SD大鼠灌胃染毒蓖麻籽的毒代動力學研究及臨床中毒樣品初步檢測

付佳婷，張 瑛，張文鵬，郭 磊，徐 斌，謝劍煒

（1.軍事科學院軍事醫學研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，北京 100850；2.華北理工大學藥學院，河北 唐山 063210；3.北京市公安司法鑒定中心，法庭毒物分析公安部重點實驗室，北京 100192）

蓖麻（Ricinus communis）為大戟科蓖麻屬下的唯一物種，是我國首要油料作物，在我國南北方廣泛種植。蓖麻全株可入藥，有祛濕通絡、消腫、拔毒等功效；蓖麻種子（蓖麻籽）用于榨取富含甘油三酯的蓖麻油，因其具有黏度高、凝固點低、耐寒、耐高溫等特點，是紡織、冶金、化工、機電等工業重要原料［1］。但蓖麻又屬有毒植物，其毒性成分主要包括蓖麻毒素蛋白（ricin）、蓖麻凝集素蛋白和小分子化合物蓖麻堿（ricinine）等。蓖麻堿化學名為N-甲基-3-氰基-4-甲氧基-吡喃酮，分子式為C8H8N2O2，相對分子質量為164.17，屬劇毒生物堿，主要存在于蓖麻的莖葉和籽實中。小鼠sc給予蓖麻堿的LD50為25 mg·kg-1。過量服食可引起嘔吐、呼吸抑制和腎損害等［2-3］。

鑒于全球范圍內蓖麻毒素恐怖活動和蓖麻相關中毒事件時有發生，針對蓖麻毒素蛋白的分析檢測方法已有諸多報道。但蓖麻毒素蛋白具有體內易降解、檢測時間窗窄（＜8 h）、方法技術需求高和檢測周期長等問題［4-6］，現有方法仍無法滿足臨床中毒診斷的需求。蓖麻堿與蓖麻毒素蛋白同時存在于蓖麻籽中，誤服蓖麻籽后體內蓖麻堿暴露量相對較高，其檢測方法簡便、靈敏，適于生物醫學樣品的檢測［7-10］，目前已用于蓖麻籽接觸或中毒者生物樣品的檢測。本研究建立一種血漿中蓖麻堿的液相色譜-三重四極桿串聯質譜（liquid chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry，LC-QqQ MS/MS）定量分析方法，檢測ig染毒后蓖麻堿在SD大鼠體內的毒代動力學參數，并嘗試將該法用于臨床中毒者血漿和尿液樣本的半定量檢測。

1 材料與方法

1.1 試劑和主要儀器

蓖麻堿參考品（貨號R495550，批號2-KAS-3，純度大于98%），加拿大TCI公司；氫溴酸東莨菪堿對照品（貨號：100476，批號：100476-180301），中國食品藥品檢定研究院，14個不同產地蓖麻籽分別購于河北、山西、四川等藥材市場；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）和甲酸（質譜級），均美國Fisher公司。

SPF級健康雄性SD大鼠，15只，體重180～220 g，由斯貝福（北京）生物技術有限公司提供（動物合格證號1103241911031288）。實驗前，大鼠飼養于室溫23.5～24.5℃、相對濕度為45%～55%的條件下，明暗各12 h（8∶00～20∶00燈光照明），飼料為嚙齒類普通維持飼料，自由飲食飲水。所有動物實驗遵循軍事醫學研究院動物實驗倫理委員會規定。

1200型液相色譜儀和6430型LC-QqQMS/MS系統，配備電噴霧電離源，液相泵、自動進樣器和在線脫氣裝置，美國安捷倫公司；Synergi Polar-PR 100?色譜柱（100 mm×2 mm，2.5 μm），美國飛諾美公司；渦旋振蕩器（Vortex-Genie2），美國Scientific Industries公司；十萬分之一電子分析天平（PL203），美國梅特勒-托利多公司；臺式高速冷凍離心機（3K30），美國Sigma公司；低溫組織破碎儀（SPEX6775），美國SPEX公司；多功能靜音型超聲波清洗機（LMDTC-10F），中國綠綿科技有限公司；真空離心濃縮儀（RCD33），德國Christ公司；超純水（18 MΩ·cm）由Milli-QA10超純水儀制備，美國Millipore公司。

