AX）表達水平

將NC HaCaT細胞和PARP-1 KD HaCaT細胞分別接種于6孔板中，每孔接種3×105細胞，采用10%FBS+DMEM/F12培養基培養。細胞貼壁后給予SM 100和1000 μmol·L-1，孵育6 和24 h后吸棄培養液，用冷PBS清洗1次。每孔加入Luminex多因子檢測試劑盒中的專用裂解液300 μL，4℃孵育10 min，20 000×g離心10 min后取上清得細胞裂解液，分裝凍存于-70℃冰箱。將凍存的上清樣品按Luminex多因子檢測試劑盒說明書步驟上機檢測γ-H2AX表達水平。γ-H2AX表達水平用平均熒光強度表示。

1.10 統計學分析

實驗結果數據以±s表示，用GraphPad Prism 8.0統計學軟件，one-way ANOVA分析進行多組比較，兩組比較使用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 pLVX-shRNA2-puro-PARP-1慢病毒載體質粒鑒定

將pLVX-shRNA2-puro-PARP-1重組質粒提取濃縮后，用XhoⅠ進行酶切鑒定。挑取的3個克隆經XhoⅠ酶切后均獲得約1320 bp條帶，表明為陽性克隆（圖1）。挑取其中1個陽性克隆進行核酸測序，結果表明序列與所設計的PARP-1 shRNA一致（圖2）。綜合酶切和核酸測序結果，表明LVX-shRNA2-puro-PARP-1慢病毒載體質粒構建成功。

Fig.1 ldentification of recombinant positive cloning vectors containing poly（ADP-ribose）polymerase-1（PARP-1）short hairpin RNA（shRNA）（pLVX-shRNA2-puro-PARP-1）.Recombinant plasmids pLVX-shRNA2-puro-PARP-1 were digested by XhoⅠ.M：DNA marker；lanes 1-3：positive clone.

Fig.2 Sequence identification of pLVX-shRNA2-puro-PARP-1 plasmids.PARP-1 targeting sequence"CGACCTGATCTGGAACATCAA"was identified using Sanger sequencing method.

2.2 慢病毒包裝和鑒定

將慢病毒載體質粒pLVX-shRNA2-purohScramble和pLVX-shRNA2-puro-PARP-1分別與慢病毒包裝質粒轉染至HEK293T細胞，培養箱孵育16 h，換液前采用熒光顯微鏡拍照，觀察GFP表達。結果顯示，轉染pLVX-shRNA2-puro-hScramble或pLVX-shRNA2-puro-PARP-1的HEK293T細胞中均可見GFP表達（圖3），表明質粒轉染成功。

Fig.3 Transfection efficiency of lentiviral vector plasmids（×10）.Vector pLVX-shRNA2-puro-hScramble or pLVX-shRNA2-puro-PARP-1 and packaging plasmids were co-transfected with high efficiency transfection kit（HET）into HEK293T cells.Green fluorescent protein（GFP）expression was detected under a fluorescence microscope 16 h after transfection to identify the transfection efficiency of plasmids.

2.3 慢病毒轉染HaCaT細胞MOl值的確定

將含PARP-1 shRNA的慢病毒顆粒轉染至HaCaT細胞，熒光顯微鏡下觀察HaCaT細胞GFP表達。結果顯示，MOI值為100時，轉染效率最高，為（9.60±0.80）%（n=3）；MOI值為10時，轉染效率為（3.60±1.74）%（n=3）；MOI為1時，幾乎未見GFP表達，轉染效率為（0.20±0.20）%（n=3）。未轉染慢病毒的HaCaT細胞對照組無GFP表達（圖 4）。因此，確定轉染時MOI值為100。

Fig.4 Transfection efficiency of PARP-1 lentivirus on HaCaT cells（×20）.HaCaT cells were transfected with PARP-1 lentivirus.GFP expression in HaCaT cells was detected under a fluorescence microscope.MOI：multiplicity of infection；↑：GFP expression.

2.4 篩選單克隆PARP-1 KD HaCaT細胞時嘌呤霉素濃度的確定

圖5結果表明，HaCaT加入嘌呤霉素48 h后，細胞對照組每視野活細胞數為95±36（n=3），嘌呤霉素1 mg·L-1組有少數細胞存活，僅為15±5（n=3），3和6 mg·L-1組HaCaT細胞全部死亡。為此確定篩選單克隆PARP-1 KD HaCaT細胞時嘌呤霉素的濃度為3 mg·L-1。

Fig.5 Determination of puromycin concentration in screening monoclonal PARP-1 KD HaCaT cells（×20）.HaCaT cells were treated with puromycin for 48 h and pictures were taken under a microscope.↑：surviving cells.