1.2 標準溶液和工作溶液的配制

精密稱取蓖麻堿和氫溴酸東莨菪堿各2.0和2.5 mg，以50%甲醇水溶液配制得到濃度為0.2 g·L-1母液（氫溴酸東莨菪堿按東莨菪堿計）；取蓖麻堿母液，以50%甲醇水溶液逐級稀釋至5000，3750，1000，250，50，10，2，1和0.5 μg·L-1，作為系列標準溶液；取東莨菪堿母液，以50%甲醇水溶液逐級稀釋至500 μg·L-1作為內標溶液。

取40 μL正常大鼠血漿，分別加入10 μL蓖麻堿標準溶液和2.5 μL東莨菪堿內標溶液，制備成為蓖麻堿血漿濃度為1000，750，200，50，10，2和1 μg·L-1的工作曲線樣品。所有溶液4℃儲存備用。

1.3 色譜和質譜條件

色譜條件：Synergi Polar-PR 100?色譜柱（100 mm×2 mm，2.5 μm），柱溫40℃，進樣體積5 μL。流動相A為含0.1%甲酸水溶液，B為乙腈。梯度洗脫程序為：0～1 min，15%B；1～5 min，15%～90%B；5.1～7 min，15%B。流速為0.3 mL·min-1。

質譜條件：ESI源，正離子方式檢測，源溫350℃，噴霧電壓4 kV，噴霧氣壓力40 psi，氮氣流速10 L·min-1；掃描方式：多反應監測（MRM）；用于分析的離子對分別為：蓖麻堿定量離子對質荷比（m/z）165→138（碎裂電壓130 V，毛細管電壓17 V），定性離子對為m/z165→82（碎裂電壓130 V，毛細管電壓29 V）；東莨菪堿（內標）定量離子對為m/z304→156（碎裂電壓110 V，毛細管電壓13 V）。

1.4 測定不同產地蓖麻籽中蓖麻堿含量

分別選取14個不同產地蓖麻籽并標號，將種子均勻鋪成3層，每一層隨機取5顆共15顆，進行去殼、稱量，加入研磨鋼珠后用低溫組織破碎儀進行研磨，后加入種子質量5倍的超純水，充分渦旋，超聲振蕩10 min，14 000×g離心10 min，取上清液1 mL置于進樣瓶中用于LC-MS/MS定量檢測。

1.5 動物、染毒和血漿樣品處理

結合已報道蓖麻籽的LD50數據［3］，確定大鼠ig給予蓖麻籽勻漿液的染毒劑量（折算成蓖麻堿量）分別為0.3，1.0和3.0 mg·kg-1，即大鼠體重按200 g計，每粒蓖麻籽平均重量0.2 g，則染毒劑量相當于每只大鼠ig 1/3，1和3粒蓖麻籽。

使用新鮮T11號蓖麻籽，超純水勻漿后以超純水稀釋至相當于蓖麻堿含量0.6，0.2和0.06 kg·L-1，待染毒使用。每劑量組5只大鼠，每只大鼠ig體積為1.0 mL。分別于ig前后0.25，0.5，1，2，4，6，8，12和24 h時進行眼眶后靜脈叢采血，肝素鈉抗凝，經1000×g離心10 min后取上清得到血漿樣品。

取血漿樣品50 μL加入2.5 μL東莨菪堿內標溶液500 μg·L-1，渦旋1 min；加入甲醇∶乙腈（3/1，V/V）混合溶液200 μL沉淀蛋白，渦旋1 min，14 000×g離心10 min；取上清液，50℃真空離心濃縮2 h；待溶液旋干后加入15%乙腈水溶液50 μL，渦旋1 min，14 000×g離心10 min，上清液轉移至進樣瓶中待測。

使用Phoenix WinNonlin軟件（版本號8.2），分別對0.3，1.0和3.0 g·kg-1組大鼠不同時間點血漿中蓖麻堿的血藥濃度進行非房室模型擬合［11］，并繪制血漿濃度-時間曲線圖，計算血漿毒動學參數。