2.5 PARP-1 KD HaCaT細胞PARP-1 mRNA和蛋白表達水平

HaCaT細胞經含有PARP-1 shRNA的慢病毒顆粒轉染并用嘌呤霉素（終濃度為3 mg·L-1）篩選15 d，得到單克隆PARP-1 KD HaCaT細胞。RT-qPCR結果（表1）顯示，PARP-1 KD HaCaT 細胞PARP-1mRNA降低為NC HaCaT細胞的約14%。Western印跡法結果（圖6）顯示，PARP-1 KD HaCaT細胞PARP-1蛋白表達水平降低為NC HaCaT細胞的約10%。

Tab.1 Expression of PARP-1 mRNA in negative control（NC） HaCaT cells and PARP-1 knockdown HaCaT（PARP-1 KD HaCaT）cells by RT-qPCR

Fig.6 Expression of PARP-1 protein in NC HaCaT cells and PARP-1 KD HaCaT cells by Western blotting.See Tab.1 for the cell treatment.B was the semi-quantitative result of A.IA：integrated absorbance.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with NC HaCaT cell group.

2.6 硫芥對PARP-1 KD HaCaT細胞 γ-H2AX表達水平的影響

DNA 損傷劑 SM 100 和 1000 μmol·L-1與 NC HaCaT細胞和PARP-1 KD HaCaT細胞作用6 h，與相應的細胞對照組相比，γ-H2AX表達水平均明顯增加（P＜0.01）（圖7 A），但兩種細胞之間無明顯差異；作用24 h，與相應的細胞對照組相比，NC HaCaT細胞γ-H2AX表達無明顯變化，PARP-1 KD HaCaT細胞γ-H2AX表達明顯增加（P＜0.01），且在1000 μmol·L-1時，PARP-1 KD HaCaT細胞γ-H2AX表達較NC HaCaT細胞明顯增加（P＜0.01）（圖7 B）。提示PARP-1敲降可明顯增加SM作用后HaCaT細胞DNA損傷。

Fig.7 Effect of sulfur mustard（SM）on phosphorylated histone H2AX（ γ -H2AX）expression level in PARP-1 KD HaCaT cells.PARP-1 KD HaCaT cells and NC HaCaT cells were treated with SM 100 and 1000 μmol·L-1for 6（A）and 24 h（B），respectively.The expression level of γ-H2AX was detected by Luminex assay.MFI：mean fluorescence intensity.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with corresponding cell control group；##P＜0.01，compared with NC HaCaT cells+SM 1000 μmol·L-1 group.

3 討論

目前認為，PARP-1在DNA損傷修復、基因轉錄和細胞死亡等過程中具有重要作用。PARP-1抑制劑對多種疾病治療具有潛在的應用價值，尤其對DNA修復功能缺陷的腫瘤細胞具有高度敏感性，可有效增加腫瘤患者的生存率。目前已有多種PARP-1抑制劑獲批上市用于腫瘤治療，如維利帕尼（veliparib）、他拉唑帕尼（talazoparib）、尼拉帕尼（niraparib）、蘆卡帕尼（rucaparib）和奧拉帕尼（olaparib）等［12］。由于PARP-1修復DNA損傷時需消耗NAD+和ATP等能量物質，所以嚴重的DNA損傷可導致PARP-1過度激活，進而因能量耗竭導致細胞死亡和周圍組織炎癥。因此，PARP-1抑制劑在缺血再灌注損傷、烷化劑導致的皮膚損傷及炎癥等疾病治療中表現出一定的藥效。

本研究以慢病毒（pLVX-shRNA2-puro）為載體，針對PARP-1mRNA設計干擾序列shRNA，化學合成后采用酶切法插入慢病毒載體質粒。測序和酶切結果顯示，包含PARP-1 shRNA的慢病毒載體質粒構建成功。將該慢病毒載體質粒及包裝質粒共轉染至HEK293T細胞，包裝并提取含有PARP-1 shRNA的慢病毒顆粒。用HaCaT細胞測定最適慢病毒MOI值為100，隨后將該慢病毒轉染至HaCaT細胞，用嘌呤霉素3 mg·L-1篩選出單克隆PARP-1 KD HaCaT細胞。用Western印跡法及RT-qPCR法檢測該細胞PARP-1敲降效率。結果表明，PARP-1 mRNA和蛋白表達水平明顯降低。

γ-H2AX為DNA損傷的指示蛋白。Luminex法檢測結果表明，SM 1000 μmol·L-1作用 24 h，PARP-1 KD HaCaT細胞γ-H2AX表達水平高于NC HaCaT細胞，提示PARP-1敲降可顯著增加γ-H2AX表達，PARP-1在正常皮膚細胞HaCaT的DNA損傷修復中發揮重要作用。

與siRNA介導的瞬時轉染敲降基因的方式不同，本研究采用慢病毒載體轉染HaCaT細胞，PARP-1 shRNA序列可通過慢病毒整合到細胞基因組中，得到穩定敲降PARP-1的PARP-1 KD HaCaT。上述結果表明，本研究所構建的PARP-1 KD HaCaT細胞可用于抗DNA損傷藥物篩選及其機制研究，可為后續研究提供可靠的細胞模型［13］。

目前，皮膚癌研究中常用的細胞模型多為癌細胞，本研究中選用的HaCaT細胞是人永生化的表皮角化形成細胞，是皮膚相關實驗中常用的正常細胞模型，對比皮膚癌細胞更適用于正常皮膚損傷的相關研究［14-15］。因此，本研究成功構建的含PARP-1 shRNA的慢病毒載體質粒和PARP-1 KD HaCaT細胞，可為進一步研究PARP-1在正常皮膚細胞DNA損傷中的作用機制奠定基礎。