1.6 血漿樣品分析方法學驗證

1.6.1 工作曲線和定量下限

以蓖麻堿濃度為橫坐標（X），蓖麻堿與內標峰面積比值為縱坐標（Y），以加權（1/X2）最小二乘法進行線性回歸，即得工作曲線，其定量下限為工作曲線上最低濃度點。

1.6.2 批內、批間精密度和準確度

取同一批母液加入SD大鼠空白血漿中，配制800（高），75（中）和2.5（低）和1 μg·L-1（定量下限）4個濃度的質控樣品，每個濃度平行制備6個樣本，根據隨行測定的工作曲線計算質控樣品的實際濃度。該法的測量值與分析物標示濃度的接近程度為批內準確度，以相對誤差（RE，%）表示；而6個測量值之間的相對標準差（RSD，%）即為批內精密度；連續3 d進行相同操作，測得批間精密度和準確度。

1.6.3 回收率和基質效應

為考察大鼠血漿中復雜基質對檢測結果的影響，參照1.5處理6個來自不同個體的大鼠空白血漿，復溶時，加入適量母液，用15%乙腈水溶液稀釋為濃度800和2.5 μg·L-1的含基質樣本，同時用15%乙腈水溶液稀釋母液為濃度800和2.5 μg·L-1的溶液樣本，通過計算內標歸一化的基質因子的變異系數考察基質效應，以變異系數≤15%為符合基質效應的要求。同時，在800和2.5 μg·L-1濃度2個水平下比較血漿樣本與溶液樣本的峰面積考察回收率。

1.6.4 殘留效應

取處理后的高濃度蓖麻堿質控樣品（750 μg·L-1）和空白血漿樣本交替進樣分析5次，考察標準曲線高濃度點進樣后有無殘留。

1.7 臨床中毒樣品檢測

臨床中毒樣品來自北京市某醫院急診科。2020年10月收治1例中青年男性患者，無其他軀體疾病，因誤信蓖麻具有保健功效，口服3～4粒蓖麻籽4 h后出現惡心、嘔吐等癥狀。采集中毒后4和14 h血液樣品2份和14 h尿液樣品1份。

血漿樣品參照1.5處理，尿液樣品用1倍體積甲醇溶液稀釋后14 000×g離心10 min，上清液轉移至進樣瓶中進行半定量分析。同時，分別配制濃度均為100 μg·L-1蓖麻堿的人空白血漿加標樣品和尿液加標樣品，同樣處理后檢測，采用單點外標法進行半定量測定。

2 結果

2.1 蓖麻籽中蓖麻堿的含量

6個產地14份蓖麻籽中的蓖麻堿含量測定結果見（表1）。其中以編號9的新疆產蓖麻籽中蓖麻堿含量最高，為1.60 g·kg-1；內蒙古通遼產蓖麻籽（T19）中蓖麻堿含量最低，為0.95 g·kg-1。14份蓖麻籽中蓖麻堿含量均值為（1.19±0.22）g·kg-1（百分含量約為0.12%），與文獻報道基本一致［12］。選取含量較接近中位值的內蒙T11號蓖麻籽ig給予大鼠進行毒動學研究。

Tab.1 Content of ricinine in castor beans from different origins

2.2 SD大鼠血漿中蓖麻堿濃度定量檢測方法學驗證

0.1%甲酸水溶液和乙腈作為流動相時，可在5 min梯度下使待測物蓖麻堿和內標東莨菪堿較好分離；同時色譜柱選用反相醚聯苯基固定相，可有效改善傳統C18色譜柱在分析生物堿類化合物時的色譜峰拖尾現象［13-14］，蓖麻堿和東莨菪堿的保留時間分別為2.67和2.85 min（圖1）。

Fig.1 Extracted ion chromatograms of different ricinine samples.A：matrix blank；B and C：plasma samples spiked with ricinine at 1.0（B）and 1000 μg·L-1（C）；D：a plasma sample from rats after ig administration of caster bean homogenate.

大鼠血漿中蓖麻堿在1～1000 μg·L-1范圍內線性關系良好，線性回歸方程為y=0.0082x+0.0253（R2=0.9644），最低定量限為1.0 μg·L-1（S/N＞10），最低檢出限為0.5 μg·L-1（S/N≥5），其血漿樣品的批內和批間精密度均≤15%，批內和批間準確度在88.1%～100.8%，基質效應為 4.8%～8.9%（RSD≤1.9%），方法回收率在77%～81%（RSD≤13%），且在高濃度質控樣品（750 μg·L-1）進樣后無殘留，均能滿足生物樣品分析的要求（表2）。

Tab.2 Precision and accurcy of the LC-MS/MS method for ricinine determination in rat plasma

Fig.2 Plasma concentration-time curve of ricinine after ig administration of castor bean homogenate in SD rats determined by LC-MS/MS.The dose of caster bean homogenate（equivalent content of ricinine）was 0.3，1.0 and 3.0 g·kg-1，separately.±s，n=5.

2.3 蓖麻籽染毒大鼠血漿中蓖麻堿毒動學參數

經蓖麻籽勻漿液ig染毒，SD大鼠血漿蓖麻堿的平均血漿濃度-時間曲線見圖3。0.3 mg·kg-1染毒組樣品的蓖麻堿檢出時間窗為12 h，而1.0和3.0 mg·kg-1組24 h樣品中仍可檢測到高于定量限的蓖麻堿。毒動學參數見表4，結果表明，3個染毒劑量組均呈現單峰，且達峰濃度（Cmax）和曲線下面積（AUC）均隨劑量增加而增加；染毒后0.7～0.8 h達到最大血漿暴露濃度，之后快速下降，消除半衰期（T1/2）為2.2～2.5 h。0.3和1.0 mg·kg-1組平均駐留時間非常接近，為4.1和4.5 h，而3.0 mg·kg-1組平均駐留時間較長，為8.2 h。

Tab.4 Toxicokinetic parameters of ricinine in rat plasma determined by LS-MS/MS method

2.4 臨床中毒樣品檢測結果分析

結果顯示，臨床中毒后4和14 h血漿樣品中蓖麻堿的濃度分別為25.5和22.2 μg·L-1，中毒后14 h尿樣中蓖麻堿的濃度為92.2 μg·L-1。

3 討論

本研究建立了以東莨菪堿為內標的SD大鼠血漿中蓖麻堿的LC-MS/MS定量分析方法，該法操作簡便，具有較高專屬性和靈敏度，可滿足本實驗低濃度分析物測定的需要。采用蓖麻籽勻漿液ig給予大鼠，進行了蓖麻堿毒代動力學研究，其體內有效暴露量和中毒劑量呈正相關，檢測時間窗寬，適于生物醫學樣品檢測，但其在體內消除也較快。值得注意的是，3.0 mg·kg-1染毒組的平均駐留時間約是其他組的2倍，同時在24 h出現了一個明顯的上升趨勢，推測中毒蓖麻堿在體內可能存在二次釋放效應，但需要進一步研究。

本研究也對臨床中毒樣本進行了檢測，結合已報道的臨床中毒數據來看，蓖麻中毒途徑包括口服、注射等，檢材涵蓋血液、尿液、嘔吐液以及尸檢的組織樣本，其中蓖麻堿的檢出量范圍差別較大，從μg·L-1到mg·L-1濃度水平；檢出時間窗從中毒后4到38 h不等；與個體差異、中毒方式與蓖麻中蓖麻堿含量不同等密切相關。如2019年比利時1名26歲男性靜脈注射蓖麻籽粗提物自殺［8］，送醫后醫治無效死亡，其6 h血樣和7 h尿樣中的蓖麻堿濃度分別為16.5和79.6 μg·L-1。美國疾病控制預防中心也曾報道1例口服6粒蓖麻籽自殺未遂事例［15］，該患者為58歲美國男性，將蓖麻籽咀嚼吞咽，其14 h尿樣中檢出了高達1400 μg·L-1的蓖麻堿。

綜上，本研究建立了蓖麻堿LC-MS/MS定量方法并應用于SD大鼠血漿中蓖麻堿的快速、靈敏、準確測定及毒代動力學曲線繪制。毒代動力學研究結果闡明了蓖麻堿體內代謝行為、中毒檢測時間窗和體內駐留時間等。對臨床中毒血、尿樣本的初步研究結果表明，蓖麻堿可作為蓖麻籽中毒診斷的標志物，且可在此工作基礎上建立基于人血漿和尿液基質樣品的準確定量方法，為蓖麻中毒的臨床診斷確證和預后評估提供重要數據。